文摘

越来越多的证据表明,相关机制的引入和修复DNA双链断裂(双边带)可能与长期记忆(LTM)过程。此前的研究表明从我们组因素已知函数在DNA重组/修理机械,如DNA连接酶、聚合酶、内切酶和DNA,在中心发挥作用。在这里,我们报告数据使用C57BL / 6小鼠显示V (D) J recombination-activating基因1(RAG1),它编码一个因素,介绍了双边带在免疫球蛋白和t细胞受体基因,诱导在杏仁核,但不是在海马体,上下文恐惧条件反射。Amygdalar感应的RAG1信使rna,通过测量实时PCR,没有观察到在context-only或shock-only控制,表明上下文恐惧条件反射响应与联想学习过程。此外,双重免疫荧光研究证明了神经元的本地化RAG1蛋白质在灌注后amygdalar部分准备和固定。在功能的研究中,intra-amygdalar注射RAG1gapmer反义寡核苷酸,1 h条件之前,导致amygdalar击倒RAG1信使rna和显著障碍LTM、测试24小时后培训。总的来说,这些发现表明,V (D) J recombination-activating基因1,RAG1可能在LTM整合中发挥作用。

1。介绍

研究表明,LTM整合依赖于形态建立,维护,和重排特定的神经网络,其中包括加强突触或形成新的连接在特定大脑区域参与学习和记忆(1- - - - - -4]。同时重要的是,与形态学改变突触连接的,瞬态感应所需的新基因转录和蛋白质合成LTM形成(5- - - - - -7]。事实上,它已经表明,药理的封锁转录或翻译,以及有针对性的突变转录和翻译的因素,抑制LTM整合(8- - - - - -11]。

一个限制与当前模型用来解释LTM整合是在细胞水平上突触连接和电模式是高度动态的和不稳定的,而记忆可以持续好几个月,几年,甚至几十年。同样,在分子水平上,信使rna和蛋白质进行分子营业额。有人认为,表观遗传调制可以解释记忆的永恒12- - - - - -15];然而,组蛋白修饰是高度动态的和可逆的16,17]。此外,快速的周转率转录活性染色质是所有nonproliferating细胞的共同特征,包括神经元(18- - - - - -20.]。同样,DNA甲基化和脱甲基作用是动态的和可逆的甚至在:细胞,如神经细胞(17,21]。海马以下学习快速DNA甲基化变化,但这些变化是塑料的,不是永久的(14,22]。此外,表观遗传机制,化学修改组蛋白或转录调节基因组DNA。因此,表观遗传机制很可能函数通过暂时记忆和可塑性过程中调节转录。

为了评估这些问题,我们小组,以及其他人,已经实施替代研究以评估其他潜在的可能的作用机制,也可以与中心思想整合。具体来说,我们最初假定参与DNA重组/修复机制可能导致LTM过程(23]。在免疫系统中,DNA基因片段的重组是一个控制过程涉及到DNA内切酶的激活,进而生成DNA双边带,以及激活DNA连接酶和DNA修复因素重新加入新的基因片段24- - - - - -26]。有趣的是,最近的一项研究报告说,当老鼠探索小说环境中,DNA双边带积累了整个大脑,尤其是在海马体,参与学习和记忆的区域(27]。此外,这些DNA双边带24小时内修复,这表明生理机械的介绍和修复DNA损伤可能与学习和记忆有关的过程。此外,后来的研究报道,介绍了DNA双边带立即早期基因的启动子的一个子集包括安全系数、Npas4,和Egr1神经元活动,突触可塑性的过程,和学习28]。符合这些发现,我们之前报道Fen-1核酸内切酶(29日),末端转移酶(TdT) template-independent DNA聚合酶参与V (D) J重组(30.),DNA连接酶(31日,32),和异源端加入(NHEJ)活动32,33]DNA重组/修复因素或机械规定和/或所需的学习和记忆过程。

在这里,我们报告的V (D) J recombination-activating基因1(RAG1),这是启动V (D) J重组的关键淋巴细胞(34- - - - - -37),是由环境因素调节恐惧条件反射年轻成年小鼠,其amygdalar需要表达中心思想。定量实时PCR表明RAG1信使rna诱导的杏仁核,但不是在海马体中,调节。这种感应与联想学习,而不是上下文相关的非结合行为经历恐惧条件反射,确定与天真,context-only, shock-only控制。额外的控制实验证实了序列之间的身份amygdalar和胸腺RAG1PCR产品,均显示100%匹配亩骶RAG1在爆炸分析。此外,双重免疫荧光研究表明RAG1 amygdalar神经元内蛋白表达。的功能相关性RAG1检查使用gapmer反义,而随机寡核苷酸直接注入到杏仁核前立即或5 h后调节。Pretraining注入导致amygdalar击倒RAG1LTM mRNA和一个重要障碍,而posttraining注入不影响中心思想。在一起,这些发现表明,RAG1在中心整合过程中发挥作用。

2。材料和方法

制度动物保健和使用委员会(IACUC)里约热内卢毛孢子菌病波多黎各大学的校园符合国家卫生研究院(NIH)实验动物保健和使用指南(卫生和人类服务部NIH出版物编号86 - 23)批准程序包括所有动物。

2.1。上下文恐惧条件反射

2.1.1。装置

我们的空调室(30×20×18厘米)是由双方的透明有机玻璃和不锈钢在另两个方面。每个钢边有一个扬声器和一个24 V。室有一个36-bar-insulated冲击网格地板由不锈钢棒(Coulbourn仪器,阿伦敦,PA)。系统包括一个白噪音发生器提供背景噪音(70分贝)。地板是可拆卸,清洗后用70%的乙醇每个主题培训,表现为,或测试。每个酒吧(直径1.5厘米)震动连接通过利用可编程大师(82404 ss模型;Coulbourn乐器),交付炒脚冲击网格中的每个酒吧的地板上。迷你相机(无声见证企业,萨里,不列颠哥伦比亚,加拿大)后面安装一个空调室的树脂玻璃的双方通过处理器的计算机系统连接视频记录和评分的冻结使用Xpress SDK软件,这是一个掌握小波视频压缩/解压和PCI总线采集卡(积分技术,印第安纳波利斯)。

2.1.2。课程和培训

上下文条件基本上是如前所述[11,32,38]。雄性C57BL / 6小鼠的8 - 10周的年龄从哈伦的雄性sd,中印第安纳波利斯,,。有食物和水,和动物保持在12 h光/暗周期。在上下文的恐惧条件反射,动物被放置在空调室(条件刺激,CS),允许勘探2分钟(习惯)。动物然后收到三脚冲击0.75 mA 2 s(非条件刺激,美国)交货2,3,4分钟。老鼠仍在30年代室后休克,然后立即搬到家里的笼子里。

2.2。RNA提取、量化和质量评估

15分钟一次训练,动物被斩首,调节后30分钟,或1 h。一些动物也被用作天真,15分钟context-only(有限公司)和15分钟shock-only(所以)控制。公司老鼠暴露在空调环境4 m没有收到任何冲击,所以老鼠收到了快速冲击,并立即从空调室中删除。从空调室去除后,这两个公司,所以老鼠回到homecages和牺牲15分钟结束后他们暴露在空调室。大脑被迅速获得,冷冻在冰冷的磷酸缓冲盐(PBS),然后转移到一个老鼠大脑矩阵获得双边amygdalar组织拳和背侧海马的解剖,同时−−0.82和2.70毫米之间前囱点,基于鼠标脑立体定位坐标,第三版(39]。所有组织都保存在RNA晚些时候(Ambion猫。7020号)解决方案在干冰和后存储在−86°C到RNA提取。从个人背侧海马提取的RNA是使用试剂盒RNeasy迷你包(猫。74104号),而双边amygdalar拳是RNA提取使用试剂盒RNeasy微工具包(猫。74004号)。使用DNase提取物治疗(试剂盒,79254)和设备的协议。RNA样本量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计和质量评估使用安捷伦2100生物分析仪系统。

