文摘

软骨藻酸(DomA)是一种天然贝类毒素能诱发哺乳动物的脑损伤。新生儿显示增加灵敏度DomA-induced毒性,产前接触与如有关大脑GABA水平下降,并增加谷氨酸水平。这里,我们评估DomA-induced毒性未成熟和成熟的神经元和神经胶质细胞的主要文化从鼠小脑通过测量选择基因的mRNA水平。此外,我们评估如果诱导毒性是由激活的AMPA / KA和/或NMDA受体。所有的表达研究神经元标记DomA暴露后的影响未成熟和成熟的文化。然而,成熟的文化似乎对治疗更敏感,影响被观察到的在较低浓度和更早的时间点比不成熟的文化。DomA的效果完全阻止AMPA / KA受体的拮抗剂(NBQX),而NMDA受体的拮抗剂(APV)一定程度上阻止了DomA-induced效果。有趣的是,DomA-induced效应也部分预防神经递质的GABA。《婚姻保护法》曝光的mRNA水平也影响星形标记在成熟的文化。这些DomA-induced效应是减少NBQX, APV,伽马氨基丁酸。

1。介绍

软骨藻酸的机制——(DomA)诱导毒性都进行了广泛的调查自1987年事件在加拿大东部数百人摄取贻贝后经历了严重的健康问题。DomA-induced毒性研究主要在成年动物,和胎儿发育的影响只有在有限数量的评估研究。基于这几个实验,新生儿已被证明比成人更敏感DomA /体重(1- - - - - -5]。降低血清间隙已被建议作为一个因素增加DomA的脆弱性以及获得更多未开发血脑屏障(1,4]。《婚姻保护法》也已被证明能够穿过胎盘到达胎儿的大脑组织和积累在羊水6]。此外,更高数量的《婚姻保护法》仍在牛奶与等离子体相比,因此,一个新出生的婴儿可以比母亲更暴露的7]。产前暴露于《婚姻保护法》与损伤有关神经元在大脑不同区域;然而,神经毒性的机制还不清楚。一些研究表明DomA水平降低大脑gamma-amino丁酸(GABA)和谷氨酸水平增加(8]。此外,《婚姻保护法》暴露后代显示神经行为改变,已经持续到成年2,5),如增加响应延迟和习惯。相反,在活的有机体内研究中,在体外研究表明,增加《婚姻保护法》与越来越成熟的中枢神经系统毒性9]。因此,DomA的发育神经毒性效果需要进一步研究以确定这可能是由于不同的毒性机制,肾清除率、或增加风险。

《婚姻保护法》在结构上与海人酸(KA),这是一个模拟和兴奋性氨基酸神经递质L-glutamate。最有可能的是,DomA激活α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸/ KA受体(AMPA / KA-R),导致细胞内钙水平的提高^{2 +},反过来,导致谷氨酸释放,随后激活N-methyl-D-aspartic酸受体(NMDA-R) [10,11]。激活AMPA / KA-Rs(直接)和NMDA-Rs(间接)会导致凋亡和坏死的神经元细胞死亡(12,13]。神经细胞死亡的方式,凋亡或坏死,在纯神经文化似乎取决于DomA的浓度,低浓度(0.1μ米)凋亡主要通过AMPA / KA-Rs和高浓度(10μ米)诱导坏死还通过谷氨酸释放和次要激活NMDA-R [14]。此外,曝光时间也被确认为一个重要因素,可能增加DomA-induced毒性(9]。

此外,一些研究表明神经胶质细胞的参与可以提高DomA-induced神经毒性(15,16]。一些研究报道,暴露的星形文化DomA没有诱导细胞死亡(14,15),但它改变了神经胶质功能,观察谷氨酸摄取的抑制(15]。抑制谷氨酸摄取背后的机制尚不清楚,但可能是一个继发效应与ATP水平降低有关,谷氨酸受体激活,细胞内酸化,或自由基的形成15]。此外,还有我们的知识几乎没有研究在混合glial-neuronal执行文化,这是最相关的模型在活的有机体内的情况。神经胶质细胞和神经元之间的相互作用无疑是重要的特别是在大脑的发展,并可能在DomA-induced毒性在发挥重要的作用在活的有机体内而在在体外系统。

