在黑色素瘤BRAF:发病机理、诊断、抑制和抵抗

文摘

以来首次发现皮肤的黑色素瘤患者的一个子集港BRAF突变,大量的研究都集中在确定的病理后果BRAF突变,优化诊断技术来识别这些突变,并开发治疗性干预抑制这一目标在mutation-bearing肿瘤的功能。最近,进步已经革新了BRAF突变黑色素瘤患者的护理标准。本文概述了BRAF基因突变信号的致病性的影响,最新的分子检测方法检测BRAF突变,和最近的BRAF通路抑制剂黑色素瘤患者的临床资料,BRAF突变。最后,新兴BRAF抑制剂耐药机制和克服这种阻力的方法进行了讨论。

1。介绍

黑色素瘤是目前5日和7日在美国男性和女性最常见的癌症,分别为(1]。此外,黑色素瘤的发病率大幅上升在过去60年里,增长速度超过所有其他实体肿瘤(2]。虽然早期患者可以成功治疗大多数病人手术切除,许多会传播疾病。远处转移的黑素瘤患者的预后是惨淡的,尽管标准治疗,大于95%的四期黑色素瘤患者在5年内会死在一年内,大多数病人屈服。

最近,临床发现导致显著的进步的关键分子信号事件的理解底层黑色素瘤的发病机制。最值得注意的是,很大一部分肿瘤起源于melanocytic已被证明港激活BRAF突变,导致其本构活动。大约70 - 80%的收购melanocytic痣和40 - 60%的恶性黑色素瘤含有BRAF突变,绝大多数的结果在一个氨基酸密码子600 (BRAF换车^V600E)[3,4]。结果没有本构激活细胞外signal-regulated激酶(ERK)导致凋亡的促进细胞增长和反对,最终,转型为黑色素瘤(5]。这个增强的信号,然而,也呈现突变细胞容易受到小分子抑制剂的使用目标各种BRAF通路介质(5- - - - - -7]。

2。英国皇家空军信号和黑色素瘤的发病机理

生长因子受体及其配体之间的相互作用通常引发一系列事件,促进细胞的生长和存活。RAS家人gtpase充当关键调解人的转导信号。尽管拉起着重要的作用在正常细胞内稳态的营业额,死亡,和生存,在RAS激活突变的家庭成员(hra、喀斯特和国家管制当局方面)已确定和相关的各种人类恶性肿瘤(8]。在黑素瘤,国家管制当局方面突变已确定在10 - 25%的肿瘤样本,被认为是肿瘤形成的重要驱动力在这些病人9- - - - - -12]。瘤形成是通过upregulation几个下游信号介导的机制,尤其是增殖蛋白激酶(MAPK)和phophatidy-inositol-3-kinase (PI3K)途径13]。

RAS激活触发器MAPK途径激活通过与英国皇家空军癌基因蛋白相互作用(BRAF和CRAF)导致的起始progrowth信号级联(14]。目前尚不清楚是否BRAF或CRAF传输信号突变MEK国家管制当局方面,但大量的证据表明,CRAF是主要的中介(15]。RAF与MAPK / ERK激酶(MEK)从而激发MEK磷酸化反过来导致了激活ERK的磷酸化(14]。ERK的活化导致progrowth和转换信号,这似乎是许多恶性肿瘤的发病机制的关键。这个途径可以由皇家空军同种型,BRAF,或CRAF,尽管CRAF还有pro-survival效应,在一定程度上通过upregulation抗凋亡蛋白,核转录因子(NF -κBκB), B细胞白血病2 (bcl - 2)14]。有趣的是,不像CRAF,激活BRAF没有其他已知的基板。因此,BRAF突变黑色素瘤信号只通过MEK和随后ERK导致肿瘤形成。这一特点使这些肿瘤敏感能MAPK通路的抑制剂。

3所示。诊断/检测

自识别激活BRAF突变的黑色素瘤,检测技术都得到了极大的改进。标准的BRAF突变检测肿瘤组织通常利用技术,如双向直接荧光测序和allele-specific聚合酶链反应商用和提供高特异性。然而,这些检测的灵敏度是有限,他们只能检测到突变,如果肿瘤细胞构成> 5 - 10%的遗传分析的样品提交(16,17]。虽然这种程度的灵敏度通常足以检测BRAF的存在^V600E突变的肿瘤结节,这可能是不够敏感的背景检测一些肿瘤细胞基质或淋巴元素的比例高,浸润淋巴细胞,或外周血细胞。

