文摘

铁的交互行为^{3 +}转铁蛋白和apotransferrin(免烫形式)研究了在这项研究中使用亲和毛细管电泳。蛋白质的质量和电荷的变化在绑定到毛细管中的金属离子导致变异的迁移时间和被用来测量快速筛选方法结合非共价相互作用。乙酰苯胺被用作电渗流量(EOF)标记,以避免可能的错误由于EOF实验期间的变化。绑定结果计算流动比率的蛋白质(国际扶轮)和EOF (Rf)标志使用公式(国际扶轮−射频)/射频或∆R/射频。为更全面的了解,相互作用的动力学研究和绑定常数计算。结果表明,铁^{3 +}无关紧要的交互显示蛋白质与金属离子浓度较低(做些μ摩尔/毫升)。然而,转铁蛋白与金属离子表现出显著的交互在50和100μ摩尔/毫升(ΔR /射频= 0.0114和0.0201,分别地。)浓度和apotransferrin显示强劲(Δ绑定交互R/射频=−0.0254和0.0205,分别地。)在相对较高的铁^{3 +}100年和250年的浓度μ摩尔/毫升。绑定常量18.968更易⁻¹和−13.603更易⁻¹被菲^{3 +}分别与转铁蛋白和apotransferrin,显示显著的交互作用。不同的铁绑定模式^{3 +}与蛋白质可能归因于这样一个事实:在转铁蛋白铁扎网站已经被占领,在apotransferrin并非如此。本研究可以作为参考的调查protein-metal离子,药物,drug-metal离子,enzyme-metal离子相互作用和可能有助于提供初步洞察新的金属药物开发。

1。介绍

铁对生物系统至关重要,因为它起着重要的作用作为一个辅助因子在几个重要的生物过程,包括呼吸和DNA复制。不溶性和毒性在自由铁(III)离子形式。转铁蛋白是一种iron-transport蛋白质,铁(Fe的交付是至关重要的^{3 +})细胞。铁运输的过程中,铁带转铁蛋白(holofrom)与转铁蛋白受体在细胞表面和被运送到核内体,铁在哪里发布由于酸性博士免烫转铁蛋白(apofrom)回到分离和细胞表面受体(1- - - - - -3]。铁(ⅲ)离子最好结合硬官能团,包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸,组氨酸氨基酸残基(4]。相反,低氧化态(铁的铁离子^{2 +})积极与卟啉残留等包含边缘酸组半个血红蛋白。硬和软酸和碱(HSAB)原理可以解释金属ion-ligand络合反应的机制以定性的方式和提供信息关于复合物的稳定性5]。其他金属离子和配体的分类成软硬酸碱及其特点和绑定偏好根据HSAB原则在图表示1。iron-transport转铁蛋白,蛋白质,由铁扎nonheme糖蛋白广泛分布于生物的生理体液和细胞。转铁蛋白的主要功能是运输铁^{3 +}通过循环系统,提供细胞内吞作用[6,7]。它由两个相似但不恒等的金属ion-binding位置出现在N -和c端域。一般来说,转铁蛋白与两个铁^{3 +}离子产生pink-colored复杂的碳酸氢盐离子(或碳酸盐)。铁的绑定^{3 +}离子转铁蛋白会导致重大的蛋白质结构构象改变,导致的转换开放(脱辅基蛋白)的形式关闭(holoprotein)构象。Apotransferrin称为一种iron-depleted的转铁蛋白。只有holoform转铁蛋白能与受体结合,而不能认识到apotransferrin。转铁蛋白还可以与许多di -交互,三倍,四价金属离子,包括过渡,镧系和锕系元素系列,,机制类似于菲^{3 +}转铁蛋白的相互作用。证据表明转铁蛋白循环作为一种重要的细胞吸收途径几个临床重要的金属离子是可用的。此外,转铁蛋白通常被视为承诺交货为细胞毒性金属离子和金属ion-based治疗恶性肿瘤细胞(8- - - - - -10]。

