以肌氨酸和苯胺为骨架的抗疟复合药物的化学合成、疗效和安全性研究

摘要

疟疾是由原生动物引起的疾病，由受感染的女性传播给人类按蚊蚊子。根据世界卫生组织2015年的报告，全世界有2.14亿疟疾病例，43.8万人死亡。世界上90%的疟疾病例发生在非洲，在那里，疟疾被认为是经济和社会发展的严重障碍。尽管疟疾研究取得了进展，但这一疾病仍然是一个全球性问题，特别是在发展中国家。目前，还没有有效的疟疾控制疫苗。此外，虽然有治疗疟疾的有效药物，但这可能会失去耐药性在不同的疟原虫物种。最致命的是由恶性疟原虫这引起了对许多化学治疗剂的抗性，并且可能是目前的选择药物。减少疟疾的影响是实现旨在实现疾病的可持续发展目标的关键。共价斑穴是药物设计的理性和逻辑方式，需要将几个分子与个体内在作用加入一个独特的药剂，因此将双重活性包装成一个杂种。这表明需要开发新的抗疟药药物，该药物基于新的作用方式，分子靶标和化学结构的新模式有效地对抗疟疾寄生虫。在硅研究中表明，肌氨酸能够与独特的疟原虫蛋白质结合（恶性疟原虫而苯胺可以作为靶蛋白(烯酰酰基载体蛋白还原酶)的配体，从而抑制疾病的进展。本研究的主要目的是合成由肌氨酸和苯胺衍生物组成的抗疟原虫杂交药物，并确定其治疗疟原虫感染的有效性和安全性。将亚硫酰氯加到肌氨酸上形成酰氯，酰氯再加到苯胺上形成肌氨酸-苯胺杂化分子，合成杂化药物。肌氨酸-苯胺杂合物的IC50为44.80±4.70 ng/ml，而苯胺衍生物的IC50为22.86±1.26 ng/ml。青蒿琥酯和氯喹的IC50分别为2.63±0.38 ng/ml和5.69±0.39 ng/ml。肌氨酸-苯胺杂化物与苯胺衍生物的IC50有显著差异( ）.肌氨酸-苯胺混合物与治疗疟疾的标准药物，包括青蒿琥酯和氯喹( ）.肌氨酸-苯胺复合药物的ED50为6.49 mg/kg，苯胺衍生物的ED50为3.61 mg/kg。对照药物青蒿琥酯、青蒿琥酯和氯喹的ED50分别为3.56 mg/kg、2.94 mg/kg和1.78 mg/kg。有显著差异( ）在肌氨酸-苯胺杂合物和苯胺衍生物，青蒿琥酯，青蒿琥酯-苯胺杂合物和氯喹的ED50之间。细胞毒性实验结果表明，肌氨酸-苯胺杂种对vero细胞的CC50为50.18±3.53μ克/毫升。与青蒿琥酯、氯喹和阿霉素相比，肌氨酸-苯胺杂合物的毒性显著降低。肌氨酸-苯胺杂种对小鼠有效且安全。因此，应在药物开发中应用共价双治疗来缓解耐药性。

1.背景

在全球，疟疾传播发生在世卫组织五个区域。据估计，95个国家和地区有32亿人面临感染疟原虫物种并患病的风险(图)1），12亿美元的风险高，1000多人在1000人中有可能在一年内获得疟疾。2015年世界疟疾报告结果表明，疟疾病例在149％至3.3亿之间，或平均全球疟疾患者。非洲地区占疟疾最全球疾病病例（88％），其次是东南亚地区（10％）和东地中海地区（2％）。此外，从疟疾死亡的人数在236,000至635,000的范围内，平均值为438 000例疟疾死亡。在非洲地区的高度负担是最重的（图1），通常发生估计90％的疟疾死亡（图1)，以及5岁以下儿童，他们占所有死亡人数的三分之二以上[1］．这是因为这个年龄段的儿童对感染的感染极敏感，疾病比成年人[2］．自2000年以来，全球疟疾发病率下降了37%，非洲下降了42%，而非洲区域疟疾死亡率下降了66%，全球下降了60%(图)1)[1］．

化疗一直是疟疾控制策略的骨干[3.］．这疟原虫那些被认为对人类疟疾负有责任的物种间日疟原虫那恶性疟原虫那p .那那三日疟原虫,诺氏疟原虫[4.］．然而，恶性疟原虫寄生虫，导致所有全球疟疾病例的90％往往对古典抗疟疾造成耐药，这迫切需要研究和合成新的抗疟剂，最好是具有新的动作模式[3.］．在过去的二十年中，只有少数化合物属于新的抗疟药类药物，包括氨基醇，如Meflooquine，Halofantrine和Lumefantrine;唾液酸锡如蒿蛋白衍生物;和萘醌如Atovaquone开发用于临床用途[5.］．目前，以青蒿素为基础的联合治疗(ACT)被认为是治疗的金标准恶性疟原虫，方案使用双重组合疗法，用于延迟阻力，或者完全防止它。促进的抗疟药药物发现的许多方法包括优化可用药物，例如组合治疗，培养现有药物的类似物，从天然产品中的效力评估尤其是植物，原本抗坏的化合物，抗药性评价逆转器（化学敏化剂）和新的化学治疗目标[3.］．