2.3。定量实时聚合酶链反应

2.3.1。实时PCR引物设计

互补脱氧核糖核酸序列从亩骶基因分析(RAG1,加入NM_009019.2数量;和甘油醛3磷酸脱氢酶(gapdh),加入NM_008084.2]数量从基因库中获得。我们使用了集成PrimerQuest DNA技术和低聚糖分析仪生物信息学工具来设计特定的引物也适合实时PCR和避免可能的发夹,自我/为,和异性恋/ cross-dimers。爆炸(基本局部比对搜索工具)搜索了所有的引物,以确保他们不可能退火到其他目标。以下使用正向和反向引物:RAG1甘氨胆酸,向前,5′TGA GCA CAG AGC TGA TGA-3′RAG1相反,5′ttg ACA CGG ATG GCC亚美大陆煤层气有限公司CAA-3′;为gapdh向前5′acc CAG亚美大陆煤层气有限公司行为GTG手枪GG′3和gapdh反向5′aca猫TGG GGC标签棉酚CA-3′。所有引物被集成的DNA合成技术。

2.3.2。互补脱氧核糖核酸合成和定量实时PCR

短暂,互补脱氧核糖核酸合成使用TaqMan逆转录(RT)试剂工具包(N8080234,应用生物系统公司/罗氏)。250 ng的RNA, 2.5μ6.0 L (RTBuffer(10倍)μL MgCl₂5.0(25毫米)μL核苷酸(10毫米,2.5毫米,每个核苷酸),2.0μL OligodT (50μ0.5米),μL核糖核酸酶抑制剂(20 U /μL)和3.0μRT酶(50 L U /μ25 L)的总量μL。热循环条件如下:25°C 10分钟,30分钟48°C, 95°C 5分钟,4°C,直到永远。实时PCR进行使用QuantiTect SYBR绿色PCR大师混合工具包(试剂盒,204163)。实时PCR扩增条件优化为每个基因,我们获得以下主混合条件下最好的结果:管家控制基因gapdh我们使用12.5μL SYBR绿色混合大师,2.5μ每个引物(5 Lμ米),2μ互补脱氧核糖核酸在25 Lμ我的反应。为RAG1中,我们使用12.5μL SYBR绿色混合大师,3.5μ每个引物(5 Lμ1.5米),μL (MgCl₂(25毫米),2μ互补脱氧核糖核酸在25 Lμ我的反应。实时PCR扩增运行每个基因/一式三份样品在热循环(Bio-Rad C1000触摸CFX96实时PCR系统)。放大条件优化的两个基因在95°C 15分钟(热)开始,紧随其后的是40周期为15秒95°C, 30年代58°C, 72°C 30年代。最后,融化/峰值曲线分析了从55°C到95°C在增加温度0.5度。

2.3.3。实时聚合酶链反应分析

我们使用了比较阈值周期(δCt)相对量化的方法来计算基因表达水平(40]。三角洲Ct方法包括比较感兴趣的基因的Ct值和一个参考或管家基因:Ct =−Ct参考Ct目标基因()。在这种情况下,Ct值RAG1引物的扩增产物中减去的Ctgapdh引物的扩增产物()。首先,Ct-average每个每个样本基因PCR扩增的一式三份。重要的是,我们的分析只使用样本显示一式三份结果重现性高,也就是说,这些显示Ct的一式三份差异不超过0.05%。在一个特定的实时PCR实验样本导致低再现性,这种特定的实验重复或在某些情况下丢弃,总是确保最终的分析可以由每个样本一式三份反应的结果。随着Ct的对数成正比初始样本数量的目标,一个目标的相对浓度上下文恐惧conditioning-trained关于参考(天真)是反映在不同周期数(Ct)必须达到同样水平的荧光。然后三角洲Ct数据规范化。

2.4。放大和分子克隆RAG1PCR产品

我们放大RAG1信使rna片段约48 bp(此句来自上述实时PCR实验)从amygdalar,海马,胸腺组织,还克隆产生的PCR产物进行序列分析。短暂,RNA提取和纯化(如上所述),互补脱氧核糖核酸合成使用TaqMan逆转录试剂工具包(N8080234,应用生物系统公司/罗氏)。从每个样本500 ng的RNA与2.5和混合使用μL (RT缓冲区(10倍),4.5μL MgCl₂4.0(25毫米)μL核苷酸(10毫米,2.5毫米每个核苷酸),2.0μL OligodT (50μ0.5米),μL核糖核酸酶抑制剂(20 U /μL)和3.0μL RT酶(50的U /μ25 L)的总量μl .互补脱氧核糖核酸合成进行了热循环(GeneAmp PCR系统9700,应用生物系统公司)在下列条件:25°C 10分钟,30分钟48°C, 95°C 5分钟,4°C,直到永远。PCR进行混合使用PCR大师(2 x)(2×50反应)工具包(Promega M7502)。PCR扩增条件下进行以下主混合条件:12.5μ3.5 L的主结构,μ每个引物(5 LμM,相同的引物用于实时PCR实验),1.5μL (MgCl₂(25毫米),2μ互补脱氧核糖核酸在25 Lμ我的反应。放大由最初的变性在95°C 30年代,紧随其后的是40周期为15秒95°C, 58°C 30年代,30年代和72°C,最终在72°C扩展7分钟4°C永远紧随其后。PCR扩增被琼脂糖凝胶电泳(1%)评估TAE1X和溴化乙锭染色。PCR产品从使用QIAquick凝胶的凝胶萃取提纯设备(50),按照设备方案手册(试剂盒,28704)。纯化PCR克隆使用pGEM-T简单向量系统产品(Promega A1360)。DNA结扎和质粒转染进行推荐设备的协议。质粒转染我们使用大肠杆菌(从英杰公司,18258 - 012)马克斯DH5效率α主管细胞。细胞被镀上磅/氨苄青霉素琼脂培养基包含IPTG和半乳糖苷。

2.5。质粒DNA测序的提取和纯化

Minipreps测序进行使用修改的标准方法(41]。简单地说,一个白色菌落转移到3毫升含有氨苄青霉素的了不起的肉汤培养基在松散上限15毫升管。细胞培养在一夜之间在37°C和剧烈的震动。收获和提取进行了显示在标准方法(41),但我们也额外的连续净化步骤,包括核糖核酸酶治疗、核酸外切酶消化和蛋白酶K孵化。过两个氯仿提取物和异丙醇降雨后,球被风干,溶解在50μL H₂啊,和混合12μL氯化钠4 M和60μL新鲜的聚乙二醇(PEG 8000 13%)。混合物是孵化冰30 - 60分钟和15分钟离心机和颗粒与70%乙醇冲洗。最后,球团干燥和溶解在50μL H₂o .样本保存在−20°C到使用。测序反应进行使用BigDye终结者化学v。3在ABI 3130 xl基因分析仪。DNA序列分析了爆炸对老鼠基因组(RefSeq RNA)并使用ClustalW2对齐。

2.6。组织学:脑灌注和组织准备

一小时上下文恐惧条件反射后,动物受到了致命剂量的三溴乙醇,并立即紧随其后transcardial温柔灌注与PBS缓冲5分钟。之后,我们转向固定缓冲区(4%多聚甲醛,pH值7.4)5分钟。大脑被提取,在4%多聚甲醛溶液固定24小时,后来cryoprotected一夜之间在30%蔗糖溶液,最后冻结在−86°C存储直到将来使用。冷冻的大脑被用来收集20μ米厚的日冕部分选择具体含杏仁核区域之间−−1.06和2.30毫米前囱点,基于鼠标脑立体定位坐标,第三版(39]。收集到的部分被放置在带正电的幻灯片(头+幻灯片,费舍尔,公关)和保持在−86°C到用于免疫荧光。