1.1。Protein-Metal交互分析技术研究

蛋白质通常是复杂的自然界中,呈现protein-metal离子相互作用的调查具有挑战性的任务。各种分析技术,包括核磁共振光谱,红外光谱,x射线晶体学,原子力显微镜(AFM)、圆二色性(CD)光谱,和表面等离子体共振(SPR),已被用于调查protein-metal离子相互作用[6,7]。蛋白质之间的相互作用与分子量的< 40 kDa可以很容易地与核磁共振分析技术。然而,对于更大的蛋白质(分子量≥40 kDa), isotopically标签样本,使分析复杂(11),而需要相当长的时间(4 - 5周)x射线晶体学中的样品制备;甚至在某些情况下,结晶是非常困难的12]。x射线晶体学和核磁共振光谱都可以使用更多的首选结构说明和从其他技术进一步验证结果。亲和毛细管电泳(ACE)最近和亲和色谱法是两个重要的技术用于研究protein-metal离子绑定。由于其良好的分离能力,这些技术优势当蛋白质样品是不洁净的,包括一个生物样品。然而,亲和色谱法、成本因素成为重要的由于使用亲和力列除了大量的样本进行分析(13,14]。最近,王牌已成功用于研究各种蛋白质的相互作用与不同的金属离子(15- - - - - -18]。不同亚型的蛋白同时也调查了使用ACE,可以很容易地单独每个同种型在相对较小的分离时期(19]。ACE-UV一直被认为是一个很好的选择为研究protein-metal离子相互作用由于容易处理,成本效益和可靠的结果。额外的ACE的优势包括一个很小的体积的样品的要求,分离效率高,并且能够执行实验pH值7.4和37°C,密切描绘在生理条件下蛋白质的原生环境。由于出色的分离效率,蛋白质和其他生物样本可以直接在他们分析不洁净的形式,减少样品制备时间20.- - - - - -24]。

1.1.1。亲和毛细管电泳(ACE)

ACE是用于研究两个反应物的相对亲和力使用毛细管电泳的分离能力。最近,埃斯得到了太多的关注在研究protein-metal离子相互作用和决定他们的结合常数25- - - - - -27]。通常用来研究共价结合分析物和配体之间的相互作用,改变在电泳迁移(迁移转变),区域,和/或分析物峰的高度测量之前和之后的绑定。的三个ACE模式,即preequilibrated,动态平衡和动力学模式,可以用来研究蛋白质和金属离子的相互作用行为。动态平衡模式通常是首选当金属离子的弛豫时间绑定比电泳分离时间短。分析物和配体之间的相互作用发生在毛细管电泳运行期间;因此,动态模式的优点是速度比其他模式(不需要额外的时间互动)。动态平衡模式使用流动转变ACE被选中在这项研究中,因为它是高度敏感的,甚至能够检测正确非常弱的相互作用。的精度计算方法可以进一步提高交互的流度比筛查(15- - - - - -19]。在ACE,流动比率(R),这是分析物流动的比例(μ),可以表示为 在哪里R流动比率和吗μ_普罗特和μ_eof分别代表了蛋白质的迁移率和EOF标记。移动性可以计算 ,““代表了外加电压和“x”和“D“是有效和毛细管的总长度,分别。所有这些因素除了迁移时间”t“是常见的蛋白质和EOF标记,因此将被取消。因此,流动比率可以计算使用的交互记录迁移时间 在哪里t_eof和t_普罗特代表EOF标记和蛋白质的迁移时间,分别为(19,22]。

尽管铁之间的相互作用^{3 +}离子与转铁蛋白使用各种分析技术研究[28- - - - - -30.),没有研究基于ACE进行了迄今为止。因此,目前的工作是开始研究铁的交互行为^{3 +}使用快速筛查方法的迁移与转铁蛋白和apotransferrin转变亲和毛细管电泳和确定绑定常量为更好地理解交互行为。目前的研究将为应用程序提供一个参考的王牌调查不同类型的交互enzyme-metal离子等药物,drug-enzyme,蛋白质-蛋白质之间的关系,除了确定绑定生物学上重要的金属离子对各种金属离子的行为。因此,这项研究可能被证明是有用的提供初步信息发展的新金属的治疗药物。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