在这项研究中,我们使用混合neuronal-glial公司治理文化的主要文化确定DomA-induced毒性机制不成熟和成熟的文化。主要端点毒性评价,我们使用基因表达,在我们先前的研究已经表明,细胞类型特异的标记的mRNA水平不同(神经元和星形)在不同时间点细胞的发展和成熟发展神经中毒(可能是一个有用的工具来检测17,18]。本研究的目的是确定所选基因确定为特定标记神经胶质和神经细胞可以作为一个端点在体外评估DomA-induced毒性。此外,我们评估如果发展中(不成熟的)和成熟的混合neuronal-glia文化主要鼠小脑颗粒细胞(公司治理文化)以不同的方式影响软骨藻酸的曝光。事实上,信使rna表达的神经元和星形标记后改变接触DomA未成熟和成熟的文化。有趣的是,成熟的文化似乎比未成熟的脆弱,可能由于NMDA和AMPA受体的高表达。在细胞培养模型,DomA效应主要是通过AMPA / KA-R介导的。然而,不仅AMPA / KA-R的对手,而且对手DomA-induced NMDA-R和神经递质GABA减少的变化。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

为细胞培养试剂购自Gibco表达载体(米兰,意大利);胎牛血清的DMEM,马血清、谷酰胺,庆大霉素,Versene,玫瑰和Sigma-Aldrich(米兰,意大利);Poly-L-Lysine D(+)葡萄糖,氯化钾,软骨藻酸,1,2,3,4-tetrahydro-6-nitro-2, 3-dioxo-benzo [f] quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX), ((2R)-amino-5-phosphonovaleric酸(APV)和伽马氨基丁酸。

2.2。初代培养的大鼠小脑颗粒细胞(公司治理文化)

小脑颗粒细胞的主要文化(公司治理文化)准备从7天旧纯种老鼠幼崽像前面描述的那样19]。小脑分离在Versene镀溶液(1:5000)和0.25×10⁶细胞/厘米²在12 - 96合演板涂有poly-L-lysine(0.01%稀释1:10 (v / v)无菌MilliQ水)。文化保持在DMEM补充5%热灭活马血清,5%热灭活胎牛血清,葡萄糖13毫米,0.5毫米消息灵通的缓冲区,氯化钾和10 2毫米谷酰胺,25毫米μ克/毫升庆大霉素。细胞被维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。公司治理文化的媒介是没有改变在整个实验期间,当这些细胞必须培养在心的媒介。

2.3。公司治理文化的软骨藻酸治疗

软骨藻酸的浓度选择基于初步测距实验,宽范围的浓度进行了测试使用Alamar蓝色(AB)(刃天青,σ,米兰,意大利)细胞生存能力分析(数据没有显示)。在最后的实验三个noncytotoxic浓度(5、10和20μ米)选择基于AB化验结果。不成熟的文化被暴露于软骨藻酸24小时后组织了3到10天,覆盖关键发展过程的不同阶段细胞成熟。成熟的文化受到DomA 3或7点10天DIV,当文化被认为是成熟的20.]。软骨藻酸的存在是否影响所选择的基因表达,细胞样本准备定量实时PCR分析之前曝光(1 DIV) 3到10天之后,《婚姻保护法》曝光的不成熟成熟的文化。

2.4。公司治理文化的拮抗剂或受体激动剂治疗

未成熟和成熟的控制文化(nonexposed)和文化接触到20μM软骨藻酸预处理与AMPA / KA-R拮抗剂(NBQX 20μ米),NMDA-R拮抗剂(APV, 100年μ米),或神经递质的GABA (10μ米)。文化是使用拮抗剂或GABA 1 DIV(未成熟的文化)或7 DIV(成熟的文化),此后每隔两天治疗补充道。确定对手的存在或者GABA可以防止软骨藻酸诱导毒性的基因表达,信使rna提取治疗和参与文化的定量实时PCR分析暴露在3到10天后DomA未成熟和成熟的文化。

2.5。使用蓝色Alamar评估细胞的生存能力

细胞生存能力确定后3和10天的接触DomA使用AB(刃天青)试验21]。蓝色的颜色指示剂染料刃天青降低到荧光resorufin red-ox在可行的细胞反应。刃天青(10μL 100年μ股票)在汉克的缓冲盐溶液直接添加到96孔板,不排除这一媒介(100μL)。2 h盘子被孵化的37°C, 5%的公司₂。孵化后,荧光的刃天青代谢物,resorufin为530 nm / 590 nm(激发/发射)在多井荧光读者(Labsystem Fluoroskan崛起,芬兰赫尔辛基)。