2.7。免疫荧光

检查RAG1蛋白质表达的细胞定位,幻灯片在rt枯竭了30分钟。使用一个热块组在200°C,一个包含缓冲区(800毫升ddH的锥形杯₂啊,4毫升1 M三pH值8和1.6毫升0.5 EDTA)被加热直到沸腾。一旦缓冲泡沫缓慢移动,幻灯片使用slide-rack慢慢沉浸到缓冲区。烧杯立即被保鲜膜覆盖包含洞穿孔移液管的小费和被允许坐了20分钟。然后将包含幻灯片的烧杯转移到冰浴,允许在一个寒冷的房间冷却30分钟(4°C)。幻灯片和PAP-Pen部分干和边界。然后,250年μL屏蔽解决方案(BS) (1 x PBS,正常山羊血清,10%和0.1% Tween-20)每张幻灯片添加和孵化1 h rt执行双重免疫荧光,孵化的部分主要对人类RAG1兔多克隆抗体(Sigma-Aldrich: SAB2106610)稀释1:100年1%的山羊血清/ PBS一起主要anti-NeuN鼠单克隆抗体(微孔,MAB377)稀释1:100。孵化与主要抗体是一蹴而就在潮湿的室4°C。幻灯片与PBS洗3次为5分钟。幻灯片是在黑暗中培养2 h rt湿室与Alexa萤石488 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(英杰公司)(用于检测RAG1)和Alexa萤石568 -共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(英杰公司)(NeuN检测),同时稀释1:200年1%的山羊血清/ PBS,紧随其后的是3 PBS洗5分钟。幻灯片安装使用永久安装介质(向量实验室)。所有幻灯片都是第一次扫描低倍镜下定位杏仁核(10倍),随后分析在高放大(40 x)使用蔡司LSM-5帕斯卡扫描共焦显微镜。最终的图像创建复合材料使用蔡司LSM5帕斯卡图像软件,版本3.2。

2.8。蛋白质的提取

老鼠斩首1 h训练后,他们的大脑被获得,在冰冷的PBS冷冻,并用于解剖杏仁核如前所说,前囱−−0.82和2.7毫米之间的点,根据鼠标脑立体定位坐标(39]。双边amygdalar组织拳从三个动物组合收益率每组一个池示例。胸腺、骨髓和肌肉组织也切割控制。组织存储在−86°C到用于蛋白质提取。蛋白质提取准备如我们之前所述29日,31日- - - - - -33]。简单,组织均质使用声波dismembrator提取缓冲(30 mM玫瑰/ KOH, pH值7.9,0.5 M氯化钾,MgCl 5毫米₂,EDTA 1毫米,2毫米二硫苏糖醇(德勤),20%的甘油,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF),和1μ克/毫升每个亮抑酶肽和抑肽酶)和孵化1 h在冰上。提取物在14000转离心1 h在4°C。上层清液然后透析4 h在透析缓冲区(30毫米玫瑰/ KOH, pH值7.9,50 mM氯化钾,2毫米EDTA, MgCl 5毫米₂1毫米的德勤,10%的甘油,1毫米PMSF和1μg / mL的亮抑酶肽和抑肽酶)。透析分数在14000 rpm离心机在4°C 30分钟。蛋白质提取存储在−86°C到用于西方的屁股。蛋白质浓度测定在NanoDrop nd - 1000分光光度计。

2.9。西方墨点法

为西方墨点法、蛋白质样品(50μg)和4μL(《奥德赛》Prestained分子量标记(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学)首次分离8%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。分离蛋白在凝胶转移到硝酸纤维素用半干的electroblotter系统15 V 1 h和30分钟。然后,膜被封锁在一夜之间使用5%脱脂牛奶的混合物和奥德赛阻断缓冲区(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学)在一个轨道振动器。3洗后的15分钟每个PBS Tween-20 (PBS-T),膜被孵化的两个主要抗体:1:2000稀释的兔多克隆抗体提出反对合成nonphosphopeptide源自人类RAG1 (Sigma-Aldrich: SAB2106610)和1:3000稀释鼠标单克隆抗体(Sigma-Aldrich: A4700) anti-actin一夜之间在4°C。与PBS-T 3洗15分钟后,膜被孵化的两种二次荧光抗体(1:10000稀释的驴anti-rabbit IRDye680和1:12000稀释的驴anti-mouse IRDye800)(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学)为2 h rt膜洗3次正如前面提到的,使用《奥德赛》扫描分析红外成像系统。

2.10。反义击倒的实验

2.10.1。RAG1反义寡核苷酸基因击倒

Gapmer反义寡核苷酸的设计目标起始密码子的老鼠RAG1信使rna。这个20 bp gapmer包含一个中心块组成的十phosphorothioate-deoxynucleotides,足以引起RNaseH解理(从而靶向RNA: DNA混合降解),两侧是两个街区,每个组成的五2′-O-methyl-modified核苷酸,保护内部phosphorothioate-deoxynucleotide块从核酸酶降解,从而增加稳定性。控制,随机序列也是相同的设计修改和碱基组成的支柱RAG1反义,但炒序列顺序,没有任何已知的老鼠基因同源性。RAG1反义和随机寡核苷酸序列,分别如下:5′-mGmCmC mAmC mAmCmA mUmA-3′, 5′-mCmAmG mAmU mCmAmA mCmA-3′(“m”代表2′-O甲基RNA和““代表phosphorothioate DNA)。反义和随机序列被集成的DNA合成技术。所有批次的反义和随机寡核苷酸收到用于完成这些研究冻干,完全由核糖核酸酶纯化免费高效液相色谱法。寡核苷酸溶解在无菌1 x TE缓冲pH值7.5最终浓度为0.2 nmol /解决方案μl

2.10.2。手术

几个手术来确定适当的坐标进行插管注入到杏仁核,基于鼠标脑立体定位坐标(39]。手术,动物麻醉与三溴乙醇和置于一个立体定位器(大卫·科夫仪器),用鼻子在0°的角度。头皮切口后,λ和前囱,和孔钻在上面的头骨中目标区域。双边插管(23仪表)指南(6.8毫米宽)是植入在杏仁核,以避免破坏杏仁核组织复杂的插管和喷油器,同时确保amygdala-enriched分布。使用下面的坐标:前后,前囱+ 1.0毫米;从中线medial-lateral,−3.4毫米;背腹侧的,从头骨−2.5毫米。套管是固定在不锈钢螺丝牙科水泥和light-curable树脂。线雌雄同体(33个指标)插入套管指南和每天进行检查,以确保清洁和功能性插管。

2.10.3。Intra-Amygdalar寡核苷酸Microinfusions、行为训练、和记忆测试

手术后,动物被给予为期两天的时间才能恢复。在3天之后,动物被处理,3分钟。第四天,动物是双边microinfused 1μL 1 x的TE缓冲pH值7.5 0.5(2分钟μL / min),作为处理/压力控制,然后我们进行常规3分钟手工处理。Microinfusions被33-gauge不锈钢注射器插入完成引导插管,让它长1毫米除了导游的小费,正上方目标amygdalar复杂(见上图)。喷油器的功能验证了之前所有microinfusion动物之间并在必要时更换。输液后,注射器被移除,雌雄同体所取代。第五天,动物是双边microinfused 0.5(2分钟μL和0.2 nmol /分钟)RAG1反义或随机序列的寡核苷酸,处理3分钟,回到家中的笼子里。microinfusions一小时后,动物被训练在上下文恐惧条件反射和视频记录如上所述。一天(24小时)训练后小鼠重新引入到相同的条件背景LTM测试通过测量冻结在录像4米,但他们没有收到冲击。posttraining注入研究一组不同的动物被当作上面除了反义或随机寡核苷酸治疗了5 h后上下文恐惧条件反射而不是1 h前培训。重新整合研究,另一组老鼠受到手术管子和接收处理如上所述,但是在第五天,老鼠microinfused盐水(压力控制)和训练环境恐惧条件反射1 h后。接下来,24小时空调后,动物microinfused随机或反义寡核苷酸1 h reexposure之前的空调室和视频记录为90年代记忆检索不接收任何冲击。最后,48 h后调节(上下文reexposure)后24 h,老鼠又表现为2分钟测量冷冻空调室的中心思想的重新整合测试。