人转铁蛋白(98%)、apotransferrin(97%)、三粉、氯化铁、氯化亚铁和购买从Sigma-Aldrich,德国。丙二酸和高效液相色谱级乙腈采购从里德尔deHaen(汉诺威,德国)和丙烯酰胺(Steinheim、德国),分别。双重蒸馏水生产内部使用微孔Milli-Q净水器系统(Molsheim。法国)。

2.2。仪表

安捷伦毛细管电泳(CE)系统,模型没有。G1600A(安捷伦科技、德国),用于屏幕protein-metal离子相互作用通过记录电泳淌度的分析物蛋白质络合前后。CE仪器配备了毛细管冷却系统,autosampler和二极管矩阵检测器在波长214纳米。电泳迁移进行bare-fused石英毛细管与一个有效的和全长22厘米,31厘米,分别(短毛细管),和一个内部直径50μm。毛细管从Polymicro采购技术(美国凤凰城,AZ)。正常空气塞是利用应用高压实验室(2.5条)。解决方案的pH值调整使用Jenway酸度计(Cole-Parmer,斯塔福德郡,英国)。ROTILABO CME注射器过滤器(25毫米尺寸和0.22μ孔隙大小)采购从卡尔·罗斯,德国。仪器监测,筛选数据被ChemStation处理软件(安捷伦科技、德国)和Microsoft Excel版本2010(美国微软公司)是用于模拟不同的相互作用参数,包括流动比率(R),∆R/射频和置信区间。

2.3。清洗程序毛细血管的再生

最初,新的毛细管条件为20分钟1条1 N的氢氧化钠溶液超纯水紧随其后。在每个工作日的开始和结束,额外的和0.1 N氢氧化钠溶液冲洗10分钟之后,水5分钟2.5条执行。此外,每个分析初,毛细血管条件有0.1 M EDTA和0.1 N氢氧化钠的混合解决方案2.5酒吧2.5分钟,1.0分钟超纯水,运行缓冲为1.5分钟。

2.4。电泳条件

电泳分析物的迁移是通过10千伏的电压23°C毛细管温度。完成了电泳分离模式,在阳极阴极在进口和出口的毛细管(正常模式)。示例解决方案注入毛细管在50岁mbar使用水动力模式,进样后,运行缓冲在50 mbar注射2.5 s。总的来说,十二个运行完成了每个样本,包括6分分析物与铁蛋白^{3 +}没有金属离子和6分。

2.5。分析解决方案的准备

2.5.1。三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.4,20更易/ L)

准确地重达2.42 g三粉末溶解在大约200毫升的双重蒸馏水。盐酸和稀溶液的pH值调整到7.4,以及调整量使用水1000毫升。

2.5.2。乙酰苯胺股票的解决方案

准确地重达37.5毫克的乙酰苯胺在50毫升转移三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.4)和溶解完全由声波降解法获得浓度为750μ克/毫升。

2.5.3。蛋白质的工作方案

适当数量的转铁蛋白和apotransferrin分别为25毫升容量的玻璃瓶和溶解在少量的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。整除的5毫升的退热剂原液添加到每个瓶,和卷完成三羟甲基氨基甲烷缓冲液获得的解决方案有15μmol / L的蛋白质浓度。尽量减少蛋白质吸附在墙上的毛细管和频带展宽,上述蛋白的解决方案在三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释3倍。