目前，化疗是治疗和预防疟疾的最重要的策略。然而，来自东南亚的报道表明寄生虫对阿尔米霉素的联合疗法，这被认为是根据世卫组织治疗疟疾的黄金标准[6.］．这表明，需要基于新的作用模式、分子靶点和化学结构开发新的抗疟药物，以有效地对抗疟原虫。在硅研究表明，肌氨酸(n -甲基甘氨酸)能够结合独特的疟原虫蛋白，从而抑制寄生虫的生长。此外，还发现3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺(苯胺衍生物)可以结合f p .ENR(烯酰酰基载体蛋白还原酶)，一种催化脂肪酸生物合成中延伸周期最后一步的酶[7.，从而抑制寄生虫的生长。然而，还没有实验研究证实这两种物质单独或在混合分子中具有抗疟原虫活性。

数字1显示，大多数疟疾病例发生在非洲，其次是东南亚和拉丁美洲。同样的数据也显示，疟疾在美国和欧洲已经被根除。基于生物信息学研究，认为肌氨酸和苯胺具有抗疟原虫活性。肌氨酸和苯胺的共价连接具有抑制疟原虫生长的不同方式的双重活性。鉴于药物开发的迫切需要，有必要在本研究中验证这一说法。预期结果是，肌氨酸-苯胺杂合物具有抑制嘧啶和脂肪酸生物合成的双重活性，可能规避了寄生虫对ACTs的抗性。肌氨酸和苯胺的化学结构如图所示2．

2.方法

2．1.研究设计

该项目是肯尼亚医学研究所(KEMRI)、生物技术研究和发展中心(CBRD)、疟疾股与病毒学研究中心(CVML)和传统医学药物和研究中心(CTMDR)合作开展的基于实验室的实验研究。

２.２.化学物质的来源

肌氨酸、苯胺、亚硫酰氯、二氯甲烷、硫酸镁、氯化铵、薄层色谱(TLC)板、次黄嘌呤、二甲基亚砜等物资由Sigma Aldrich公司提供。

２.３.化学合成:苯胺与肌氨酸偶联的过程

将亚硫酰氯(1.5 mL, 20 mmol)加入肌氨酸(0.09 g, 1.0 mmol)，得到的悬浮液回流6小时，得到澄清的黄色溶液。在真空中去除过量的亚硫酰氯，将酸性氯溶于干二氯甲烷(CH₂CL.₂) (10ml)，冷却至0°C。3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺(4.0 mmol)和三乙胺(0.20 mL, 2.0 mmol)在干CH中的溶液₂CL.₂(2.5 mL)通过套管加入。所得混合物在室温下搅拌16小时，在此期间形成白色沉淀物。用半饱和氯化铵水溶液(2 × 6 mL)和水(2 × 3 mL)洗涤悬浮液，用无水硫酸镁(MgSO)干燥_4.)，并集中在真空中。通过薄层色谱(TLC)监测杂化分子的形成。

将肌氨酸与苯胺偶联，合成了肌氨酸-苯胺杂化药物，反应如下。

数字3.显示肌氨酸和亚硫酰氯在二氯甲烷溶剂中的反应形成酰氯。这种反应是不可逆转的，因为所以₂和HCl气体在反应混合物中丢失。

数字4.说明了室温下酰氯与苯胺反应生成肌氨酸-苯胺杂化反应。在这个反应中，Cl被NH亲核取代₂．在薄层色谱上发现了肌氨酸-苯胺杂化的形成，并在紫外光下观察到条带(图)5.）.

2.4。薄层色谱法

以乙酸乙酯(2ml)为溶剂，在薄层色谱板上标记肌氨酸-苯胺杂化物。盘子被晒干后，在一个小容器中观察并拍照，这个小容器的盖子上混合了大约4克硅胶和1克碘晶体。将薄层色谱板置于混合物中，轻轻摇晃使其与薄层色谱板接触5分钟。将平板置于荧光机紫外下观察苯胺和肌氨酸-苯胺杂化物的黑点。TLC实验后，通过计算各点的保留因子(Rf)来表征各点在平板上的位置。保留因子(Rf)的计算方法是:用化合物经过的距离除以从基线到溶剂前沿的距离[8.］．