2.10.4。扩散的研究

插管注入后,注射器插入和动物()被注入了FITC -RAG1反义寡核苷酸的面积来估算反义杏仁核内扩散。注入1μL (FITC -RAG1反义寡核苷酸(0.2 nmol)是双边的杏仁核的速度在2分钟内0.5μL / min。动物被斩首3 h注入后,他们的大脑被孤立和储存在−86°C。日冕amygdalar部分,20μ米厚,进行扫描低倍镜下定位杏仁核(10倍),随后分析在高放大(20和40 x)使用蔡司LSM-5帕斯卡扫描共焦显微镜。图像处理使用蔡司LSM5帕斯卡图像软件,版本3.2。

2.11。统计分析

所有与棱镜4统计分析软件(GraphPad软件)。统计学意义是假定。实时PCR实验RAG1mRNA水平分析了单向方差分析和Newman-Keuls后续测试比较RAG1信使rna表达行为组之间。实时PCR实验的灌注和nonperfused老鼠RAG1使用学生的水平进行了分析以及。可拆卸的验证RAG1杏仁核中的反义mRNA水平相比,随机被学生的分析以及。内存收购行为数据受到双向重复措施(RM)方差分析和Bonferroni期末测验。中心思想行为分析学生的测试分析以及。记忆检索和重新整合测试分析了双向方差分析耦合Bonferroni期末测验。

3所示。结果

3.1。上下文恐惧条件反射学习特别是诱发RAG1杏仁核的信使rna表达

DNA重组/修复过程包括内切酶的激活以及DNA连接酶和聚合酶,以及其他因素。我们目前的研究关注RAG1,专业重组酶的基因编码V (D) J重组,提升者V (D) J重组代替其特有的酶的活动,目标高度特定的复合信号序列(rss)引入DNA双边带抗原受体基因(34,36,37,42),我们发现在一个初步DNA微阵列屏幕作为一个潜在的候选基因参与上下文恐惧条件反射。最初的实验报告,我们训练有素的C57BL / 6雄性老鼠在上下文中恐惧条件反射,牺牲在15日30或60分钟训练后,背侧海马和amygdalar组织获得。我们使用定量实时PCR扩增的片段RAG1信使rna和确定这种基因的表达是否调制杏仁核和海马与上下文恐惧条件反射学习。这些实验的结果如图所示1。见图1(一),当检测海马RAG1天真的之间的信使rna没有观察到显著差异(天真,)和条件(C)团体牺牲15 ()、30日(),或60 ()分钟训练后(单向方差分析:,)。结果表明,海马的基础水平RAG1信使rna训练后不会发生重大变化。与海马体与我们的研究结果,我们发现环境恐惧条件反射训练结果显著,迅速和瞬态感应RAG1amygdalar mRNA水平(图1 (b):单向方差分析,,;多重比较测试:天真和C15最小,;天真和C30最小,;天真与C60的最小值,;C60 min和C30最小值,;和C60分钟对C15最小值,)。整体而言,这些结果表明,RAG1信使rna诱导迅速,即使是暂时性的上下文在杏仁核恐惧条件反射训练之后,但不是海马体,年轻的成人C57BL / 6小鼠。为我们下一组实验中,我们旨在确定amygdalar感应特定关联上下文恐惧条件反射,使用非联合型context-only(有限公司)和shock-only(所以,)控制,条件刺激(CS)(对于公司控制)或无条件刺激(美国)(控制)单独提出,而不是配对。我们从C(牺牲动物)、公司或团体15分钟后各自关联或非联合型培训。大脑被获得,拳amygdalar组织解剖,RNA提取。天真的动物控制也被天真,)。结果中可以看到图中的条形图1 (c)。结果再次证实了感应amygdalar的15分钟RAG1信使rna在上下文恐惧条件反射而天真,CO,左右控制和显示这些控件之间没有统计学显著差异(单向方差分析,,;多重比较测试:天真和C15最小,;SO15敏对C15最小,;CO15敏对C15最小,;SO15 min和天真,;SO15 min和CO15最小,;CO15 min和天真,)。最后,由于提出了到目前为止的结果获得组织样本来自nonperfused大脑,我们进行了一个额外的控制实验,以确定是否观察到的变化RAG1信使rna水平可以归因于大脑中的血液细胞的存在与否,因为血液中免疫细胞是一个已知的生物的RAG1表达式[43,44]。我们训练有素的两组老鼠在上下文恐惧条件反射和牺牲动物的两组训练后30分钟,amygdalar时间对应于峰值RAG1信使rna诱导训练后(见图1 (b))。一组动物的大脑得到如上所述。第二组的动物,老鼠注射致命剂量的三溴乙醇25分钟培训和灌注3分钟后PBS-1X为了把血液从他们的大脑。两组动物大脑提取和amygdalar组织(nonperfused;灌注)解剖。Amygdalar组织被用于进一步的RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,实时定量PCR分析RAG1信使rna。结果显示amygdalar的水平之间没有显著差异RAG1信使rna上下文恐惧条件反射训练后30分钟nonperfused灌注(1.304±0.3377)或(1.274±0.2751)小鼠(学生的以及;;),排除这样一种可能性,即观察诱导RAG1信使rna(见图1 (b))可能是由于残留血液,因此血液细胞,研究大脑组织。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图1

环境条件的诱导upregulation恐惧RAG1信使rna在杏仁核。RAG1mRNA水平测定海马和杏仁核在时间进程上15分钟,30分钟,1 h后调节。(一)规范化信使rna研究海马时数据显示无显著差异RAG1mRNA天真(N)或条件(C)组牺牲在15日30或60分钟后培训。(b)相反,上下文恐惧条件反射导致一个重要的,快速,瞬态感应RAG1杏仁核的mRNA水平(天真的对C15最小值,;天真和C30最小,;天真与C60的最小值,;C60 min和C30最小值,;和C60分钟对C15最小值,)。(c)我们牺牲动物的条件(c)、公司或团体各自的联想或非联合型培训后15分钟。规范化的表情证实了重要的感应amygdalar的15分钟RAG1mRNA在上下文恐惧条件反射而天真,有限公司,所以团体和天真,没有统计学差异,左右控制(SO15敏对C15最小,;SO15 min和天真,;SO15 min和CO15最小,;CO15敏对C15最小,;CO15 min和天真,;天真和C15分钟)。

3.2。序列分析PCR产物扩增的海马,杏仁核和胸腺

我们接下来着手确认序列的身份从amygdalar PCR产品和海马组织放大用的引物设计的目标RAG1信使rna在我们上面提到的实验。除了amygdalar和海马RNA样本,我们还利用胸腺RNA,因为这个组织是生理上表达RAG1由于其在免疫系统中的作用[45- - - - - -48]。补充图1 a和B(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1752176)描述代表放大曲线的结果,以及我们融化曲线分析,分别RAG1和gapdh信使rna。的放大和熔化温度曲线的结果RAG1和gapdh描述显示循环阈值(Ct)的特异性基因和放大产品,分别。重要的是,融化曲线分析的结果一致表明,生成每个primer-gene组只有一个特定的产品。的RAG1放大放大的产品标准PCR也用琼脂糖凝胶电泳(补充图1 c)。这些PCR产物的克隆和测序放大从杏仁核,海马,胸腺证实了他们的身份RAG1(补充图2 d-f)或gapdh(数据没有显示)。测序的重复RAG1PCR产品补充图2 d所示。PCR片段序列从杏仁核、海马和胸腺对齐使用ClustalW2(补充图2 e)和比较亩骶RAG1参考序列NM_009019.2(补充图2 f)。爆炸分析证实了分子的身份RAG1PCR产品从杏仁核、海马和胸腺显示匹配身份的100%亩骶RAG1(参考NM_009019.2)在爆炸老鼠基因组分析的值2 e−19。

