文摘
黄连(黄连全球法语)是一种重要的药用植物。然而,它的临床安全是影响高镉(Cd)和铬(Cr)的水平。了解重金属的积累模式和解毒机制,如Cd和Cr、调控是重要的交通和减少他们的积累在植物。自由氨基酸(FAAs)、金属硫蛋白和化学形式的重金属与重金属积累和解毒机制密切相关。在目前的研究中,我们评估的Cd和Cr黄连和FAA水平的变化特征,CcMT2、金属硫蛋白基因表达在Cd和Cr的压力下,Cr黄连的化学形式的各种组织。大多数的Cd和Cr是保留在根;这可能是宽容策略利用黄连保护地上光合组织。化学连续萃取法是利用分析化学形式的Cr和草酸的结果表明,Cr主要是固定在所有组织,Cr治疗之后,Cr往往与磷酸结合,形成不溶性复杂,降低铬的毒性和生物利用度黄连。Cd和Cr的积累与缬氨酸显著正相关,组氨酸、酪氨酸、丝氨酸苏氨酸,水平和显著负相关与谷氨酸和丙氨酸的水平。Cd胁迫下脯氨酸含量的变化是不同的,在Cr的压力。法斯可能会影响的积累通过各种解毒和抗Cd和Cr策略,如螯合重金属离子和转换成所需的产品。此外,CcMT2被孤立的第一次,发现叶居多。CcMT2Cd和铬胁迫下诱导植物组织,表明其作用和宽容Cd和Cr的积累。
1。介绍
土壤中重金属的积累由于各种工业活动对环境有负面影响,农业,和人类健康1,2]。在各种重金属,镉(Cd)和铬(Cr),特别是在铬(VI)的形式,经常发现在耕地有毒植物的生长,对人体健康构成风险通过吸收和积累在食物链3,4]。尽管Cd为植物的生长和新陈代谢和Cr是不必要的,他们可以通过转运蛋白在植物组织中积累与必需营养素或非选择性通道(5- - - - - -7]。进入工厂后,Cd和Cr造成缺陷的植物生长刺激生产活性氧(ROS);破坏DNA,蛋白质,和质膜完整性;引发脂质过氧化;取代从转录因子和酶辅助因子;和诱导各种生理和超微结构的变化8- - - - - -11]。食用被污染的植物与Cd会导致肾损伤、骨质疏松、糖尿病、心血管疾病、神经损伤和癌症(12]。同样,Cr是剧毒生物和已知产生致癌和致突变的影响4]。
工厂开发了通用的机制来容忍某种程度的重金属污染。这些机制包括细胞排斥,各自为政,封存,抗氧化剂生产,通过特定的螯合配体(6,13]。金属硫蛋白(MTs) cysteine-rich蛋白质广泛分布于微生物、植物和动物(14]。MTs无处不在的重金属螯合剂和金属离子稳态中发挥关键作用和解毒15]。植物MTs可以分为四个亚科基于分布的半胱氨酸残基的氨基和羧基末端区域(16]。据报道,不同的MT基因表现出不同的组织表达植物(17]:MT1亚基因表达的主要根源,是亚基因在叶子,MT3亚基因在成熟叶和成熟水果、和MT4亚基因在种子18]。太蛋白质低分子量(Mw),通常7 - 8 kDa,和高半胱氨酸水平(20% - -30%),有助于有效的螯合重金属产生的化合物的sh组和封存(19]。一般来说,重金属诱导MT合成毒性反应(8]。因此,MT含量和/或MT基因是生物体中重金属积累的潜在生物标志物和宽容(20.]。在接触金属,植物通常合成一系列不同low-Mw物质,特别是具体的自由氨基酸(FAAs)称为溶质兼容。法斯作为信号分子在植物和各种重要角色作为osmolytes,激进的食腐动物,监管者离子运输和调节器的气孔开放重金属解毒(13,21]。谷氨酸(Glu),脯氨酸(Pro)和组氨酸(他)也发挥功能作用在金属宽容和解毒的植物(13]。氨基酸结合各种通过螯合金属离子,半个包括氨基(nh2)羧基(羧基)、羟基(-哦),和硫醇(sh)组,所有的捐赠和复杂稳定的能力(22]。值得注意的是,氨基酸是重要的合成谷胱甘肽(GSH)和转移(pc),这是有效的重金属螯合配体在植物细胞(23]。化学形式的重金属植物的内部机制中扮演很重要的角色,传授预防重金属毒性(24]。金属离子吸收植物可以被转换成不同的化学形式,确定他们的机动性和毒性(25]。转化为无毒的化学形式是另一个重要的策略采用植物缓解重金属毒性(26]。Cr生物利用度较低的化学形式已被证明与不溶性磷酸化合物或草酸集成,从而导致金属宽容和解毒(27]。