数字5.显示了肌氨酸-苯胺杂化在薄层色谱板上形成的结果。EtOAc是乙酸乙酯，用于薄层色谱的溶剂体系仅由EtOAc(100%浓缩)组成。苯胺作为平板中间的对照(第二柱)。从左到右，第一和第三柱，第一个靠近柱基线的点是3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺，然后靠近顶部的点是肌氨酸-苯胺杂化。肌氨酸-苯胺杂化物的极性比3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺低，因此它的洗脱(释放)速度比3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺快。肌氨酸苯胺杂合体(S-A)的保留因子(Rf)值为4.4/5.8 = 0.76，苯胺的Rf值为4/5.8 = 0.69。

2．5．在体外生物测定

2.5.1。药物解决方案和恶性疟原虫培养

用无菌水(去离子水和高压灭菌)配制待测化合物和参比药物原液。不溶于水的药物先在二甲基亚砜(溶剂浓度<0.02%)中溶解增强。检测样品制备为10mg·ml^-1库存解决方案。在生物学测定的当天制备进一步的稀释液。将所有药物溶液储存在4℃以供以后使用。

Laboratory-adapted恶性疟原虫在本研究中使用了菌株分离3D7（CQ敏感）。菌株在肯尼亚医学研究所，疟疾实验室中长期发展。使用无菌组织培养烧瓶，其含有在不同初始寄生血症的不同介质中具有1％的细胞悬浮液。培养基由补充有10％的人血清，25mM N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）和25mM NaHCO的RPMI 1640组成。_3.[9.］．人类o +红细胞（<28天大），在道德批准后从健康志愿者获得，从参与者获得同意，作为宿主细胞。志愿者阅读并完成献血问卷体外恶性疟原虫在CBRD /疟疾单位中保存的培养物，对每个志愿者留下私立和保密。当他/她没有服用抗生素或抗疟疾药物时，供体是可以接受的。此外，在病毒学研究中心测试血液和肝炎抗原，从中焚烧阳性样品。将已接受的血液样品在冰箱中储存在4℃。将培养物在37℃下在3％CO的气氛中孵育₂, 5%的人啊₂， 92% N₂．

2.5.2。在体外药物敏感性研究

用于测定抗疟原虫活性，aliquots (25μL）将培养基的培养基加入到96孔微纤维板的所有孔中。杂种药物溶液成体积为25 μL在第1孔中加入3个重复，然后连续稀释至以下孔，使每个样品从最高浓度100开始连续稀释11倍浓度范围ηg·毫升^-1到0.0975ηg·毫升^-1．参照药物如青蒿琥酯和氯喹也采用了同样的程序[10］．

抗疟活性的定量评价体外通过使用已知为氚化次黄嘌呤掺入测定法（THA）的半过滤微稀释技术进行。寄生虫的放射性标记的缺氧内吸收是其生长和繁殖的指标。该方法有助于确定针对患有嗜睡性无性阶段的抗疟疾药物活性恶性疟原虫成长在体外文化 [11］．

对于每个微孔溶液，25μl (^3.加入次黄嘌呤，在37℃孵育48小时。该方法采用闪烁计数法测定了疟原虫DNA中加入的次黄嘌呤的氚化量。因此，测定在寄生虫复制过程中插入到其DNA中的标记次黄嘌呤氚可以用来确定寄生虫的药物敏感性[11］．孵育48小时后，使用收获机收获寄生虫，通过闪烁计数器（WALLAC1450 Microbeta Reader）进行放射性的测量。每分钟的平均计数（CPM）通常在20,000-60,000的范围内，最少10,000的可接受可接受[12］． gm指每分钟计数的几何平均数[12］．

减少百分比^3.H缺氧素摄取用于根据药物浓度的函数绘制生长抑制率。我知道了₅₀活性通过对剂量反应曲线的线性段进行线性回归分析确定。

2.6。在活的有机体内生物测定

2.6.1。实验动物和寄生虫

研究人员在肯尼亚医学研究所(KEMRI)生物技术和研究发展中心的动物房中收集了瑞士白化雌性小鼠，并在那里进行了动物实验。这些动物都是6周大，体重在20 - 22克之间，它们被关在老鼠笼子里，在实验测试前允许使用老鼠铅笔和水。鼠体内ANKA菌株对喹诺酮类和青蒿素类药物敏感，从肯尼亚医学研究所生物技术和研究与发展中心疟疾股获得。寄生物在−80°C冰箱中保存和低温保存。寄生虫随后通过每周小鼠间的连续血液传代维持在实验室中。