一个问题关于利用突变检测技术与增强灵敏度是一个积极的测试可能会反映出检测突变细胞的一个小子集。虽然这可能有有趣的科学结果,肿瘤的临床相关性包含少量的BRAF基因突变细胞没有,因为这些病人不会将受益于BRAF抑制剂。这种担心是合理的,因为肿瘤异质性被描述在原发性黑色素瘤(18]。此外,BRAF突变被认为在绝大多数melanocytic痣,垂直增长阶段黑色素瘤、转移性黑色素瘤,他们很少在径向生长阶段发现黑色素瘤(10%),这被认为是最初的恶性病变前坦白地侵入性损伤(19]。这表明BRAF基因突变可能是一个收购事件在早期黑色素瘤导致克隆扩张和肿瘤进展。也不曾见过这样polyclonality跨多个网站在个人转移性肿瘤和肿瘤患者个体的样本(18,20.]。然而,增强敏感性突变分析的应用程序可能不只是测试肿瘤样本检测少量的代表等背景的非恶性的细胞的肿瘤细胞在淋巴结和外周血。

更先进的技术和分析开发提供敏感性的增加或消除需要更加敏感。这些新一代测试允许更精确的测试样品只包含少量的肿瘤,以及各外周血组件(即检测突变。淋巴细胞,单核细胞、血浆、血清)。这些测试的效用在黑色素瘤患者样本中已经探讨了不同的结果。

放大耐火突变系统(武器)是最近描述,allele-specific技术提高了灵敏度(能够检测突变突变细胞样品含有1%)相比,DNA测序标准的福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE) (21]。另一种方法大大提高灵敏度的突变检测是利用选择性扩增突变DNA / RNA的化验样本。使用allele-specific底漆和锁核酸引物,检测10黑色素瘤细胞1毫升的血液被描述(22]。第三种方法来增加突变的敏感性检测报告能够检测一个突变的细胞在一千年nonmutant细胞,利用独特的限制性内切酶位点的野生型等位基因可以消化的野生型等位基因的浓缩,因此突变等位基因(23]。最后,整合COLD-PCR导致近一倍,检测的灵敏度BRAF突变从FFPE组织当使用标准测序和焦磷酸测序24]。

除了新技术(武器)和修改常规技术导致突变检测的敏感性,更大的应用标准化验之前未测试的样品也在改变我们的方法BRAF测试。BRAF自由在血清和血浆DNA分析报告从孤立的BRAF基因突变的检测,循环肿瘤细胞(ctc) [25- - - - - -30.]。虽然CTC,血清和血浆BRAF分析可能出现,它尚未决定是否将常规临床使用的一个或多个这些化验或如果这仍将只是一种实验方法。

而标准的作用和分子诊断试验被用来识别特定的突变(即感兴趣。,BRAF^V600E),无论是在组织或血液,它也可能是值得的为其他突变和异常测试这些可能表明一个特定治疗的敏感性。例如,Sequenom MassARRAY技术被用来查询致癌突变的大板,使用引物延伸反应之后,质谱检测产品和识别突变与潜在的临床后果31日,32]。阵列比较基因组杂交(aCGH)提供了机会来检查整个基因组拷贝数的变化,包括放大和删除可能带来对靶向治疗(33]。然而,所有这些技术显然是有限的,他们只能识别,预选的异常。全基因组分析(WGA)有可能不仅巩固全部或大部分这些模式和测试一个技术平台,也确定额外的外遗传变化这些其他化验的设计参数34]。编剧还提供机会发现未知的(可能不同)黑色素瘤基因的突变,探讨是否特定的突变或多态性可能预测(即受益于一个特定的治疗。BRAF抑制剂,HD - 2) [35]。不过,这些“新一代”测试的临床效用在黑色素瘤患者的护理是完全未知的。

4所示。抑制剂的英国皇家空军信号(少更具体的BRAF基因突变、CRAF MEK,也许提到ERK抑制剂)

一系列小分子抑制剂的开发目标,与不同的选择性,野生型BRAF BRAF^V600E,其他BRAF基因突变(在600年和601年的位置),和CRAF。此外,抑制剂RAF下游介质的活化,即MEK和兵,也在不断发展着。在本节中,只有代理已被临床试验和公开报道进行了综述。