2.5.4。铁(ⅲ)离子的解决方案

适量的氯化铁溶解在溶液中含有20 L更易与三羟甲基氨基甲烷缓冲液(未经调整的pH值)和15更易/ L丙二酸达到5更易/ L的原液浓度的金属离子(Fe^{3 +})。铁(III)是不正确地溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液和倾向于沉淀;因此,丙二酸添加协助氯化铁的解散。丙二酸弱离子螯合物铁(III)形成的一个复杂的蛋白质残基的配位金属离子交换(19]。三羟甲基氨基甲烷缓冲液中金属离子溶液被稀释(pH值7.4,20更易/ L)获得工作解决方案5,10,25、50、100和250μmol / L浓度。蛋白质和金属离子解决方案可用于只有一天;因此,所有的解决方案都是刚做好的在每个工作日的开始。所有准备的解决方案是使用0.22过滤μm注射器过滤器之前分析。

3所示。结果与讨论

3.1。快速筛选的归一化差异流动比率

在ACE,迁移时间(流动性)分析物蛋白质的改变,因为整体质量和电荷的变化与金属离子络合后。这已经被用来作为衡量金属离子之间的相互作用的程度和测试蛋白质。蛋白质吸附在毛细管内表面往往会降低绑定结果的精度。此外,绑定的蛋白质分析物和内毛细管表面可能导致变更的电泳淌度电泳运行期间(31日,32]。因此,尽量减少可能结果中的错误引起的蛋白质的电泳淌度的变化,通常使用一个EOF标记。在这个工作中,乙酰苯胺,在生理中性pH值(7.4),用作EOF标记,流动比率的蛋白质和EOF标记(μ_普罗特/μ_eof)被用来衡量交互。为了减少蛋白质吸附和获得良好的互动效果,适当的清洗过程如上所述的清洗协议部分实施。

在最近的研究中,铁之间的互动^{3 +}离子和两个运输蛋白、转铁蛋白和apotransferrin,筛选,结果评估他们的交互流动比率与精确的结果。证实了一致的共价相互作用的存在改变了蛋白质的电泳迁移后与铁的交互^{3 +}离子(图2)。相互作用的强度计算流动比率的差异蛋白质相互作用前后金属离子(射频和国际扶轮、职责)规范化射频(∆R/射频;∆R=射频−国际扶轮)和置信区间(cnf),通过所述的计算方法Alhazmi et al。19]。即使是很小的改变蛋白质流动性足以检测到一个与金属离子配位,交互和Δ的计算值R/射频≥0.01无论是积极的还是消极的方向证明了一个重要的交互(19]。

转铁蛋白和apotransferrin与铁(III)离子,因此重复记录获得。金属离子浓度的5,10,25岁,50岁,100年,150年和250年μmol / L被用于研究和结果总结在表1和2。在每个金属离子浓度,12对蛋白质样品进行(6没有金属离子与金属离子和六个),和相应的流动性比率(射频和国际扶轮)计算。很明显从表1%相对标准偏差(%相对标准偏差)的交互作用对测试结果小于2%的蛋白质在大多数的金属离子的浓度,显示精度高的结果。调查中金属离子的浓度,显著(Δ绑定交互R/射频≥0.01)观察在50和100μmol / L与转铁蛋白,而在100年和250年的浓度更易与L, apotransferrin显示最高的交互。在其他浓度,金属离子表现出较弱的亲和力(ΔR/射频< 0.01)对两种测试蛋白质;然而,小得多的置信区间是观察到的所有检测金属离子的浓度。∆的正面和负面的迹象R/射频值记录在检查结果也很重要,因为他们可以给有价值的信息的协调与其他蛋白质结合金属离子残留和/或周围的离子在毛细管。一般来说,一个Δ的绝对值R/射频≥0.01足以检测到显著的交互作用(19,33]。更重要的是,对于一个重要protein-metal离子相互作用,的价值cnfΔ的R/射频不应该在Δ天桥零值吗R/射频±cnf。在正常情况下,一个积极Δ的价值R/射频实现因为总负责的蛋白质绑定后将获得更多的正(负)金属离子。然而,Δ的负值R/射频绑定时也可获得金属离子对蛋白质进一步协调互动与周围阴离子在中,这可能导致更少的积极(消极的)在蛋白质分子总负责。