2.6.2。程序在活的有机体内肌氨酸-苯胺杂种的效能

这是由在活的有机体内对杂交药物的评价P. Berghei.ANKA，一种啮齿类寄生虫，通常用于抗疟疾研究[13］．雌性瑞士白化供体小鼠腹腔注射1 × 10的接种物0.2 ml^7.寄生红细胞，和P. Berghei.ANKA株取自供体小鼠[14］．在显微镜下观察5天后，采用吉氏染色法检测寄生虫血症。供体小鼠使用二氧化碳进行镇静，通过肝素化管的心脏穿刺，使用注射器和针收集血液。尸体被集中在一个生物危害容器中，并在室温下储存，等待焚烧。然后用1 × 10的接种量感染实验小鼠^7.用腹腔方法寄生红细胞。将小鼠分成5组，每组5只。将肌氨酸-苯胺混合物溶解在Tween 80的10%中，每日口服药物，连续4天。从小鼠尾巴尖采集血液作薄血涂片。通过比较治疗4天后(即感染后第5天)的血寄生虫血症来衡量药物的疗效。实验结束后，那些还活着的老鼠被用二氧化碳气体杀死，然后被焚烧。

按每只小鼠体重分别计算给药剂量。在这方面，应用了以下公式:HED (mg/kg) =动物剂量(mg/kg)∗[动物公里/人公里]，HED表示人体当量剂量，km是一个换算系数。km(常数)=重量/身体表面积。体重0.02公斤，体表面积0.007的小鼠，km = 0.02/0.007 = 3 [15］．

从公式(2)[16]，

用于测试药物和参考药物的剂量（青蒿琥酯和氯喹）评估实验组的治疗方法，通过口服方法通过给予0.2ml感染的血液，其不同剂量为10,5,2.5,1.25，和0.625 mg·kg^-1．对照组在使用相同程序的同时也给予了生理盐水。从感染开始，每24小时检查一次寄生虫血症，持续4天。取小鼠尾静脉血制备薄血涂片。采用吉氏染色技术制备涂片，用光镜观察单个小鼠的寄生情况[12］．以下公式用于计算寄生虫百分比[12]：

4天后，按以下公式测定每种药物的化学抑制百分比[17]： 在哪里一种平均寄生虫血症在阴性对照组和B.为实验组寄生虫血症。将治愈50%感染动物的剂量确定为有效剂量(ED)₅₀)，采用非线性回归logistic剂量-反应模型。

2.7。细胞毒性测定

2.7.1。细胞毒性研究中使用的药物溶液和培养的制备

进行体外用无菌水配制试验化合物和参比药物的原液。对不溶于水的药物，先在100 μ g溶液中溶解10mg，可提高其溶解度μL 100%二甲亚砜。检测样品制备为1 mg·ml^-1库存解决方案。在生物学测定的当天制备进一步的稀释液。将所有药物溶液储存在4℃以供以后使用。从传统医学药物和研究中心（CTMDR），Kemri获得Vero细胞（Vero E-6）。Vero细胞是从非洲绿猴提取的肾细胞（Cercopithecus aethiops.）.它们被储存在生物学系，CTMDR, KEMRI的氮槽(−191°C)中。细胞维持在含有10%胎牛血清(FBS)、PenStrep和谷氨酰胺的最低必需鹰培养基(MEM)中。采用T-75培养瓶培养Vero细胞。烧瓶在5% CO中保持在37°C₂，每2 ~ 3天传代一次，以保持细胞存活。对彼此重叠的分离细胞进行胰蛋白酶化，并使用血球计(Neubauer)进行计数。

2.7.2。细胞毒性测定的程序

使用96微孔板，培养20,000个vero细胞，在37°C, 5% CO下孵育24小时₂使细胞附着在板的表面/底座上。将肌氨酸-苯胺混合药物作为试验药物，以100 ug/ml的浓度在培养细胞中加入3个重复的对照，随后稀释7倍，从100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625至0.78125μ克/毫升。将板在37℃下在5％CO期间温育48小时₂让反应发生。48小时后，加入0.5 mg/ml的3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四溴唑(MTT)，量热法测定药物对vero细胞系的杀伤能力[18］．37℃孵育3小时。100年μ在每孔中加入100% DMSO的L并混合，以确保细胞裂解和溶解福玛赞晶体。阿霉素作为对照药物。

使用Multi Skan Ex读取器48x从Thermo Fisher Scientific Company读取光学密度，在562和690nm处的UV可见光光度法。测量的含量的量与活细胞的数量成正比。将结果记录为每个药物浓度的每孔的光密度（OD），并使用Microsoft Excel Software 2010分析，使用以下等式计算细胞毒性（PC）的百分比：百分比细胞毒性= [（一种−B./一种× 100 [19］．在哪里一种是未经处理的细胞的平均OD和B.为各药物浓度下的平均OD值。抑制50%细胞生长的药物浓度(CC₅₀)由非线性回归logistic剂量-反应模型确定。