5。BRAF抑制剂

5.1。索拉非尼

索拉非尼,一个多目标BRAF的酪氨酸激酶抑制剂,CRAF,血小板源生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR) 2, p38和CKIT是第一个RAF-inhibitor积极研究黑色素瘤患者是用于第二阶段测试在同年BRAF突变是首次报道。不幸的是,尽管在许多第一阶段评估,II, III研究作为一个代理,结合化疗,索拉非尼的临床效用一直令人失望。例如,在一个单一的代理索拉非尼,黑色素瘤患者的中位无进展生存(11周36]。6个病人(16%)有稳定的疾病在6个月时,在某些情况下持续超过12个月。然而,只有一个37岁的病人在研究中有一个实际响应评估标准在实体瘤(RECIST)定义肿瘤反应。

这个研究是紧随其后的是索拉非尼的几个试验结合各种细胞毒性药物,虽然最好的结合研究是索拉非尼,卡铂和紫杉醇(37- - - - - -42]。最初的承诺中描述了这一方案的第一阶段试验索拉非尼联合卡铂和紫杉醇在实体肿瘤患者,24的晚期黑色素瘤患者在哪里注册(39]。十黑素瘤患者(42%)获得一个客观的反应,和一个额外的11个患者(46%)有基于RECIST稳定的疾病。中位无进展生存期是43.7周。这些有前途的结果导致了三期临床试验比较卡铂/紫杉醇±索拉非尼在黑色素瘤患者temozolomide或DTIC治疗后进展。这个试验研究(棱镜)招收了270名患者和没有好处的索拉非尼在这个二线卡铂和紫杉醇的患者人群(40]。卡铂和紫杉醇和索拉非尼也与卡铂和紫杉醇治疗天真的晚期黑色素瘤患者的人口安慰剂对照随机III期试验中执行美国群际(E2603)。这个试验共招收了800名病人,发现没有好处的索拉非尼在PFS中值或OS (41]。

5.2。高效力BRAF抑制剂(PLX4032, GSK2118436)

无效的一个主要的解释提出了索拉非尼在黑色素瘤患者作为一个代理是其无法完全抑制BRAF,特别是BRAF V600E突变包含。其他BRAF抑制剂,如plx - 4032和GSK2118436,开发并更有效和选择性突变BRAF抑制剂比索拉非尼(6,7]。这个增强的抑制BRAF^V600E可以预见的是,导致提高这些药物的临床活动而索拉非尼。

5.3。Vemurafenib

Vemurafenib是第一个高效力BRAF抑制剂完成第一阶段测试和显示显著的临床效益(42]。第一阶段试验的PLX4032, 11的16 BRAF肿瘤患者轴承^V600E突变接受剂量≥240毫克每日两次剂量升级阶段经验丰富的肿瘤反应虽然没有野生型患者临床反应被认为在五BRAF-containing肿瘤。此外,26 BRAF的32名患者(81%)^V600E突变体在扩大群黑色素瘤治疗建议二期剂量960毫克每日两次的临床反应,包括两名患者达到完全缓解(CR)。估计平均PFS是七个月以前与可用的治疗转移性黑色素瘤。进一步,vemurafenib治疗导致的减少水平的磷酸化ERK(活跃)包含BRAF的肿瘤^V600E突变,与临床反应(43,44]。可能,这种抑制福利提高的拼接proapoptotic bcl - 2家族成员BRAF的BIM从而促进细胞凋亡^V600E细胞(45]。

这些发现迅速导致了快速权责发生制的单二期研究(BRIM2)和随机对照III期试验(BRIM3)。二期试验招收了132名晚期黑色素瘤患者治疗之前曾收到一个。客观缓解率(ORR)与CR率为5%,53%和无进展生存期是6.7个月(46]。在第三阶段试验中,675名晚期黑素瘤的患者被随机分配,vemurafenib或达卡巴嗪作为一线治疗(47]。在第一个临时分析,vemurafenib与治疗显著降低死亡的风险和死亡的风险(减少63%)或疾病进展(减少74%),以及更高的奥尔(48%比5%)。这些发现是FDA批准的基础vemurafenib 2011年8月。

5.4。GSK2118436

GSK2118436是第二个更高的效力BRAF抑制剂已显示大量的临床活动。在I / II期临床试验,类似PLX4032, BRAF的患者^V600E突变在两个最高剂量水平(每天两次150毫克和200毫克每日两次)有高反应率(10/16的病人,63%)48]。八non-BRAF患者^V600E突变(V600K V600G和K601E)治疗的剂量≥100毫克每日两次,三个部分反应。两个BRAF患者^K601E进展后首先挑起,这表明只有BRAF基因突变的患者在600年的位置将如何应对治疗。

6。MEK抑制剂

MEK抑制剂,RAF激活下游中介,唯一已知基质BRAF显示承诺在黑色素瘤的临床前研究,已开始调查在诊所与一些令人鼓舞的结果。MEK抑制剂BRAF患者也可能是最有用的^V600E突变;突变状态与反应强烈相关MEK小鼠黑色素瘤的抑制异种移植模型(49]。