2.6。核糖核酸纯化、逆转录和定量实时PCR

mRNA表达的细胞样本进行分析是细胞溶解,和总RNA提取的制造商的协议执行RNeasy迷你包(试剂盒、米兰、意大利)。可能与DNA污染被消化使用RNase-free DNase组(试剂盒)。RNA和蛋白质浓度污染评估spectrophotometrically(光度适应计;埃普多夫,意大利米兰)。执行反转录如下:500 ng RNA与2.5毫米孵化PCR混合核苷酸(Promega,米兰安道尔,意大利)和12.5μg / mL随机引物(Promega) 5分钟在65°C使用优秀的Geneamp PCR系统9600。随后,2户/μL RNaseOut抑制剂(表达载体),10个单位/μL M-MLV逆转录酶(Promega)添加相应的M-MLV缓冲区(Promega)和10分钟的样本孵化25°C退火,60分钟37°C互补脱氧核糖核酸合成和15分钟70°C的酶失活。

AbiPrism 7000序列检测器系统结合TaqMan普遍PCR大师混合和TaqMan实时PCR Assays-on-Demand(意大利Applera,蒙扎,意大利)是用于研究基因表达和房子保持基因根据制造商的协议。所使用的引物是18 s核糖体RNA (18 s rRNA, Hs99999901_s1) (TaqMan基因表达检测ID),神经丝,多肽68 kDa (Nfl, Rn00582365_m1),神经丝,沉重的多肽200 kDa (Nefh Rn00709325_m1) ionotropic谷氨酸受体N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1 Rn00433800_m1) ionotropic谷氨酸受体AMPA1(α1)(Gria1 Rn00709588_m1) gamma-amino丁酸受体δ(Gabrd Rn01517015_g1)、胶质原纤维酸性蛋白(Gfap Rn00566603_m1)、S100蛋白,β多肽(S100β、Rn00566139_m1)和巢蛋白(Nes, Rn00564394_m1)。使用比较C相对RNA进行量化_T方法,规范数据标准校准器(的混合样本的不同时间点细胞增殖和分化),和18 s rRNA内容22]。

2.7。统计分析

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)计划是用于统计分析。所有数据给出的三个独立的实验手段进行重复±标准平均误差(S.E.M.)。单向方差分析和后续测试(0.05)进行评估的差异不同的时间点,和双向方差分析和后续测试(0.05)进行评估区别对待和控制的定量实时PCR实验。所有数据进行对数转换实现高斯分布。统计学意义是表示如下⁺ ,^{+ +} 和^{+ + +} (3天与10天)和*,* *和* * *(治疗与控制)。

3所示。结果

3.1。软骨藻酸接触表达下调的mRNA水平神经元细胞骨架蛋白(nf - 68和nf - 200)在未成熟和成熟的文化

为了确定如果不成熟的混合neuronal-glial公司治理文化的主要文化比成熟的软骨藻酸的毒性更敏感,两种文化受到相同的subcytotoxic软骨藻酸的浓度范围(5、10和20μ米)10天1 DIV(不成熟的)或7点DIV(成熟)。证实了这些浓度没有细胞毒性细胞生存能力分析(数据没有显示)。选择两种细胞骨架蛋白,神经丝68 (nf - 68),是第一个被表达在200年最初的神经突生长和神经丝(nf - 200)表达后,被认为是成熟的神经元网络的一个标志。在控制(参与)文化,显著增加的mRNA水平nf - 68和nf - 200年观察到随着时间的推移,在不成熟的文化3至10天(数字1(一)和1 (c)),而在成熟的文化中神经纤维细丝的mRNA水平保持稳定(数字1 (b)和1 (d))。

3.1.1。软骨藻酸的影响

不成熟的文化
10天的长期接触到《婚姻保护法》研究浓度(5、10和20μ米)引起了nf - 68的差别明显对这些基因的信使rna (41±4%,;38±7%,;38±5%,)和nf - 200 mRNA水平(50±6%,;59±6%,;47±7%,相比),控制数据1(一)和1 (c))。此外,nf - 200的mRNA水平下降(39±12%,)已经接触后3天(4 DIV) 20μ软骨藻酸(图1 (c))。