在体内测定中的小鼠实验的终点被设定为考虑临床迹象，例如防止动物免受食物或水，过度减肥和极端消退，缺乏身体或精神警觉的临床标志，难以呼吸困难，长时间无法保持直立。为了避免严重和持久的窘迫，通过将二氧化碳气体传递到封闭的腔室然后焚烧并焚化，使显示这些临床迹象的小鼠被安乐死。

2.8。在活的有机体内毒性研究

在该步骤中，进行急性毒性。三种剂量，例如2000 mg·kg^-1，300毫克·kg^-1，和50毫克/公斤的口服三组小鼠，第四组作为对照，给予水作为安慰剂。每组3只小鼠，每4天监测记录死亡小鼠的体重和数量，间隔14天。在研究期间也记录临床或身体体征。在实验的最后，老鼠被用浓缩的二氧化碳气体杀死，然后被焚烧。记录死亡小鼠数量，并绘制对数浓度与反应百分比(%)的半对数图。杀死50%小鼠的剂量称为LD50(致死)[20.，由此我们可以推导出治疗指数= LD50/ED50。

结果

3．1.在体外Sarcosine-aniline杂种的活性

3.1.1。在体外3-氯-4(4-氯苯氧基)甲基丙基苯胺的活性

表格1显示药物的活性，抑制了抑制生长的药物恶性疟原虫3 d7菌株，CQ敏感。IC.₅₀肌氨酸-苯胺杂交产物为44.80 ng/ml。sarcosine没有表现出来体外活动。表格1并对集成电路进行了比较₅₀对抗青蒿琥酯，苯胺和氯喹的肌氨酸-苯胺混合药物。两组间有显著性差异₅₀嗜酸性苯胺杂交药对苯胺，蒿属和氯喹（ ）.阳性对照(青蒿琥酯和氯喹)和苯胺之间有显著差异。然而，青蒿琥酯和氯喹之间没有显著差异( ）.

３．２．在活的有机体内疗效研究

数字6.显示Sarcosine-苯胺杂交，苯胺衍生物，艺术，艺术 - 苯胺杂交，4天在口服治疗后的氯喹和氯喹的化学血清的百分比。用10mg / kg嗜酸盐 - 苯胺杂交机治疗的小鼠化学抑制的百分比为52％，而用苯胺处理的那些含量为68％。在用10mg / kg artesunate和氯喹处理的小鼠的显微镜下没有观察到寄生虫。

表格2显示有效剂量的药物，抑制了生长的药物P. Berghei.ANKA对喹啉和青蒿素类药物寄生虫的敏感性在口服治疗4天后降低50%。ed.₅₀Sarcosine-苯胺杂交种是6.49 mg / kg。其他药物和化合物如野石，蒿属苯胺杂交，氯喹和Sarcosine被用作对照。sarcosine没有表现出来在活的有机体内活动。

表格2还描述了ed的比较₅₀对抗青蒿琥酯，青蒿琥酯-苯胺杂化，苯胺和氯喹的肌氨酸-苯胺杂化药物。ED之间有显著差异₅₀嗜酸性苯胺杂交药反对艺术，青蒿琥酯 - 苯胺杂交和氯喹（ ）.

表格3.显示停用10mg /kg治疗后第7、9、11天的实际平均寄生率。在第7、9和11天，肌氨酸-苯胺杂种的寄生率分别为9.74%、12.98%和15.61%。CQ和青蒿琥酯在第9天再次复发，分别为0.03%和0.2%。

表格4.显示了存活11天的老鼠数量，这是停止口服药物后的7天。对于肌氨酸-苯胺杂交，10 mg/kg组5只小鼠中有3只存活，5 mg/kg组有2只存活，而2.5 mg/kg、1.25 mg/kg和0.625 mg/kg组只有1只存活。到第11天，所有接受10mg /kg青蒿琥酯和氯喹的小鼠均存活在活的有机体内功效测试。

３．３．在活的有机体内毒性

3.3.1。急性毒性

表格5.图示14天急性毒性试验中死亡小鼠的数量。三组小鼠分别给予不同剂量(2000 mg/kg、300 mg/kg、50 mg/kg)的肌氨酸-苯胺混合药物，对照组只给予水，不给予任何药物。所有组的初始体重为20 - 22 g，且均为雌性。14天内各组均无小鼠死亡。

3.3.2。急性毒性实验的重量变化和物理特性

记录各组每只小鼠的体重及急性毒性试验14天内的体重变化情况。三组小鼠分别给予不同剂量(2000 mg/kg、300 mg/kg、50 mg/kg)的肌氨酸-苯胺混合药物，对照组除水外不给药。各组初始体重20 ~ 22 g，均为雌性。每隔4天记录体重。剂量为2000 mg/kg的小鼠14天后平均体重为21.34 g。经14 d急性毒性试验，300 mg/kg、50 mg/kg和对照组小鼠的平均体重分别为21.58 g、22.24 g和22.33 g。200mg/kg、300mg/kg、50mg/kg组小鼠与对照组之间体重变化无显著性差异(p>0.05)。在急性中毒期间未观察到严重的疼痛窘迫症状。