黄连(黄连法语。)是最重要的一个传统药用植物在世界范围内(28]。其活性成分包括生物碱化合物,具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤属性(29日]。然而,高水平的Cd和Cr在黄连对其临床安全造成负面影响30.- - - - - -32]。值得注意的是,黄连对Cd[有很强的富集效果33]。在正常情况下,植物保留< 1μg g−1Cr (9];然而,Cr水平黄连一般> 1μg g−1(34]。调节,减少吸收Cd和Cr的黄连,重要的是要理解吸收,运输、积累,和这些重金属的解毒。分布模式和化学形式的重金属,法斯,在植物组织中MTs可能反映重金属积累和解毒过程(20.,21,35]。在先前的研究中,我们调查了亚细胞和组织分布的Cd和Cr黄连(30.,34]。然而,法斯的角色、MTs和黄连化学形式仍不清楚。为了解决这些研究空白,本研究旨在(1)评估Cd和Cr吸收由黄连、(2)分析Cr的化学形式,(3)描述法斯水平变化在黄连Cd和Cr的压力,和(4)隔离CcMT2并评估其表达谱在不同组织和Cd和Cr的压力。
2。材料和方法
2.1。植物材料和水培条件
植物和根际土壤样本收集从六个乡镇(Xiaoshuhe华平,不要说,中宝,宋庆龄和Ganzhouhe)镇坪县,陕西省,是黄连的主要生产地区之一在中国。洗净晾干植物样本,以方便检测Cd和Cr。被允许干自然和去除杂质后,土壤样本经过100 -孔筛。
水培植物被用来确定不同的化学形式的Cr和检测FAA在Cd和Cr压力的变化。黄连植物从镇坪县,收集中国陕西省。所有植物都在相似条件下培育水产在黑暗和充气容器在溶液中含有以下成分:2毫米2 +,3.5毫米K+1毫米毫克2 +,7毫米3−,0.5毫米2阿宝4−,1毫米42−,10μM H3薄3,0.1μM CuSO4,5μM MnSO4,0.5μM ZnSO4,0.1μM CoCl2h·62啊,0.1μ米纳2MoO4h·22啊,和20μM Fe-EDTA。驯化后4周,植物被暴露于0或100μM Cd,或500年μM铬(VI)在水培营养液。Cd和Cr治疗水平测定结果的基础上以前的pre-experimental研究(见补充信息(可用在这里))。每个治疗了三个复制15植物。植物收获后暴露于重金属在0 h(对照组,CK), 24 h (Cd24h和Cr24h)后,10天后(Cd10d和Cr10d)。植物被种植在自然光下,日夜温度25°C / 20°C和日夜相对湿度70% / 85%;每3天的营养解决方案是重新,维持在pH值 。
叶、根状茎和根的黄连进行分析CcMT2。水培植物材料被用于分析CcMT2表达Cd和Cr后治疗。水培条件下和治疗水平的Cd和Cr和前面描述的一样。对待样本(0,2、4、8、12、24和72 h和重金属后10天的压力。所有收集的样本立即在液态氮冷冻和储存在−80°C到分析。
2.2。Cd和铬浓度测定
根和根状茎的植物收集EDTA-Na浸泡在20毫米2为15分钟使解除吸附surface-adsorbed金属,然后用去离子水清洗三次。Cr和Cd水平评估根据先前所描述的方法(30.]。短暂,所有的植物和土壤样品干燥恒重,在微波消化(使用HNO火星5,杰姆,美国)3/小时2O2( ),然后站在一夜之间。样本消化直到液体无色透明的。黄连的Cd和Cr水平组织和根际土壤样本检测使用电感耦合等离子体质谱法(icp)(瓦里安icp - 820 ms,瓦里安,帕洛阿尔托,CA,美国)。