6.1。AZD6244

两个阶段我AZD6244涉及晚期实体肿瘤患者的试验显示该代理耐受性良好,拥有一些黑色素瘤患者的抗肿瘤活性50,51]。在第一个试验中,三个八晚期黑色素瘤患者AZD6244取得了局部反应;BRAF和国家管制当局方面突变状态是不可用的50]。而在第二阶段我研究,只有一个反应是在14黑色素瘤患者,尽管这个主题有一个记录BRAF突变和一个完整的响应进行了两年多在刚出版的时候51]。

此外,AZD6244展示了有前景的结果在小鼠模型中,特别是在结合化疗,为组合试验(52]。建筑在这,AZD6244达卡巴嗪相结合的初步研究,多西他赛,或者temsirolimus晚期黑色素瘤患者进行(53]。十八岁患者在BRAF和国家管制当局方面对待突变状态是已知的。临床反应是在5个9的BRAF突变患者(55%),而没有任何反应出现在九个病人没有BRAF突变患者包括四个国家管制当局方面的变异。此外,时间进程显著改善患者BRAF突变相比,这些患者没有(平均31周和8周)。

6.2。GSK1120212

GSK1120212是可逆的,选择性抑制剂MEK1 / MEK2已表明,在第一阶段试验中,晚期患者的单药疗效,BRAF^V600E突变黑色素瘤(54]。具体来说,八20 BRAF突变黑色素瘤患者接受GSK2110212证实反应有两个病人实现CR。有趣的是,两个22野生型患者BRAF公关与治疗,表明一些黑色素瘤肿瘤是依赖ERK / MAP激酶信号尽管缺乏BRAF突变。

6.3。pd - 0325901

第一阶段试验的pd - 0325901为48的晚期黑色素瘤患者,其中3例(6%)有一个确认的公关,10例(21%)有稳定的疾病≥4个月,总共15(31%)患者显示减少ki - 67肿瘤染色(55]。突变分析这些患者没有提供的数据。

6.4。AS703026

AS703026最近报道了类似的结果,这是一个强有力的MEK1/2抑制剂。在第一阶段的研究中,8例患者三个部分反应与治疗两种治疗时间表(56]。黑色素瘤患者的突变状态并没有报道。

虽然MEK抑制剂的临床数据是令人鼓舞的,是非常初步的。这些代理的真正价值必须等待第二阶段和第三阶段试验BRAF突变黑色素瘤患者。目前正在进行的一个试验是随机的,GSK1220212与化疗的III期试验(达卡巴嗪或紫杉醇)黑色素瘤患者窝藏BRAF突变(NCIT01245062)。

7所示。新兴抗BRAF抑制机制

重要的是,绝大多数患者单药plx - 4032最终将表现出疾病进展,尽管成功抑制BRAF^V600E和高速率的客观反应早期的治疗。初步研究表明,抵抗plx - 4032与发展的第二个突变损害绑定BRAF的治疗药物,靶向治疗的耐药机制指出nonsmall细胞肺癌等恶性肿瘤,慢性粒细胞性白血病,胃肠道间质瘤(57- - - - - -59]。相反,阻力是由激活MAPK通路在大多数肿瘤通过替代手段。

它是BRAF的体外研究^V600E突变细胞生成展览获得抗病性BRAF抑制剂,这导致了第一个线索如何BRAF-mutated BRAF抑制细胞能够生存。似乎表明,重建MAPK信号是关键变量获得抗病性BRAF抑制(60- - - - - -63年]。这可以通过upregulation受体酪氨酸激酶(即。、PDGFRB ERBB2) (61年,62年),RAS激活(60,62年),upregulation CRAF [61年,63年),对丝氨酸/苏氨酸的激活MAPK激酶(COT) [61年],MEK(二次激活突变的发展64年,65年]。此外,通过PI3K信号通路由胰岛素生长因子受体1 (IGF-1R)是另一种获得性耐药机制也被描述(66年]。值得注意的是,这些机制进行了调查和证实在小数量的肿瘤患者活检样本执行时的阻力,并依赖这些调节或突变信号介质没有演示。

主要阻力BRAF抑制在不到10%的患者BRAF突变黑色素瘤治疗vemurafenib [42]。虽然没有临床样本的数据有助于确定哪些患者可能受益于BRAF抑制剂,临床前研究表明,预处理CRAF水平升高,同时,基线CCND1放大肿瘤,导致下游超表达的细胞周期蛋白D1和增强到表情,是有前途的预处理生物标记值得进一步调查(63年,67年]。