3.3。RAG1 Amygdalar神经元细胞内蛋白质是本地化

RAG1是关键的V (D) J重组酶免疫细胞介绍,加上RAG2,双边带抗原受体基因在rss (34,36,37,42]。以前的报告还表明记录编码RAG1表达在神经细胞(34- - - - - -37,49]。因此我们认为很重要决定RAG1蛋白表达是本地化amygdalar神经元。RAG1的双重免疫荧光抗体与神经核标记,NeuN,进行脑灌注日冕部分从动物1 h后上下文恐惧条件反射。代表图像得到的共焦显微镜检查amygdalar部分的大脑区域与RAG1 double-labeled (Alexa萤石488;绿色信号)和NeuN (Alexa萤石568;红色信号)在图所示2(一个)。这些发现表明,RAG1似乎主要表达在神经元,所显示colocalization RAG1和NeuN之间。同样重要的是,虽然所有RAG1阳性细胞神经元,并不是所有的神经元显示RAG1反应,表明只有一个子集的RAG1细胞表达。证实了RAG1的分子特异性抗体免疫印迹分析(图2 (b))。组织拳从杏仁核后得到1 h上下文恐惧条件反射。此外,引用从胸腺和骨髓组织,已知表达高水平的RAG1 [45- - - - - -48),和肌肉解剖(负控制)。所有组织受到蛋白质提取物对免疫印迹分析。RAG1蛋白表达从扁桃体被comigration相比骨髓和标准分子量(MW)梯子(图2 (b)面板1),胸腺(图2 (b)分别,面板2)提取。两组实验证实comigration一群大约120 KD对应RAG1蛋白质。相比之下,amygdalar蛋白质提取与肌肉提取物(图2 (b)小组3)显示,没有comigration乐队指示,如预期,RAG1专门在杏仁核(图表示2 (b)面板1),以及骨髓(图2 (b),面板和胸腺(图1)2 (b)面板2),但不是在肌肉组织(图2 (b)小组3)。此外,RAG1抗体preabsorption化验与骨髓或肌肉蛋白质提取,这显示检测或检测不到RAG1表达式,分别(见图2 (b)1和图,面板2 (b)、面板3、职责),只显示骨髓蛋白质提取物(已知表达RAG1;参见图2 (b)面板1)能够阻止~ 120 KD乐队amygdalar蛋白质提取物在西方的屁股(图2 (b),面板4)。这些结果表明,RAG1抗体preabsorbed(阻塞)只有RAG1蛋白质表达组织(骨髓)。

(一)

(b)

(一)
(b)

图2

RAG1 amygdalar蛋白表达的神经元细胞。灌注上下文conditioning-trained害怕老鼠,Amygdalar日冕部分1 h条件反射后,被用于免疫荧光共焦显微镜和分析。从免疫荧光抗体被免疫印迹分析验证。(a) Amygdalar区域代表图像的双重免疫染色用RAG1抗体标记Alexa萤石488绿色通道信号,568年NeuN抗体贴上Alexa萤石,红色通道的信号。左边的面板显示了NeuN积极神经核,而中间面板描述RAG1 immunopositive细胞。右边的面板的合并图像显示colocalization NeuN神经核和RAG1标志。箭头指向的一些RAG1 immunopositive神经元。这些immunofluorescent图像显示colocalization RAG1蛋白表达与细胞表达NeuN,表明存在RAG1神经元,尽管并不是所有神经元RAG1表示。(b)组织拳从杏仁核(艾米)获得1 h上下文恐惧条件反射后,在免疫印迹分析比较comigration标准分子量(MW)标记和蛋白质提取物骨髓(BM) ((b) 1)和胸腺(你)(2)(b)。两组实验始终显示相对应的组织与乐队之间comigration RAG1 ~ 120 KD的蛋白(RAG1相对应的绿色通道和红色通道对应beta-actin, ~ 42 KD); prestained molecular weight (MW) marker (ladder) was included in all the Western blots. ((b)-3) Additionally, tissue protein extracts from leg muscle (Mus) (negative control) were analyzed compared to amygdalar extracts with respect to RAG1 expression. As expected, RAG1 was not expressed in muscle compared to amygdala ((b)-3), bone marrow ((b)-1), and thymus ((b)-2). ((b)-4) RAG1 antibody preabsorption assays, either with muscle or with bone marrow extracts, showed that only bone marrow extracts, which express RAG1 as opposed to muscle, were able to block the ~120 KD band from amygdalar protein extracts in the Western blots, indicating that RAG1 antibody was preabsorbed (blocked) only by RAG1 protein expressing tissue (bone marrow).

3.4。RAG1起功能作用在LTM整合背景下恐惧条件反射

我们表明,基因表达研究RAG1信使rna是诱导之间的杏仁核15分钟和30分钟由于上下文恐惧条件反射,它返回到基底的水平(见图1 h后培训1 (b))。这表明RAG1 LTM过程中可能发挥了作用。检查可能的功能作用RAG1在LTM整合背景下恐惧条件反射,我们使用了一个反义击倒RAG1表达式的杏仁核(大脑区域感应观察)和检查的影响这些击倒LTM恐惧条件反射的上下文。动物被植入双边插管杏仁核。插管位置确认使用硫堇高度精确和一致,表明喷油器特别有针对性的区域上方amygdalar复杂。重要的是,只有动物的行为数据的硫堇染色证实正确插管定位被用来确定寡核苷酸治疗的影响。代表图表说明插管位置的分布在整个扁桃体对动物用于我们的反义行为实验是描绘在图3(一个)。此外,我们研究了扩散和整合RAG1反义寡核苷酸在杏仁核(数字3 (b)和3 (c)通过连续rostrocaudal部分)。扩散的microinfused FITC -RAG1反义寡核苷酸都集中在前,后,腹侧基底外侧杏仁核(BLA)。它也观察到FITC -RAG1反义寡核苷酸显然是纳入细胞在这些amygdalar区域(图3 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图3

插管位置和分布RAG1反义寡核苷酸杏仁核内扩散。行为治疗后RAG1反义或随机寡核苷酸,动物与硫堇microinfused第二天来验证套管喷油器的布置。另一组动物被用来观察FITC-labeledRAG1反义扩散。(a)的示意图表示杏仁核在不同rostrocaudal飞机说明插管的位置喷油器由硫堇microinfusion。喷射器的建议为每个套管由黑点表示。(b) FITC -RAG1反义amygdalar复杂内扩散;箭头表示喷射器的小费。(c)计划的日冕部分显示FITC -扩散的RAG1反义扩散到动物的杏仁体荧光寡核苷酸注入后斩首3 h。FITC -RAG1反义扩散由绿色阴影表示amygdalar前部,后部区域的复杂。(a)和(c)的数字显示的距离前囱毫米。总共4老鼠在这些研究中使用。(d)显微照片放大FITC -更高RAG1反义扩散清楚表明并入细胞amygdalar区域内(如的箭头所示)。