对于icp分析,0.5 g的样本准确称重聚四氟乙烯消化容器。接下来,3毫升的集中HNO3和1毫升的H2O2(30%)被添加,混合物被允许站在一夜之间。血管被关闭,放在微波炉的旋转转盘(美国火星5,CEM)和消化在120°C 5分钟,5分钟160°C, 180°C 25分钟,15分钟斜坡对温度的最大功率1000 W 30分钟和0 W为冷却15分钟。每个样品都准备一式三份。冷却后,体积小的解决方案被蒸发,然后转移到50毫升容量的玻璃瓶。接下来,0.5毫升HNO3添加之前调整最终的体积与高纯去离子水50毫升。离子透镜设置,喷雾器气体流量,火炬icp的位置进行了优化研究元素的离子信号最大化同时减少背景信号。氩气利用光谱纯度(99.9998%)。认证标准参考材料(SRM) NIST 1570 1547微量元素在菠菜叶和NIST桃叶(国家标准与技术研究院,NIST,盖瑟斯堡,医学博士,美国)被用来评估方法的准确度和精密度。
生物浓缩因子(供应量)描述了植物积累重金属从土壤的能力,而易位因子(TF)表明植物的潜在可能促使金属从根到天线部分。这些因素计算使用以下公式(9]:
2.3。提取不同的化学形式的Cr
先前的研究已经确定了六个化学形式的Cd (30.]。这里,我们利用化学连续萃取法(36,37)分析化学形式的Cr。Cr的六个形式是按照以下顺序提取使用特定的解决方案:(1)80%的乙醇提取无机铬(FE);(2)去离子水(d - h2O)中提取水溶性的Cr (FW);(3)1 M氯化钠提取果胶酸盐和protein-integrated Cr (F生理盐水);(4)2%醋酸(HAc)提取不溶性Cr-phosphate复合物(FHAc);(5)为0.6 M盐酸提取草酸Cr (F盐酸);(6)剩余Cr (FR)。冰冻的根、根茎和叶子组织均质使用上述提取解决方案( )然后动摇了22 h 25°C。匀浆离心机在5000克10分钟,第一个浮层。沉积物被re-extracted两次使用相同的提取方案和动摇为2 h 25°C。然后三个上层清液池,沉积物提取使用下一个解决方案序列后的溶剂。所有痛苦都遵循相同的步骤和时间用于执行第一个提取。每个池上层清液解决方案的一部分,剩余分数被干恒重,在微波炉使用HNO消化3/小时2O2( )。最后,利用icp Cd和铬含量检测。
2.4。联邦航空局水平的测量
胞内FAA水平进行分析(如前所述)(3]。短暂,100毫克的冻干叶,根样品粉末,彻底混合了2% (w / v)磺基水杨酸的解决方案。匀浆离心机在200 g在室温下2小时然后离心机10000克15分钟。使用0.22 -后过滤μm膜,上层清液准备FAA分析使用l - 8900型氨基酸自动分析仪(日立,东京,日本)。分析条件如下:阳离子交换柱, ;分离柱温度、57°C;反应柱温度、135°C;流量的缓冲和茚三酮0.35毫升分钟−1;双通道紫外检测波长440 nm和570 nm);和注射体积,20μl
2.5。金属硫蛋白基因的克隆
2.5.1。RNA隔离和第一链互补脱氧核糖核酸的合成
总RNA从冷冻分离植物组织总RNA隔离使用平台工具包(DP441, TIANGEN生物科技有限公司,北京,中国)。RNA纯度验证了使用纳米降nd - 1000分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。隔离后,进行互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript™RT试剂盒(豆类生物有限公司、志贺、日本)后,制造商的指示。由此产生的产品是储存在−20°C到进一步使用。
2.5.2。基因分离和生物信息学分析
以下具体的引物设计根据发布的金属硫蛋白基因的长度黄连粳稻(AB257869.1):向前(Fw)底漆:TCGTGTAATCCCTCTGCATTTCCA和反向(Rv)底漆:CTCTTAACACTCCCAGGGCTCAG。放大模板用于本研究互补DNA(互补),反向通过从黄连中提取的RNA转录。聚合酶链反应(PCR)是根据制造商的指示执行。PCR产品然后使用DNA凝胶凝胶纯化提取工具包(美国GAωBio-Tek, Norcross)后,制造商的指示。接下来,净化产品被克隆到一个pMD18-T向量(豆类生物有限公司、志贺、日本)测序。ORF-finder和GENSCAN Web服务器是用来确认开放阅读框(ORF)。理论等电点(π)和使用π/兆瓦兆瓦预测工具ExPASy服务器上(http://web.expasy.org/computepi/)。系统发育树使用大型X自由软件,生成和neighbor-joining方法使用1000引导程序执行复制。其他物种的氨基酸序列从NCBI数据库下载。