在BRAF野生型(BRAF^WT)黑色素瘤细胞MAPK激酶途径激活vemurafenib(以及类似的PLX4720)导致upregulation MEK和ERK和增强扩散68年,69年]。这似乎是次要CRAF随后的激活下游信号通过MEK和ERK BRAF预期致癌的后果^WT细胞(69年]。进一步,这CRAF似乎是通过介导的激活BRAF的异质二聚体的形成^WT蛋白质和/或CRAF为最明显的表现在RAS-mutated细胞(70年,71年]。此外,PLX4720增强了凋亡bcl - 2家族成员蛋白mcl1水平国家管制当局方面突变黑色素瘤细胞通过加强通过MAPK信号通路(72年]。而很明显,CRAF激活和增强MAPK通路信号发生在BRAF^WT黑色素瘤细胞(尤其是那些港口国家管制当局方面突变)处理BRAF抑制剂vemurafenib和PLX4720等,这是不确定的临床意义。具体地说,它不认为临床上vemurafenib获得性耐药,例如,发生完全是因为增长BRAF的子集^WT黑色素瘤细胞作为BRAF的持久性^V600E突变已被确定在所有肿瘤的分析和报告。事实上,似乎存在BRAF的具体变化^V600E突变细胞允许适应导致恢复增长尽管BRAF持续抑制。

8。未来的发展方向

建立单选择性BRAF抑制剂的功效,并在较小程度上MEK抑制剂,是一个重大突破,BRAF突变患者积极的黑色素瘤的治疗。尽管大多数患者这些代理预计进展治疗,上述说明的耐药机制有助于指导今后的顺序和组合疗法。基于发现MAPK途径活性选择性抑制BRAF后黑色素瘤,重新激活第一个选择性BRAF抑制剂的组合试验(GSK2118436) MEK抑制剂(GSK1120212)正在和容许与特工出现在他们的标准单剂量(73年]。除了这个组合,试验与选择性BRAF抑制剂结合或随后IGF-R1拮抗剂和其它受体酪氨酸激酶抑制剂可能预期结果的临床前模型的电阻(61年,62年,66年]。

另一种方法来提高选择性BRAF抑制剂的有效性和MEK抑制剂的特工可能增加细胞凋亡。这样一个代理abt - 263这是BH3-mimetic目前在临床的发展。在临床前研究中,生物有效性越少同源BH3-mimetic abt - 737结合MEK抑制剂导致增强的杀伤力相比,要么独自代理(74年]。是否abt - 263结合MEK或选择性BRAF抑制剂将改善临床结果是未知的,尽管它可能是值得探索的早期阶段的临床试验。

除了与分子靶向药物联合治疗,抑制信号诱导选择性BRAF抑制或促进细胞凋亡,另一个有前途的方法来最大化BRAF的利益或MEK抑制剂与免疫治疗结合这些代理。最近,免疫抑制剂检查站,包括anti-CTLA-4单克隆抗体ipilimumab和anti-PD单克隆抗体mdx - 1106,显示单药疗效转移性黑色素瘤患者(75年,76年]。重要的是,它似乎PLX4032并不影响人类淋巴细胞(t细胞)功能而MEK抑制剂做(77年]。此外,vemurafenib有增强机体免疫识别抗原T细胞的黑色素瘤(78年]。这些发现提供了一个理由一项研究评估选择性抑制BRAF的安全性和有效性结合免疫疗法,包括MDX1106,可能大剂量IL2 ipilimumab。

9。结论

它多年来一直希望越来越理解分子途径参与黑色素瘤的发展和日益普及的特定抑制剂的这些途径将使未来治疗的合理开发。vemurafenib的出现和GSK2118436,第一个分子靶向制剂导致肿瘤的反应在一个大比例的患者,一种新的黑色素瘤的治疗方法已经开始。因此,所有的晚期黑色素瘤患者应该有BRAF突变分析系统性治疗开始之前。在这些港口BRAF基因突变导致的肿瘤患者有效,每次应治疗这些患者的两个非常强大的BRAF抑制剂。此外,随着越来越多的了解了BRAF抑制剂耐药机制,结合试验新型分子靶向治疗的发展可以预期;进一步的临床改善只能解决通过仔细进行临床前和临床研究,包括预处理和治疗活检。BRAF被确立为第一点的脆弱性在黑色素瘤,希望在分子水平上了解的局限性的BRAF抑制将导致进一步的临床受益。

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