成熟的文化
接触到的最高浓度DomA (20μ米)3天诱导的mRNA水平差别很大对这些nf - 68 (49±15%,(图)与控制文化1 (b))。相同的浓度(20μ米)nf - 68 mRNA水平进一步下降(72±7%,)长期接触后10天(图1 (b))。
nf - 200的mRNA水平也显著下降(65±10%,20)接触μM软骨藻酸控制相比,文化已经曝光(图3天后1 (d))。然而,经过长时间的接触(10天),减少已经观察到低浓度(10μ由60±9%(米))。(图1 (d))。获得的结果表明,神经元细胞骨架蛋白受到DomA暴露在未成熟和成熟的公司治理文化的文化。然而,成熟的文化似乎更敏感,因为影响被观察到在更早的时间点相比,不成熟的。

3.2。门冬氨酸和GABA的mRNA的表达_一个- r时减少了软骨藻酸的mRNA水平AMPA-Receptor持平

来确定神经元成熟的过程是受《婚姻保护法》曝光,子单元ionotropic受体主要的兴奋性神经递质谷氨酸(AMPA, NMDA-R)和GABA的亚基_一个受体,主要的抑制性神经递质,是调查。亚基受体的选择是基于以前的研究(17包括早期(NMDA-R),后来(GABA_一个- r和AMPA-R)表达基因。

基于已发表的研究,目前尚不清楚是否介导DomA毒性只有AMPA-receptor或者NMDA受体也可以发挥作用。在控制(参与)文化,显著增加的mRNA水平AMPA-R(图2 (c))和GABA_一个- r(图2 (e))观察3至10天在不成熟的文化中,在mRNA水平保持稳定成熟的文化(数字2 (d)和2 (f))。的mRNA水平NMDA-R并没有改变在这个时间间隔不成熟或成熟的控制文化(数字2(一个)和2 (b))。

3.2.1之上。软骨藻酸的影响

不成熟的文化
经过10天的《婚姻保护法》的最高浓度(20μM)的mRNA水平NMDA-R显著下降(30±6%,(图)与控制文化2(一个))。同一DomA浓度诱导的差别明显对这些基因的信使rna的GABA水平_一个- r (49±6%,曝光(图)后3天2 (e))。然而,经过长时间的治疗10天,没有观察到显著影响GABA的mRNA水平_一个- r。有趣的是,的mRNA水平AMPA-R DomA治疗后没有改变在任何时间点(3和10天)(图2 (c))。

成熟的文化
在我们的混合neuronal-glial细胞培养模型中,NMDA-R mRNA水平似乎更成熟的文化的影响而不成熟的。3天的接触20μM DomA显著减少的mRNA水平这种受体(45±15% ()(图2 (b)),而没有影响是不成熟的文化(图中观察到2(一个))。10天20μM DomA的mRNA水平进一步降低NMDA-R (69±7%,)(图2 (b))。GABA的mRNA水平_一个- r减少后10天20的最高浓度μ《婚姻保护法》(54±11%,)(图2 (f))。然而,没有观察到效果的mRNA水平AMPA-R(图2 (d))。
这些结果表明,NMDA和GABA的mRNA水平_一个- r,但不是AMPA-R mRNA水平,在未成熟和成熟的文化表达下调暴露软骨藻酸,然而,以不同的方式。再一次,成熟的文化似乎更敏感DomA的观察效果更强,特别是在早些时候发生的mRNA NMDA-R(数字2(一个)和2 (b))。

3.3。软骨藻酸暴露影响的mRNA水平星形标记(GFAP和S100β)在成熟但不成熟的文化

在开发过程中星形胶质细胞的中枢神经系统起着重要的作用,作为他们释放营养因素,引导轴突,影响功能性突触的可塑性,和保护神经元免受氧化应激(23- - - - - -26]。为此,我们研究了两个标记星形胶质细胞的成熟,中间丝GFAP和zinc-calcium-binding S100蛋白β。控制文化,GFAP和S100的mRNA水平β随时间显著增加(3至10天)在不成熟的文化(数字3(一个)和3 (c))。在成熟的文化中GFAP的mRNA水平继续提高,然而,并不是显著(图3 (b)),而S100β保持稳定(图3 (d))。