如表所示2一些有趣的结果,测试蛋白质之间的相互作用与铁(III)离子。在低浓度(5、10和25μmol / L)的金属离子,微不足道的交互与转铁蛋白(ΔR/射频=−0.007,0.0012,和0.007−resp)和apotransferrin(ΔR/射频=−0.0024,0.0021,和0.0008−resp)观察。一个重要的铁(III)离子和转铁蛋白之间的相互作用被记录在50和100μ(Δmol / L的金属离子浓度R/射频= 0.0114和0.0201,分别地。),而测试金属离子表现出显著的结合亲和力apotransferrin在100年和250年μ(Δmol / L浓度R/射频=−0.0254和0.0205,分别地)。有趣的是,同时结合蛋白质表现出最强的相互作用100μmol / L铁(III)离子浓度。对于大多数的交互,负ΔR/射频观察值,表明该蛋白结合的金属离子与相邻的进一步协调阴离子存在于媒介而不是其他残留蛋白的结合位点,因此蛋白质的总负责获得更多负面的。此外,金属离子相互作用的高亲和性结合位点的氨基酸残基与其他也是可能的。Protein-metal离子复合物相互作用形成的一个以上的氨基酸残基,和金属离子结合位点可以确认使用核磁共振光谱和x射线晶体技术(34]。在50岁μmol / L的金属离子浓度,总负责在两个蛋白质与菲交互后变得更加积极^{3 +}Δ的离子,因此积极的价值观R/射频被获得。这可以解释,结合金属离子的数量协调与结合位点残留物是高于周围的阴离子。从消极到积极的Δ的变化结果R/射频值,反之亦然可能是由于多个金属ion-binding站点的可用性蛋白质具有不同的绑定属性。除了在迁移时间变更,轻微的变化大小和形状的山峰由于protein-metal离子复杂也记录在特定的金属离子浓度。这可能是由于在蛋白质结构构象的变化与金属离子(Fe互动的结果^{3 +})。峰的形状变化也可能归因于pH值的变化或介质的离子强度31日,32]。

3.2。动力学结合常数

菲在确认重要的共价相互作用^{3 +}和测试蛋白质相互作用的结合常数。四个数学上绘制模型被用来估计ligand-biomolecule相互作用的结合常数,非线性回归,X-reciprocal Y-reciprocal,双重相反方法如方程所示(4)- (7)[22,35]:(一)非线性回归: (b)X-reciprocal: (c)Y-reciprocal: (d)双重相反: 在哪里K结合常数;c(l)是微摩尔的配体(金属离子)的浓度;射频和国际扶轮流动比率的蛋白质配体相互作用前后(金属离子)的毛细管,分别;钢筋混凝土代表了在饱和配位体浓度分析物蛋白质的迁移率。所有这些策划方法有不同的统计处理数据如表所示3。因为配体特别是金属离子可以绑定多个目标网站蛋白质,1:1结合化学计量学是不常见的。因此,在筛选绑定使用ACE蛋白与金属离子相互作用技术,非线性回归分析发现最合适的方法。此外,在高手分析,评估协会和离解常数随机误差不敏感而使用非线性回归方法。文献还透露,笨重的加权回归过程中避免了非线性回归方法,这是必要的统计分析的三种方法(线性化的情节)36]。因此,在目前的调查,估计的非线性回归方法用于绑定常量。