我们下一个评估杏仁核的影响RAG1反义治疗中心的上下文恐惧条件反射。雄性C57BL / 6小鼠microinfused双边的杏仁核RAG1反义或随机寡核苷酸(调节训练之前,每个)1 h。前面板的图4描述数据的实验设计4(一)-4(c)和4分别(d)。我们用1 h pretraining输液时间点,以允许反义寡核苷酸扩散到大脑实质和之前是由神经细胞对动物上下文恐惧条件反射。上下文恐惧条件反射,老鼠被放置在空调环境(室、CS)在接受连续三脚前冲击(美国)。见图4(a),老鼠接受反义或随机获得任务通常显示在收购恐惧条件反射没有显著差异,测量的渐进增强冻结行为一次60年代期间。如上所述,RM双向方差分析后跟Bonferroni后续测试没有发现治疗效果,尽管两组动物获得任务,证明注入不损害动物的反应在发展中国家和表达恐惧条件反射的经验(治疗因素:,;训练因素,;交互:,;和主题匹配:,)。后续测试分析不确定任何特定的团体之间的显著差异在习惯或第一,第二,或第三试验训练(,每一个都比较)。这些结果表明,两组人同样能够学习任务。LTM当时测试24小时后调节通过将动物回空调室。LTM测试期间,老鼠仍在室4分钟,以衡量他们的冻结反应上下文(CS)。图中的条形图4(b)表明,在中心测试老鼠处理RAG1反义gapmer寡核苷酸显示冷冻空调上下文百分比明显低于随机寡核苷酸控制(学生的以及;;)。因此,pretraining反义microinfusion为扁桃体明显受损LTM测试条件后24小时。

图4

RAG1反义amygdalar治疗受损的整合背景下恐惧条件反射。前面板:图描绘了这些实验的实验设计pretraining或posttrainingamygdalar反义或随机寡核苷酸microinfusion实验。在pretraining microinfusion实验,小鼠RAG1反义或随机双边寡核苷酸microinfusions针对杏仁核前1 h调节LTM测试或分子评价紧随其后。LTM测试条件后24小时。反义分子评价治疗效果,另一组老鼠牺牲了30分钟后调节和amygdalar RNA用于实时PCR。在posttraining microinfusion实验,小鼠条件,回到家中的笼子里,收到microinfusions反义或随机寡核苷酸5 h训练后,回到家中的笼子里,直到第二天。19(19)小时后(24 h后调节),小鼠表现为调节室没有任何冲击为了测试中心。(一)老鼠接收RAG1反义或随机寡核苷酸治疗期间无显著差异显示内存采集测量的渐进增强冻结行为(双向方差分析、治疗因素:,;训练因素,;交互:,)。Bonferroni测验后的分析没有识别组之间的显著差异在习惯或第一,第二,或第三试验训练(两个组,每个比较),这表明类似的学习任务的能力。(b) LTM测试条件后24小时。条形图显示,与收购的结果,老鼠接受RAG1反义gapmer寡核苷酸显示冷冻空调上下文百分比明显低于随机寡核苷酸控制LTM测试(学生的期间以及;;)。(c)分子的有效性我们击倒gapmer反义寡核苷酸RAG1杏仁核是由定量实时PCR。老鼠注入1 h与两国在上下文恐惧条件反射RAG1反义或随机寡核苷酸和斩首调节后30分钟。RAG1信使rna规范化对gapdh信使rna表明治疗RAG1反义gapmer寡核苷酸水平有效地撞倒了RAG1amygdalar mRNA相比随机控制(学生的以及;;)。在的水平没有显著差异gapdh之间的观察治疗(数据未显示)。(d)我们使用5 h posttraining amygdalar microinfusionsRAG1反义寡核苷酸或随机控制与一组不同的动物没有任何pretraining注入和LTM测试24小时后培训。与pretraining microinfusion实验,反义和随机posttraining-infused老鼠显示类似水平的条件在LTM测试(学生的冻结以及;;)。

确认分子的有效性我们击倒gapmer反义寡核苷酸RAG1在杏仁核,我们执行定量实时PCR实验。反义的方法是一种行之有效的技术,已经广泛应用在大脑记忆功能评估50- - - - - -54]。我们的RAG1反义gapmer目标翻译起始密码子,从而导致击倒RAG1蛋白质的转化镇压[55- - - - - -58]。此外,gapmer寡核苷酸包含一个中心块deoxynucleotides足以诱导RNA的内生机制:DNA双核糖核酸酶降解H(核糖核酸酶H)解理,从而有针对性的信使RNA的降解与反义寡核苷酸杂交。此外,反义gapmer两侧的2′-块O甲基改性核苷酸,保护内部块从核酸外切酶降解58- - - - - -61年),这就增加了稳定性和半衰期的unhybridized gapmer寡核苷酸本身。测试大脑中的反义治疗的有效性已经被我们和其他人通过测量击倒目标基因的mRNA水平使用实时聚合酶链反应(62年- - - - - -64年]。分子的有效性测试RAG1gapmer反义寡核苷酸,老鼠注入1 h与两国在上下文恐惧条件反射RAG1反义()或随机的(寡核苷酸。AmygdalarRAG1mRNA表达分析在训练老鼠牺牲调节后30分钟,最高的时间点表达的时间进程研究(见图1 (b))。RAG1信使rna是规范化的反对gapdh信使rna。见图4(c)、治疗RAG1反义gapmer寡核苷酸水平有效地撞倒了RAG1amygdalar mRNA相比随机控制(学生的以及;;)。在的水平没有显著差异gapdh之间的观察治疗(数据未显示)。这些结果显示反义治疗的有效性和选择性击倒RAG1表达式。

目前为止提供的结果表明RAG1 LTM的早期阶段中需要整合。早期分子事件导致LTM整合发生在时间窗口第一次训练后6 h,尽管整合过程可能持续几小时、几天甚至记忆转移到其他皮质区域可能需要更长时间65年- - - - - -67年]。例如,据报道,在啮齿类动物中,恐惧记忆需要不同的分子和颞转录/转化事件持续6 h (65年,66年,68年,69年学习经验后)。更多的相关工作,我们之前报道的发现表明,DNA ligase-dependent NHEJ事件,这是一般与DNA的修复双边带有关,而且还与V (D) J重组过程在免疫系统26,70年,71年),也在海马体迅速诱导后上下文恐惧条件反射(32]。此外,我们还报道,皮瓣structure-specific DNA的功能核酸内切酶1 (Fen1),已知参与DNA重组/修复过程[29日,72年),诱导后的杏仁核3 h条件性味觉厌恶(CTA)需要学习和中心思想整合(29日]。因此,为我们下一组实验中,我们使用了延迟posttraining amygdalar注入RAG1反义寡核苷酸或随机控制为了更好地评估是否RAG1专门参与合并的早期阶段。动物反义或随机分配治疗植入插管pretraining注入实验动物(数字4(一)和4(b))。两组的老鼠受到上下文恐惧条件如上所述,除了这些动物没有收到pretraining注入gapmer反义或随机寡核苷酸在暴露他们的任务。培训后,老鼠回到家中的笼子里,然后受到双边intra-amygdalar注入的RAG1反义或随机寡核苷酸5 h后培训。LTM测试条件后24小时。图中所示的结果4(d)表明,与pretraining microinfusion实验(见图4(b))、反义和随机posttraining-infused老鼠(,每组)显示类似水平的条件在LTM测试(学生的冻结以及;;)。总的来说,这些行为结果表明,LTM上下文恐惧条件反射的建立,RAG1在早期是必需的,而不是之后,时间点后的时间学习经验。