此外,早期的神经发育阶段,巢蛋白、神经前体细胞的标记,进行了研究。巢蛋白是一种细胞骨架蛋白主要表达于神经前体细胞,但据报道也被重新激活星形胶质细胞的反应神经损伤(27- - - - - -29日]。信使rna表达巢蛋白稳定的研究时间点未成熟和成熟的控制文化(数字3 (e)和3 (f))。

3.3.1。软骨藻酸的影响

不成熟的文化
接触DomA 20μ米没有引起任何显著变化的星形标记GFAP和S100的mRNA水平β(数据3(一个)和3 (c))或神经前体巢蛋白标志(图3 (e))。

成熟的文化
有趣的是,成熟的文化接触的最高浓度DomA (20μ米)10天诱导的mRNA表达差别明显对这些星形标记GFAP (50±3%;)(图3 (b)),比控制文化。相比之下,S100的mRNA水平β调节后的长期暴露(10天)研究了浓度(5、10和20吗μ由53±9%(米)),45±13% ()和34±13% (),分别(图3 (d))。
此外,巢蛋白mRNA水平的成熟文化显著增加10天后接触10和20μ《婚姻保护法》(123±40%,和98±24%,职责。)(图3 (f))。信使rna表达巢蛋白的增加可能是由于前体细胞的增殖,每个细胞巢蛋白的高表达,或者,最有可能的,因为在星形胶质细胞巢蛋白的表达,这可能成为应对DomA-induced激活神经毒性。
结果表明,成熟的星形胶质细胞暴露于软骨藻酸的影响,各种星形标记的基因表达下降(GFAP)或调节(S100β和巢蛋白)。在不成熟的文化中没有观察到的变化。

3.4。AMPA / KA受体介导DomA-Induced神经毒性未成熟和成熟的公司治理文化的文化

为了评估如果观察到毒性作用引起的软骨藻酸是由激活的AMPA / KA -和/或NMDA受体,文化被接受竞争对手(NBQX APV, resp)单独或结合测试浓度最高的《婚姻保护法》(20μ米)。此外,以确定是否增加的抑制性神经递质水平GABA能阻止软骨藻段会,因为它已被提出在活的有机体内研究[8),文化是使用这种神经递质。研究了浓度的NMDA和AMPA / KA受体拮抗剂(100μAPV和20米μNBQX)和受体激动剂(10 MμM GABA)选择基于结果的文献[9,14,30.]。这些APV浓度、NBQX和GABA没有引起任何变化在研究基因的mRNA水平控制文化(数字4- - - - - -6)。

3.5。对手的AMPA / KA -但不是NMDA-R阻止软骨藻酸诱导减少nf - 68和nf - 200 mRNA水平

3.5.1。不成熟的文化

暴露的不成熟的文化到20μM软骨藻酸10天明显下降的mRNA水平nf - 68 (54±13%;)(图4(一))相比,控制文化。预处理与AMPA / KA-R拮抗剂(20μM NBQX)完全阻止了这种效果,nf - 68的mRNA的表达是在同一水平上的控制文化(图4(一))。相比之下,预处理NMDA-R拮抗剂(100μM APV)没有任何影响,增加GABA (10μ米)一定程度上阻止软骨藻在mRNA水平段变化nf - 68(图4(一))。

也观察到类似的结果的情况下nf - 200 mRNA水平。软骨藻酸单独表达下调的基因表达67±2% (),经过3天的曝光和71±10% ()相比,10天后控制文化(图4 (c))。AMPA的存在/ KA-R (NBQX)拮抗剂完全阻止DomA-induced nf - 200 mRNA的变化,因为它是控制水平。NMDA-R有趣的是,对手(APV)封锁了DomA-induced减少nf - 200的mRNA 3天后的接触但不经过长时间的治疗(10天)(图4 (c))。GABA治疗没有任何影响软骨藻酸nf - 200的差别引起对这些基因的mRNA水平(图4 (c))。