金属离子浓度范围内的5 - 250μmol / L被用来计算结合常数。如表所示3,绑定常量可以使用计算钢筋混凝土饱和蛋白质的迁移率,以最高的金属离子浓度。一个铁^{3 +}250年离子浓度μmol / L用于转铁蛋白和apotransferrin。在250获得的流动性比率μmol / L菲^{3 +}浓度是用于非线性回归分析,结合常数计算18.968更易⁻¹和−13.6031更易⁻¹分别为转铁蛋白和apotransferrin。(之间的绑定情节被吸引射频−国际扶轮)/ (国际扶轮−钢筋混凝土)和配体(金属离子)的浓度(22,35),然后相互作用的进展分析使用各自的绑定曲线。有趣的是,菲^{3 +}观察离子与两个测试不同蛋白质(图3)。Δ的讨论R/射频、价值观、结合常数的积极和消极的迹象是归因于金属离子的行为在不同的结合位点的检测蛋白质和额外的协调与周围背景离子。的正面和负面的值绑定常量指示的方向结合金属离子和蛋白质之间的相互作用。负号并不意味着值小于零,被视为noninteraction。因此,绑定常量值可用于protein-metal离子相互作用的特征22]。非线性回归曲线显示,与铁转铁蛋白表现出无足轻重绑定交互^{3 +}在初始浓度(5、10和25μmol / L),而线性增加亲和力是观察到金属离子浓度的50和100μmol / L和积极价值的结合常数(18.968更易⁻¹)。另一方面,一个负值的结合常数(−13.603更易⁻¹)是获得铁之间的互动^{3 +}和apotransferrin。在初始金属离子浓度(5μmol / L),一个积极的和绑定略强于转铁蛋白在apotransferrin,虽然它改变了- 10μmol / L和积极的在25岁μmol / L。最后,金属离子之间的亲和力和apotransferrin在100年和250年大幅增加μmol / L金属离子浓度,绑定模式转移到一个更少的负方向。不同的绑定常量的迹象,apotransferrin积极转铁蛋白和消极,不恒等的绑定模式曲线可以归因于不同的目标蛋白质绑定网站测试。非特异性结合位点的检测金属离子结合转铁蛋白(特定的绑定网站已经被菲^{3 +}),而具体的和非特异性结合位点的apotransferrin导致铁的不同交互行为^{3 +}在两个测试蛋白质。

总的来说,使用快速筛选的归一化差异流动比率是不够的研究和比较金属离子的结合蛋白质。因此,在目前的研究中,快速筛选方法显示不清楚测试蛋白质和铁之间的绑定结果^{3 +}。观察一个微不足道的绑定交互低铁(III)离子浓度与检测蛋白质。转铁蛋白表现出更强的亲和力在中等浓度(50和100μmol / L),而apotransferrin发现显示更强的交互在更高的金属离子浓度(100年和250年μmol / L)。交互行为变得更加明显的相互作用的动力学研究。绑定常量和曲线的计算模式之间的相互作用的蛋白质和铁(III)离子显示,金属离子与蛋白质绑定方面表现出显著的关联性;然而,它表现的差异不同的可用性的特定蛋白质结合位点。

4所示。结论

在目前的研究中,共价相互作用的两个重要金属运输蛋白质和铁(III)离子使用ACE技术调查。在分析过程中,内心的毛细管壁是间歇性再生通过应用适当的洗涤协议,低电压应用于减少焦耳热,和使用短毛细管提供了一个快速和准确的分析。快速筛选方法是基于计算流动比率(∆的归一化差异R/射频)的蛋白质和电渗流量标记,代表绑定结果(∆的值R/射频≥0.01意味着重大的绑定)。转铁蛋白表现出显著的绑定交互在50和100μmol / L的铁(III)离子浓度,而apotransferrin展现出非凡的亲和力在100年和250年的金属离子μmol / L浓度。两种蛋白质显示较低的金属离子浓度(做些微不足道的亲和力μmol / L)。此外,绑定常量的交互测试的蛋白质和铁(III)离子估计获得更全面的了解金属离子的亲和力的蛋白质。绑定常量18.968更易⁻¹和−13.603更易⁻¹/ L与转铁蛋白铁(III)离子相互作用和apotransferrin,分别。的正面和负面的价值绑定常量表示铁的不同行为^{3 +}离子与转铁蛋白和apotransferrin,这可能是由于特定的可用性的差异和非特异性蛋白质结合位点。目前调查的结果建议使用动力学研究结合的快速筛选方法王牌技术了解蛋白质之间的相互作用和金属离子。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突与此相关的手稿。