最后,在额外的控制实验我们测试的影响RAG1gapmer反义治疗记忆重塑的上下文恐惧条件反射。我们使用这个额外的控制,因为我们之前的研究利用DNA连接酶抑制剂ara-C,哪些块DNA修复通过阻断NHEJ活动(31日,73年,74年),显示这种抑制剂治疗阻塞LTM合并,但不重新整合,上下文恐惧条件反射的32]。这样的结果也表明,DNA重组/修复机制是特定的初始阶段LTM整合而没有参与记忆巩固过程激活记忆检索后已经建立。这些实验的上面板(见图5实验设计的描述),一组动物与套管双边植入目标杏仁核(见部分2)。这个协议执行类似于(32,38]。第一天,老鼠microinfused盐水(压力控制)和恐惧条件反射训练1 h后在上下文。所有的动物训练后立即会被送回自己的笼子里。培训后2天(24小时),动物与随机(microinfused)或反义()gapmer寡核苷酸。Microinfusions 90年代前有1 h reexposure期间空调室以诱导记忆检索。接下来,所有的动物会被送回自己的笼子里。最后,在第三天(48 h后培训),所有老鼠再次暴露在空调室(CS) 2分钟测量冻结反应。见图5(a),没有观察到显著差异在反义或随机分配的动物之间的收购RAG1gapmer寡核苷酸治疗。因此,RM双向方差分析后跟Bonferroni后续测试没有发现效果治疗任务,虽然在两组动物获得任务正常,证明注入不损害动物的反应在发展中国家和表达恐惧条件反射的经验(治疗因素:,;训练因素,;和交互:,)。后续测试分析不确定任何特定的团体之间的显著差异在习惯或第一,第二,或第三试验训练(,每一个都比较)。这些结果表明,两组人同样能够学习任务。更重要的是,见图5(b),对我们的问题是否amygdalarRAG1反义治疗受损的记忆重塑与否,结果发现无显著差异的冻结反应反义或随机gapmer寡核苷酸治疗动物2天(记忆检索/ reexposure测试)或3天(重新整合测试)(双向方差分析:治疗因素:,;训练因素,;交互:,)。Bonferroni后续测试发现没有区别治疗reexposure和重新整合测试,分别为(,每一个都比较)。总的来说,这些结果与以前的研究结果表明DNA双边带修复机制只可能相关的初始阶段LTM整合和不利用当建立记忆检索或重新激活32]。

图5

RAG1反义amygdalar治疗不会干扰重塑的上下文恐惧条件反射。测试的影响RAG1gapmer反义治疗记忆重塑的上下文恐惧条件反射,另一组动物与套管双边植入目标杏仁核。前面板:图描述了实验设计。1天,老鼠训练环境恐惧条件反射,马上回到家里的笼子里。反义或随机寡核苷酸microinfused到杏仁核1 h记忆复活之前2天。反义或随机寡核苷酸治疗的效果在LTM重新整合评估3天,48 h后调节。(a) 1天,老鼠microinfused前用生理盐水1 h培训和调节后立即回到家中的笼子里。双向RM方差分析和Bonferroni期末测验表明,注入不损害动物的反应在发展中国家和表达恐惧条件反射的经验(治疗分配因素:,;训练因素,;和交互:,)。(b) 2天,动物microinfused随机或反义gapmer寡核苷酸1 h 90年代之前reexposure期间空调室以诱导记忆检索和回到家里的笼子里。重新整合测试,3天(48 h后培训),小鼠表现为调节室(CS) 2分钟测量冻结反应。反义的冻结反应之间没有显著差异或随机gapmer寡核苷酸治疗动物2 (b)天或3天(b)观察(双向方差分析:治疗因素:,;训练因素,;交互:,)。Bonferroni后续测试发现没有区别治疗reexposure和重新整合测试,分别为(,每一个都比较)。

4所示。讨论

我们此前报道称,DNA修复系统涉及DNA连接酶功能和NHEJ活动是诱发和所需记忆的巩固32]。此外,研究TdT),专门的聚合酶参与V (D) J重组(71年,75年,76年],显示负表达式是诱导的新记忆形成的大脑区域参与经验和需要正常小鼠的学习和记忆(30.]。我们后续的研究确定了酶Fen1,参与DNA重组/修复过程,是诱导后所需的联想学习和中心思想的形成(29日]。此外,在最近的研究中,小鼠暴露于小说的环境(27]显示大脑中积累DNA双边带,包括海马体。这些DNA损伤被证明是短暂的,因为他们是修复后24 h,强调这种双边带的DNA修复的重要性,如果不修理可能接踵而来的神经功能障碍,也表明它们可能与学习过程与接触新环境有关。此外,最近的研究表明,DNA介绍了双边带早反应基因的启动子和需要感应神经活动,突触可塑性的过程,和上下文恐惧条件反射(28]。因此,这些研究让人想起我们之前的研究结果显示,NHEJ活动修复DNA双边带快速诱导海马,但不是岛叶皮质,在老鼠(上下文恐惧条件反射后32]。

我们目前的研究进一步支持了这种观点,即DNA重组/维修机械特别是涉及DNA内切酶可能参与学习和记忆的过程。具体来说,我们识别和特征的表达RAG1在野生型C57BL / 6小鼠大脑上下文恐惧条件反射和确认RAG1表达式中需要杏仁核恐惧记忆的早期整合。这些发现进一步证实先前的报道暗示的作用RAG1在某些行为模式和支持认为DNA重组/修复机制可能需要在中心思想。

4.1。RAG1感应杏仁核与上下文相关的恐惧条件反射学习

使用定量实时PCR,我们海马和amygdalar相媲美RAG1表达式的上下文恐惧conditioning-trained动物在时间15分钟,30分钟,1 h后调节。海马的水平RAG1信使rna训练后仍类似于天真基底的水平。另一方面,我们观察的迅速而短暂的感应RAG1信使rna在杏仁核15至30分钟,回到基线在1 h,暗示RAG1是严格监管的转录水平比海马杏仁核。这与先前的报道是一致的支持杏仁核在恐惧记忆的重要作用,而海马体(77年- - - - - -79年]。此外,我们而amygdalar表达RAG1的动物和老鼠受到这种厌恶学习范式的单个组件:context-only shock-only。有趣的是,我们发现RAG1mRNA水平明显高于只在上下文恐惧conditioning-trained动物与那些训练有素的个体相比,未配对,组件的关联模式,以及与天真。的具体感应RAG1感应等调节成对刺激建议不仅仅是恐惧本身的关联,但它可能是参与联想学习和中心思想的形成。相比之下,以前的报告发现,立即早期基因参与神经元激活等c-fos诱导在上下文恐惧条件反射,而且在context-only(海马)和shock-only(杏仁核)动物组80年- - - - - -83年]。然而,特定的诱导RAG1在杏仁核条件动物表明它不对应的反应一般的神经激活模式。

因为广泛建立RAG1在DNA重排的作用,这一过程被认为是高度特定的免疫细胞的细胞核,我们想要确定这个酶的细胞定位后amygdalar组织内环境恐惧条件反射。因此,排除后观察到的变化的可能性RAG1信使rna调节后可能是由于的存在中残留的血液细胞组织检查,我们进行免疫荧光分析RAG1蛋白质。免疫荧光,重要的是大脑训练动物牺牲1 h与PBS1X调节也灌注后去除残留血液与多聚甲醛,随后组织固定。的标记结果表明NeuN神经核,与RAG1与表达,这表明RAG1-positive扁桃体细胞主要是训练后神经元。有意思的是,并不是所有的神经元标记与NeuN colabeled RAG1,表明DNA重组/维修机械与这个因素可能会限制只有一个子集的细胞环境后的杏仁核恐惧条件反射。

4.2。RAG1需要整合,但不巩固,上下文恐惧条件反射

杏仁核中扮演着一个关键的角色为中心思想整合和美国表示组件的上下文恐惧条件反射(78年,79年,84年- - - - - -86年]。我们发现RAG1信使rna是杏仁核的诱导,但不是在海马体,训练后。有趣的是,一些报道表明amygdalar病变对恐惧记忆障碍的影响比海马损伤的影响,表明杏仁核在恐惧记忆的重要作用78年,79年]。因此,我们决定延长研究用实验解决amygdalar的功能作用RAG1上下文恐惧条件反射的中心思想。我们发现RAG1反义,但并不是随机的,寡核苷酸是有效地选择性地抑制amygdalar的水平RAG1信使rna也受损LTM上下文恐惧条件反射而不影响收购的任务。动物microinfused反义或随机寡核苷酸5 h后调节显示,LTM反义的目标没有影响,建议RAG1只需要在中心形成的早期阶段。此外,RAG1反义或随机寡核苷酸注入到杏仁核1 h以前训练的未经处理的小鼠记忆复活之前导致没有影响记忆检索或再次巩固记忆的药物。符合这些发现,我们之前发现,管理ara-C DNA连接酶的抑制剂,NHEJ活动显示阻止LTM整合背景下恐惧条件反射,记忆复活之前没有影响在内存中重新激活或记忆重塑32]。总之,这些结果表明,不同失活和一般蛋白质分子合成抑制(38,87年,88年],封锁的DNA重组/修复过程中内存重新激活不干扰重塑的恐惧条件反射(32]。机制与介绍相关的DNA双边带限制的早期阶段LTM整合和不激活记忆检索的结果可能代表一种平衡机制,使神经元保持其完整性不重写他们的DNA修复机制,这可能发生如果这些病变引入每次建立内存检索。