3.5.2。成熟的文化

在成熟的文化,接触到20μM软骨藻酸单独表达下调的mRNA水平nf - 68 39±7% (),经过3天的曝光和41±3% ((图)后10天4 (b))。当AMPA / KA-R拮抗剂(NBQX),观察到的变化是阻止(图4 (b))。NMDA-R拮抗剂(APV)没有任何影响的mRNA表达nf - 68仍下降(33±9%经过3天的曝光和45±7%,10天后(图)与控制文化4 (b))。有趣的是,神经递质水平的增加GABA阻止软骨藻酸效果,nf - 68的mRNA表达在同一级别的控制文化(图4 (b))。nf - 200的mRNA水平下调了20μM DomA治疗在成熟的文化接触后3天(49±1%,)和10天后(62±3%,)(图4 (d))。预处理与NBQX阻止这种效果,而变化仍在APV (nf - 200仍下降)的mRNA表达(图4 (d))。GABA减少《婚姻保护法》的影响,nf - 200的mRNA水平下降少(34±6%,)后3和10天的曝光(28±10%,),而单独软骨藻酸治疗(49±1%,3天后62±3%,(图10天后)4 (d))。

结果表明DomA-induced AMPA / KA-R主要介导的影响,作为其拮抗剂NBQX可以防止减少观察到mRNA水平nf - 68和nf - 200未成熟和成熟的文化。此外,抑制性神经递质GABA也可以参与,因为增加的水平部分保护DomA-induced神经毒性,尤其是成熟的文化。

3.6。AMPA / KA-R拮抗剂阻止软骨藻段NMDA和GABA的减少_一个- r mRNA水平

3.6.1。不成熟的文化

软骨藻酸暴露(20μ米)独自一人在不成熟的文化NMDA-R的mRNA水平降低了46±2% (),经过3天的曝光和52±12% ()(图10天后比控制文化5(一个))。NBQX(拮抗剂AMPA / KA-R)完全阻止了观察NMDA mRNA表达减少,而增加GABA和APV (NMDA-R拮抗剂)降低了效果。

软骨藻酸接触表达下调- r mRNA表达59±2% (后3天的接触和控制(图5 (c))。有趣的是,这种效果是完全阻止NBQX和APV(图5 (c))表明这两种受体,AMPA / KA-R和NMDA-R参与。然而,增加GABA水平本身没有任何影响,随着- r mRNA水平仍表达下调(47±2%,曝光(图)后3天5 (c))。

操作。成熟的文化

成熟的文化接触到20μM DomA-induced NMDA-R mRNA水平的差别明显对这些时间点3天的暴露(43±1%,)和10天的暴露(58±3%,)(图5 (b))。这些影响被封锁的AMPA / KA-R拮抗剂(NBQX)和神经递质的GABA(图5 (b)),而NMDA-R拮抗剂(APV)没有任何影响。

mRNA的表达20 - r也显著减少μ《婚姻保护法》(51±1%,曝光(图)后10天5 (d))。这种减少是预防NBQX和GABA处理(图5 (d))。然而,APV治疗没有任何效果,表达- r仍明显降低(图5 (d))。

这些结果表明,AMPA / KA-R DomA-induced毒性中发挥了至关重要的作用,作为拮抗剂(NBQX)完全阻止了观察NMDA和GABA的mRNA表达下降_一个- r在未成熟和成熟的文化。此外,NMDA-R较少涉及,其拮抗剂(APV)没有完全防止(图观察到的影响5)。有趣的是,神经递质的GABA能防止软骨藻成熟的文化(数据段的毒性5 (b)和5 (d))而不是不成熟的(数据5(一个)和5 (c))。这可能是由于不成熟的文化可能表达低水平的功能性GABA受体在早期时间点相比,成熟的文化。

3.7。软骨藻酸诱导交替GFAP的mRNA水平,S100β,巢蛋白部分预防NBQX, APV或伽马氨基丁酸

3.7.1。不成熟的文化

因为在不成熟的情况下文化《婚姻保护法》没有产生任何影响的mRNA水平星形标记,GFAP和S100β或神经前体细胞标志巢蛋白,没有进一步的研究进行的拮抗剂NMDA-R, AMPA / KA-R或与神经递质的GABA。

3.7.2章。成熟的文化

成熟的文化暴露于软骨藻酸(20μ米)仅显示GFAP的mRNA水平差别很大对这些(48±2%,)相比,控制曝光(图10天后6(一))。这些毒性被NBQX但无论是通过APV还是神经递质的GABA, GFAP的表达仍然是减少10天后的暴露(44±9%;APV治疗后和46±2%;在GABA(图)6(一))。与GFAP相比,20μ63 DomA暴露诱导显著的upregulation±18% (S100的)βmRNA水平经过10天的曝光(图6 (b))。有趣的是,这种效果是完全被NBQX的预处理,APV或GABA(图6 (b))。