3．4．细胞毒性结果

表格6.显示CC._50，三重试验后肌肉酸酐杂交药的平均值的标准偏差（SD）。使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓（MTT）测定，其基于来自活细胞的线粒体脱氢酶酶的能力，以切割浅黄色MTT的四唑圆环和由此形成深蓝色的晶状体晶体，其对细胞膜很不可渗透，导致它们在健康细胞胞质中的积累。氯喹和artesunate被用作用于治疗疟疾的标准药物，而Doxorubicin用作已知的细胞毒性药物。在实验期间，两种药物的起始浓度（最高）为100 μ克/毫升。肌氨酸-苯胺杂种呈CC₅₀50.18 μg/ml, CC₅₀多柔比星是1.96 μ克/毫升。

如果CC₅₀小于2μg/ml时，认为该药物具有细胞毒性，当CC₅₀是2 - 89μG /ml时，认为药物具有中度细胞毒性，当大于90时μG / ml，药物被认为不是细胞毒性（安全）[21］．

关于CC₅₀肌氨酸-苯胺混合药物对青蒿琥酯、氯喹和阿霉素的影响差异有统计学意义₅₀对氯喹硫胺杂交药的氯喹，蒿属和多柔比星（ ）.CC之间观察到最高的平均差异₅₀嗜酸盐杂交和多柔比星（48.21），而肌氨酸 - 苯胺杂交和氯喹（-78）之间观察到最低平均差异（-7.78）。

3．5．肌氨酸-苯胺杂种的治疗指标

药物的治疗指数TI等于其致死剂量浓度除以有效剂量(LD50/ED50)。LD的₅₀Sarcosine-苯胺杂交估计大于5000mg / kg，其ED50为6.49mg / kg。因此，Sarcosine-苯胺杂交药的治疗指数大于770.41。

4.讨论

4.1。Sarcosine-苯胺杂交

在该研究中，两种分子用于合成杂交：3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺和肌氨酸。3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺和肌氨酸的分子纯度分别为97％和98％，由制造商标签通过Sigma Aldrich在肯尼亚的递送时确认。Sarcosine完全溶于水，但是3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺和水中杂种的溶解度非常低。它们可溶于二甲基亚砜（DMSO），略微可溶于吐温80.显然肌氨酸 - 苯胺杂交的低溶解度影响了药物吸收，分布及其新陈代谢。通过薄层色谱法证实，杂交（使用3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺和肌肉药物的成功合成。

4．2．在活的有机体内肌氨酸-苯胺杂种的效能

本研究结果表明，肌肉酸胆碱杂交药具有在活的有机体内抗疟疾活动。然而，Sarcosine单独使用时没有抑制活动P. Berghei.ANKA敏感株(ED₅₀无法检测到）。这是由于不同的原因，例如通过甘氨酸-N-甲基转移酶转化为甘氨酸的肌氨酸。ed.₅₀Sarcosine-苯胺杂交药为6.49mg / kg，而单独的3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺是3.61mg / kg。Sarcosine-苯胺杂交和3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺，艺术，艺术 - 苯胺杂交药和氯喹之间存在显着差异。在手中，ED之间没有显着差异₅₀青蒿琥酯-苯胺杂化药物与3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺以及3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺与青蒿琥酯之间的反应。在研究中进行在活的有机体内4种尼日利亚抗疟植物提取物组合的抗疟原虫潜力₅₀经口服途径的CQ含量为2.2 mg/kg [22]，这与目前的研究一致，在哪里₅₀氯喹为1.78 mg/kg。

这在活的有机体内Sarcosine-苯胺杂交药的活性小于本研究中使用的其他对照药物的活性。这可能是由于杂种药物的其他转换，其沿着口服给药途径如肠道。结果，这可以防止杂化分子到达靶位点。药物施用方法的有效性的类型也可能是一个很大的关注。因此，如果Sarcosine-苯胺杂化药物可以静脉内或皮下给药，则它还可以提高其功效及其生物利用度。众所周知，艺术素具有较短的半衰期，其与其他药物的组合增加了其生物利用度。3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺和肌氨酸的半衰期尚不清楚地确定它们与其他化合物或药物合并或杂交的稳定性。与三氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺和艺术单独使用时，芳纯苯胺杂交药物是活性的。这可能是因为艺术是蒿属植物的半合成衍生物，其水溶性有利于吸收并提供优于其他野生素蛋白的优势。此外，青蒿琥酯迅速水解为二氢颗粒素，这是最活跃的分层型代谢物[23］．而3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺作为低水溶性化合物可能会影响青蒿琥酯在合成药物中的溶解度。