上述结果与以前的研究一致RAG1击倒(RAG1^−−/),RAG1有缺陷的小鼠(RAG1^{−/ +})。RAG1^−−/老鼠的恐惧水平降低fear-motivated行为的某些措施在开放田地行为测试和elevated-plus迷宫(36]。此外,RAG1^{−/ +}表现出社会识别记忆受损(37]。此外,RAG1^−−/与野生型小鼠记忆障碍而表现出莫里斯水迷宫(89年]。这些发现与RAG1^−−/和RAG1^{−/ +}老鼠是有趣的;然而,众所周知,在某些情况下,这样的基因打靶模型可能被补偿机制,蒙面或发育和生理副作用,有时察觉,因为所有细胞的突变目标(50,90年- - - - - -92年]。例如,老鼠灭活突变或缺失RAG1基因显示重度联合免疫缺陷(SCID)小淋巴器官,造成的受损B和T淋巴细胞的发展,和无法执行V (D) J重组,但没有明显的神经解剖学的异常(93年- - - - - -97年]。相比之下,RAG1^{−/ +}老鼠的一个副本RAG1基因被删除,因此这是杂合的RAG1基因(−/ +),免疫活性的区别野生型小鼠,显示正常淋巴细胞分化和V (D) J重组(93年,95年]。然而,上述基因敲除或杂合的模型都没有地区或时间控制RAG1基因失活。反义寡核苷酸的方法有大脑区域特异性的优势在该地区的利益(杏仁核)在一个特定的时间点。例如,针对编码转录因子的基因敲除小鼠立即早期基因c-fos显示正常的收购和中心思想50]。然而,急性与反义寡核苷酸可拆卸的特定的大脑区域参与学习范式抑制LTM野生型小鼠(50),这表明补偿机制被激活在没有Fos-mediated转录的基因敲除模型。相反,突变体和淘汰赛中显示内存破坏分子在恐惧条件反射和广泛的行为模式(11,98年,99年]。同样,反义分子靶向注射到海马杏仁核或导致混乱的中心思想在各种任务53,One hundred.]。类似于我们的研究报道在gapmer反义寡核苷酸,使用shrna定位研究RAG1与慢病毒载体交付到鼠海马CA3区域是用来评估抑制的影响RAG1表达在莫里斯水迷宫空间学习(101年]。这些研究表明,抑制RAG1表达式的海马CA3区损害大鼠的空间学习。作者还研究了这种抑制上下文恐惧条件反射的影响。类似于我们的发现这里与尊重RAG1amygdalar击倒在老鼠身上,他们的研究结果表明,海马的表达RAG1LTM上下文恐惧条件反射是必要的,尽管没有做实验来检查是否变化RAG1表达发生在海马体或杏仁核由于学习的范例。对上下文恐惧条件反射的结果,是非常重要的,在我们的研究报告我们没有观察海马的感应RAG1调节后mRNA水平(见图1(一));也就是说,RAG1信使rna水平保持在基底天真的水平在每个时间点的检查。然而,我们也不能排除,根据上述研究,基底的组成型表达RAG1在海马体上下文恐惧条件反射在LTM可能发挥作用,以及诱导amygdalar表达式。最后,正如前面提出的(102年)有可能不同的分子机制在整合不同的学习模式,经营空间学习或上下文恐惧条件反射,这可能涉及到监管或本构RAG1表达和功能在不同的大脑区域。

我们的研究结果上RAG1感应和功能性击倒研究反义,连同之前的报告RAG1^{−/ +}(36,89年),RAG1^{−/ +}(58)小鼠模型,支持这个DNA酶的可能性,介绍了DNA双边带,需要联想记忆的形成。额外的支持所需的角色RAG1在中心提供的观察RAG1感应特别相关的配对个人条件刺激(图1 (c)),这一事实RAG1的失忆症amygdalar击倒效果是明显收购后24 h上下文恐惧条件反射(图4(b))。关键问题是是否RAG1确实参与了在应对学习和引入DNA双边带是否需要这种DNA损伤的修复中心。尽管本文提供的数据和之前报道有关因素相关的经验依赖表达V (D) J重组在大脑区域参与记忆形成进一步加强这一观点(27- - - - - -32),额外的公布的数据可以表明,这种变化可能不是与DNA双边带和DNA修复的引入。例如,一种细胞质P13激酶成员ataxia-telangiectasia突变(ATM) (103年),在DNA双边带修复起着关键的作用,是发挥重要作用在突触可塑性。然而,研究也表明,这种形式的细胞质ATM没有参与DNA双边带修复的关键作用归因于核形成的蛋白质。作者建议,细胞质ATM扮演在神经元细胞的作用是独立的在应对DNA损伤的作用。因此,我们不能排除在这个时候,我们发现与RAG1可能与DNA的作用引入双边带无关是有据可查的免疫系统。然而,在这里给出的研究定位后RAG1空调集中在杏仁核神经元细胞核,colocalizing NeuN神经核标记,表明RAG1的角色学习后的杏仁核与核相关机械如DNA重组/维修。此外,我们之前报道的双向感应NHEJ活动和DNA修复机械表明DNA双边带产生的学习,也许是诱导酶活动的结果,如RAG1和随后的DNA修复的感应NHEJ / DNA连接酶通路。总的来说,基于这些发现,我们建议DNA重组/修复途径[23),包括V (D) J-like机制使用RAG1DNA连接酶/ NHEJ [31日- - - - - -33],Fen1 [29日),和负30.),可能与表观遗传和转录/平移监管共同运作的中心思想的形成。这种机制不仅可以负责调控基因启动子的活性,从而基因表达,而且对曲目的多样性增加突触可塑性的过程和所需的基因和蛋白质特定连接的神经网络的建立和/或特定的基因表达模式参与建立特定的长期记忆。

5。结论

目前的研究已经识别和特征,RAG1关键酶的基因编码,介绍了DNA免疫系统的重组过程中双边带,LTM厌恶的形成所需的经验。在免疫细胞中,体细胞DNA重排是RAG1发起,对核酸内切酶活动的rss V (D) J基因片段导致增强抗原受体基因的多样性(42,71年,104年,105年]。因为RAG1著名的分子功能的DNA酶启动V (D) J重组的t细胞和免疫球蛋白受体淋巴细胞,我们的研究结果支持该角色的DNA重组/修复机制在LTM过程(23,27- - - - - -32]。介绍DNA的双边带、DNA修复和DNA重排的突触可塑性不一致模型和先前描述的机制。因此,一个完整的控制DNA双边带的引入,DNA修复,DNA重排,表观遗传学,转录和转译机制可能安排在记忆形成基因调控。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由国家卫生研究院的基金支持桑德拉·佩纳·德·奥尔蒂斯(P20GM103475和1 sc1mh086072-01)。此外,埃米利奥•Soto-Soto Dawling Dionisio-Santos,克里斯蒂安Saied-Santiago本科生研究学员的支持国家卫生研究院2 r25通用61151 - 9,2 r25通用61151 - 10,和5 _t3gm007821;2 r25通用61151 - 10;分别和5 _t3gm007821。

补充材料