类似于S100β神经前体mRNA表达巢蛋白(细胞标记)是显著增加(71±12% (20)经过10天的接触μM软骨藻酸相比,控制文化(图6 (c))。增加可能是因为表达巢蛋白的激活星形胶质细胞。NBQX和APV阻止这种效果没有差异相比,控制文化观察(图6 (c))。神经递质水平的增加GABA减少毒性,影响不显著(26%±3%;)相比,文化只接触《婚姻保护法》(71%±12%,)(图6 (c))。

我们的研究结果表明,各种毒性作用引起的软骨藻酸在神经元和胶质细胞的混合主要公司治理文化的文化似乎是由不同的受体。mRNA的表达的改变神经元标记(nf - 68−200,和门冬氨酸和GABA受体)可以通过NBQX主要是预防,这表明AMPA / KA受体有关。观察到影响星形标记S100的水平β和巢蛋白(可能作为反应性星形胶质细胞的标记)都可以预防NBQX APV,表明NMDA和AMPA / KA - -受体可能在DomA-induced毒性中发挥作用。但是,应该进行更多的研究来确定是否星形毒性可能是继发效应由于减少NBQX和APV神经毒性观察。

4所示。讨论

在这项研究中,我们已经表明,软骨藻酸exposure-induced变化选择基因的mRNA水平确定为胶质和神经细胞特定的标记,在发展中国家(不成熟的)和成熟的混合neuronal-glia文化主要鼠公司治理文化。有趣的是,mRNA水平变化表明,成熟的文化似乎更敏感DomA暴露比不成熟的。在成熟的文化,所有神经元标记(nf - 68, nf - 200、NMDA-R和伽马氨基丁酸_一个- r)明显和早些时候表达下调后软骨藻酸暴露比在不成熟的文化中,这表明较高的脆弱性。

这些结果表明,长期接触可能会导致神经功能障碍,如细胞骨架蛋白(nf - 68和nf - 200)以及关键受体的表达既兴奋(NMDA)和抑制性(GABA)受到影响。《婚姻保护法》的最高浓度也影响神经胶质(GFAP的表达减少和增加S100的表达式β),另外能神经元更容易DomA-induced毒性。另外,巢蛋白的高表达支持激活星形胶质细胞可能存在的反应DomA曝光。

所得结果表明,应用基因表达工具足够敏感识别细胞浓度变化不确定通过细胞毒性实验,如AB在这些研究中使用。

在前面研究秋et al。9),我们的研究结果支持。事实上,它已经表明NMDA受体可能发挥重要作用的增加会引起观察与增加在体外时间。这可能是由于降低谷氨酸受体的表达(AMPA / KA和门冬氨酸)在年轻的文化中,已提出调解软骨藻酸的会。它也建议更多的Ca^{2 +}透水AMPA / KA-Rs或AMPA-R亚型可以激活在成熟的文化相比,年轻的文化(9),导致谷氨酸释放,随后可以激活NMDA受体(10,11促进神经毒性。

在我们的研究中,在开发过程中受体的表达变化可以解释增加的脆弱性的mRNA水平AMPA-R增加大约在3天,20倍五倍比10天1天的水平。相比之下我们的观察,在活的有机体内动物研究已经清楚地报道,胎儿和新生儿比成人更容易受到软骨藻段毒性(1,3,4]。的在活的有机体内脆弱的不成熟的大脑可能更依赖增加生物利用度的化合物由于不完整的血脑屏障形成和降低血清间隙比DomA-induced毒性机制本身。这可以解释相反在体外发现,成熟比未成熟的文化似乎更容易受DomA-induced神经毒性。

这两个受体的表达(NMDA和AMPA)应评估在整个动物研究更好的对比在体外和在活的有机体内DomA-induced能够识别影响大脑发育的关键阶段,更容易暴露软骨藻酸。这些知识将帮助确定是否一个特定的年龄段软骨藻段神经毒素的影响可能更大的风险。如果DomA毒性只有通过谷氨酸受体介导,缺乏这些功能的受体在第一次DIV将负责低水平的毒性引起的亲身观察研究。

软骨藻段神经毒性,在成熟和不成熟的文化,似乎主要是通过介导的AMPA / KA-R NBQX完全逆转所有选中的mRNA水平降低神经元标记(nf - 68, nf - 200、NMDA-R和伽马氨基丁酸_一个- r)。相比之下,NMDA-R拮抗剂(APV)不能阻止这些mRNA水平的变化。