在一项关于有效的研究在活的有机体内青蒿素-喹啉杂化物的抗疟活性和代表性快照药代动力学评价，合成的3个青蒿素-喹啉杂化物在连接子和链上的位置上各有一个甲基;他们的教育₅₀分别为1.1、1.4和<0.8 mg/kg，口服分别为12、16和13 mg/kg [24］．ed.₅₀口服青蒿琥酯的剂量为1.8 mg/kg，最高为80 mg/kg，而腹腔注射的剂量<1 mg/kg [24];这些结果与本研究的结果略有不同，因为在目前的研究中使用的剂量和方法，并没有使用腹腔方法而不是口服方法。在另一项研究中口服青蒿琥酯在急性期的剂量-反应关系恶性疟原虫疟疾，在治疗检测到感染的患者之后测定有效剂量，用0至250毫克artesunate与梅氟化的疗效剂量不同;得到的ed.₅₀为1.6毫克/公斤[25，这个结果与目前的研究不同，因为这里的青蒿琥酯与甲氟喹联合使用，而且研究使用的是患者，而在本研究中，P. Berghei.对小鼠进行了注射。

Sarcosine-苯胺杂交化的化学抑制百分比约为55％，而苯胺的百分比为68％，用10mg / kg青蒿琥酯和氯喹处理的小鼠的化学抑制百分比为100％。然而，在艺术昆酸和氯喹处理的两只小鼠的治疗后5天后有过肾功能，而对于其他药物，在停止治疗后，寄生虫血症持续增加（表2）.用青蒿琥酯和氯喹处理的小鼠中的肾小组可能是由于一些残留的寄生虫，在停止治疗后存活。甲醇叶提取物抗疟活性研究Piper BetleL，使用口腔途径用20mg / kg用氯喹处理的小鼠有100％的化学抑制[26]，这与目前的研究一致，在口服10mg /kg的药物后，第4天的化疗抑制率为100%。

实验期间存活11天的老鼠数量在活的有机体内记录疗效检验结果。事实上，在停止给药7天后，根据药物的种类和剂量，还活着的老鼠数量是不同的。这是因为在这个剂量下，有100%的寄生虫生长抑制。根据目前的研究，有一种情况是，同一种药物的剂量浓度较低时，存活的小鼠数量较高。

４．３．在体外肌氨酸-苯胺杂种的毒性

体外毒性试验是动物急性毒性评价的替代方法。Vero细胞系通常用于前瞻性研究，以确定不同的天然和人工产品的细胞毒性效应[27］．本研究的细胞毒性结果表明，该杂交药物对vero细胞是安全的。与其他标准药物相比，肌氨酸-苯胺杂合物的毒性明显低于青蒿琥酯。杂交药物与CQ对哺乳动物细胞株的细胞毒性也存在显著差异。在氯喹抑制登革2型病毒在vero细胞中而不是在C6/36细胞中复制作用的研究中，浓度等于或大于500μG /ml的细胞毒性较大，但浓度小于或等于50μG /ml未显示对vero细胞的细胞毒性作用[28］．这些结果同意目前的研究，其中CC₅₀氯喹是57.96 μ克/毫升。

因此，CQ引起的神经毒性、白细胞减少、视网膜病变、心血管毒性等副作用，对于肌氨酸-苯胺混合药物可能没有、减少或增加，但这需要用小鼠进行慢性毒性，使肝脏、肾脏、心脏的血液参数和组织病理学，大脑功能障碍可能被阐明。阿霉素对vero细胞的毒性明显高于杂种药物。在细胞毒性研究中，阿霉素作为对照，因为它对癌细胞的毒性更大，甚至对本研究中使用的vero细胞等正常细胞的毒性也更大。阿霉素的细胞毒性是基于其与DNA相关酶(拓扑异构酶)结合、与DNA碱基对插入、靶向多个分子靶标产生广泛的细胞毒性效应的能力。当它与细胞膜相互作用时，也会激活Bcl-2/Bax凋亡通路[29］．

4.4。肌氨酸-苯胺杂种的急性毒性

急性毒性表明，杂交药物对小鼠安全。没有用2000 mg / kg观察死鼠，所以ld₅₀预计将超过5000毫克/千克;因此，根据经合组织/ OCDE指南进行化学化合物的OECD / OCDE指南，该药物在5类中进行分类[30.］．在急性毒性测试期间测量的重量表明，在对2000mg / kg和300mg / kg的基团的实验的第二周中观察到重量损失。对于接受每种剂量为50mg / kg和对照组的组，重量持续增益。急性毒性实验结束时，组内部和组之间的重量没有显着差异。没有临床身体迹象的不适，如矛盾的障碍，减肥过度损失，缺乏身体或精神警觉，呼吸困难，延长无法保持直立，并且在急性毒性实验期间观察到极端的解剖。药物的治疗指数是比较给定药物有毒（致命剂量）的血液水平浓度和药物有效（有效剂量）的浓度，这是药物选择的重要标准[31］．