在急性在体外接触研究(1小时),它已被证明,AMPA / KA受体(不是NMDA-R)调解低浓度软骨藻酸- (0.1μ米)诱导细胞凋亡,而更高的浓度(10μ米)激活AMPA / KA-R和NMDA受体导致坏死(31日]。

有趣的是,在这个研究中,DomA的毒性(nf - 68的表达的变化,nf - 200, NMDA-R,伽马氨基丁酸_一个- r, S100β和巢蛋白)通过添加外部GABA减少在成熟的文化。在活的有机体内研究显示减少的表达在大脑中神经递质的GABA软骨藻酸接触后(3,8,32)和一个类似的减少也可能发生在我们在体外模型。事实上,当地GABA在大鼠海马管理在活的有机体内研究导致神经元保护《婚姻保护法》——诱导毒性8)以及在此在体外研究。此外,在我们的以前在体外研究中,我们观察到,GABA的功能_一个受体表达下调后长期接触DomA,可能由于低水平的神经递质的GABA (33]。相比之下,GABA没有减少软骨藻酸的毒性作用在不成熟的文化中可能由于低GABA受体的表达。

结果还指出,神经胶质的重要作用DomA-induced神经毒性。在先前的研究,包括佐丹奴等获得的结果。31日),纯神经文化被应用,而我们的实验进行了使用混合neuronal-glia文化(神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞),特别是,DomA-induced星形胶质细胞可以发挥重要作用的毒性机制。这是一个关键问题,因为神经元的反应不同,相同的毒物的存在与否取决于神经胶质(34]。有一些报告表明软骨藻酸的毒性可以增强星形胶质细胞和小胶质细胞由于例如DomA-induced谷氨酸摄取的抑制星形胶质细胞(15]其次是胶质激活(稍后最初的小胶质细胞和星形胶质细胞)。活化的小胶质细胞和星形胶质细胞可以释放神经毒性氧自由基,一氧化氮和促炎细胞因子(16,35,36]。事实上,在混合neuronal-glia控制公司治理文化的主要文化、星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖发生随时间(18],DomA-induced增加毒性观察在成熟的文化,因此,是由于更高的神经胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)。不成熟的文化(4 DIV)由93±3%的神经元,星形胶质细胞4±0.3%,小胶质细胞和3±0.1%,而成熟的文化(8 - 12 DIV)由78±3%的神经元,星形胶质细胞18±0.8%,4±0.2%小胶质细胞(18]。

在我们的研究中,软骨藻酸不仅明显影响神经元,星形胶质细胞也GFAP的mRNA表达的变化)差别(对这些和S100β(upregulation)观察。然而,这些影响只能观察到成熟的文化,和缺乏效果的不成熟的文化可能是因为低水平的星形胶质细胞。此外,成熟的文化有显著提高的mRNA水平巢蛋白DomA曝光后,据报道是一个敏感的标志激活星形胶质细胞(37- - - - - -39]。

减少GFAP表达与抑制谷氨酸摄取[有关40,41],它确实可以在我们的研究中,作为《婚姻保护法》曝光了减少摄取谷氨酸的星形胶质细胞(15]。相比之下,增加S100的水平β被认为是脑损伤的标志(42,43]。而细胞外S100β在正常浓度有神经营养作用,更高的浓度可以激活星形胶质细胞和小胶质细胞和诱导神经细胞死亡(44]。此外,S100β与不同的大脑病理条件下,如阿尔茨海默病(45和唐氏综合征46,47]。同样,软骨藻段upregulation巢蛋白mRNA的可能是因为神经胶质激活响应DomA诱导神经元损伤(观察神经元的减少mRNA标记),而不是由于神经前体细胞的增殖。

总结结果表明DomA-induced神经毒性通过不同机制介导的毒性在成熟和不成熟的文化可以被观察到的变化在mRNA的表达不同的细胞标记(包括神经元和神经胶质)。

评价基因表达可能是一个有前途的端点(17,18被包括在一个在体外DNT测试策略。这种方法可能是有用的初步识别和进一步优化化合物可能DNT潜力。

确认

作者要感谢苏珊Salovaara博士和大卫Horby科学和语言编辑的文本和托马斯·哈尔顿博士和CAAT金融支持。