肌氨酸-苯胺杂合药物的治疗指数大于770.41，证明其安全性，因为产生毒性所需的浓度(>5000 mg/kg)远远大于杀灭寄生虫所需的浓度(6.49 mg/kg) [32］．TI越接近1，越危险，治疗指数(TI)越大，药物越安全[32］．事实上，如果Ti很小，则药物可能彻底给药，并且应仔细监测药物的患者，以便任何药物毒性的临床迹象进行监测[32］．谢等人的研究。[31吡咯喹唑啉二胺及其前药在重度疟疾大鼠模型中的疗效评价青蒿琥酯治疗指数为4 [31］．在比较谢等人的结果时。[31]，肌氨酸-苯胺杂种的治疗指数比青蒿琥酯高192.6倍，说明肌氨酸-苯胺杂种比青蒿琥酯安全。

5.结论

以肌氨酸和3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯胺为药效团合成了肌氨酸-苯胺杂化物，并用薄层色谱法对产物的形成进行了监测和确认。肌氨酸-苯胺杂合药物是一种很有前途的抗疟原虫前药体外和在活的有机体内IC50为44.80±4.70 ng/ml₅₀6.49 mg / kg，这是用于治疗严重疟疾的可接受的药物范围[1］．本研究指出，肌氨酸-苯胺杂交药物对含CC的vero细胞是安全的₅₀50.18±3.53 μg/ml与阿霉素相比，阿霉素对CC毒性最大₅₀为1.96±0.59μ克/毫升。急性毒性结果显示没有死老鼠的剂量使用口服2000毫克/公斤14天,也没有重大损失的重量在老鼠和组间不同剂量的sarcosine-aniline混合以及对照组。在药物开发中应该使用共价双疗法。建议使用共价生物疗法来缓解耐药性。

缩写

行为:	青蒿素联合疗法
苯胺:	3-氯-4-（4-氯苯氧基）苯胺
ATCase:	天冬氨酸氨基甲基转移酶
CC.50：	细胞毒性浓度为50%
CDC：	疾病预防控制中心
CPM:	每分钟计数
CQ:	氯喹
DMSO溶液:	二甲亚砜
背景:	脱氧核糖核酸
ED50:	50%有效剂量
恩	烯酰基载体蛋白还原酶
GM：	几何平均数
我知道了50：	50%抑制浓度
知识产权:	腹腔内
我知道了50：	抑制浓度为50％
jkuat：	乔莫·肯雅塔农业科技大学
以及:	肯尼亚医学研究所
MKU：	肯尼亚山大学
麻省理工:	(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子
MEM：	最低的Eagle媒介
OD：	光密度
经合组织:	经济合作与发展组织
PAUSTI:	泛非大学基础科学、技术和创新研究所
f p .atp酶:	恶性疟原虫肌内质网钙atp酶
f p .恩	烯酰基载体蛋白还原酶
采购经理人指数:	总统的疟疾倡议
红细胞表面:	红细胞
塞鲁船长:	科学与伦理检讨组
WHO：	世界卫生组织。

数据可用性

用于支持本研究结果的所有材料和数据可根据要求提供相应的作者。

伦理批准

动物的处理是按照KEMRI《实验室动物护理和使用指南》进行的。在KEMRI(协议编号:KEMRI/SERU/CBRD/PROP155/3324)中寻求科学伦理审查单元(SERU)的伦理审查。按照KEMRI动物护理和使用委员会(编号:KEMRI/CBRD/MP/AH/01)制定的指导方针，对小鼠进行了大量的小心处理。

信息披露

本文在第三届非洲国际生物技术与生物医学会议上发表。这项工作也在第五届SASA国际会议和第二届卢旺达生物技术会议以及第二届世界生物技术和生物工程大会和博览会上进行了介绍。这篇论文的初稿已在预印本上预先发表。org > doi:10.20944 / preprints201911.0104.v1．

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

JBN进行体外和在活的有机体内实验并起草了手稿。FO、PGK和JBN共同合成了杂化分子。KF提供了设施体外测试。JKN和PGK修订了工作并批准了它。所有作者都读过并批准了稿件。

致谢

作者感谢肯尼亚医学研究所和肯尼亚山大学在实验室工作期间提供了一些关键设施。该项目由非洲联盟通过泛非大学、基础科学与创新研究所和肯尼亚医学研究所资助。AU资助了研究的设计、数据收集、样本分析、数据解释和手稿的撰写。KEMRI为实验测试提供了设施。作者感谢KEMRI的研究助理Muthuri Njoka和Chrispus Ngule Mutuku，感谢他们在本研究中对实验的帮助。

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