2.6。实时定量PCR(存在)的分析
执行中存在使用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。25 -μ12.5 L反应混合物中μL (SYBR®预混料交货Taq™(豆类生物有限公司、志贺、日本),2μL的正向/反向引物2μL (cDNA模板,和6.5μL核糖核酸酶免费的H2o . PCR设置如下:95°C 30年代,紧随其后的是40周期为5 s在95°C,和58.5°C 30年代。这个程序之后,融化曲线分析(65°C - 95°C,随温度增加0.5°C每5 s)。的β肌动蛋白基因作为内生控制。弗兰克-威廉姆斯和房车引物CGCAGGAAAGTGTGGTTGTGGTGA TACTTCTTGCACCCAGCGCAGCT,分别。
2.7。统计分析
相对基因表达水平计算使用δCt (2−△△Ct)方法。数据比较使用单向方差分析之后,最显著的差异测试。皮尔森相关分析是用来研究变量之间的关系。 被认为是具有统计学意义。所有统计分析使用SPSS 23.0版(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL),和数据使用GraphPad棱镜6创建软件(美国圣地亚哥GraphPad软件)。
3所示。结果与讨论
3.1。Cd和Cr的黄连和根际土壤
世界卫生组织和绿色行业标准对进出口的药用植物和准备建立了Cd在中药材的最大容许极限0.3毫克公斤−1(38]。黄连的根状茎是主要的药用植物的一部分。如表所示1、Cd水平在大多数植物的根状茎> 0.3毫克公斤−1。此外,在所有发现的Cr含量黄连根茎是高于一般观察植物(< 1μg g−1)[9]。这些结果表明,高水平的Cd和Cr积聚在黄连。不同的植物组织有不同的重金属积累能力。一般来说,重金属的分布在植物的不同部分是根据以下模式:叶<粉末<根。正如预测的那样,根部积累较高的Cd和Cr比其他植物组织、Cd和Cr水平最高的观察是6.89毫克公斤−1和4.47毫克公斤−1分别为(表1)。此外,Cd和Cr的TF值< 1。这些结果证实,黄连积累高水平的Cd和Cr的根源。这些结果还建议Cd和Cr保留在根长途易位根的根状茎和叶,表明根作为一个有效的障碍Cd和Cr易位(39]。高镉和铬水平在其他植物的根,已报告等各种aquatica,茄属植物lycopersicum机,Brachiaria mutica,Leptochloa fusca(9,40,41),只有一小部分重金属转移到地上部分。保留高重金属,如Cd和Cr的根源可能是一个重要的宽容策略利用黄连保护地上光合组织(40]。值得注意的是,增强重金属封存根需要更多的负电荷的细胞壁,使绑定重金属离子的正电荷(9]。我们先前的研究显示,绝大多数的Cd和Cr被扣押在根细胞的细胞壁30.,34]。这一发现表明,更多的负电荷的细胞壁结合Cd和铬离子的正电荷黄连增加根的Cd和Cr封存。此外,Cd供应量预计值> 1在所有植物样本,最大值为17.52,最小为6.44(表1)。相比之下,Cr供应量预计值< 1在所有植物样品,除了一个样本值为1.64。这一发现表明黄连不同的吸收能力不同的重金属。此外,Cd的供应量预计值> 1表明黄连可以从土壤丰富的Cd,这与之前研究的结果是一致的(33]。
3.2。化学形式
迁移能力,生物利用度,和毒性的重金属取决于它们的化学形式在植物35]。重金属可以转换成各种植物中不可用的形式,和高水平的这些不可用形式可能诱发低危害植物的毒性(24]。重金属在无机(与80%乙醇提取)和水溶性与d - h(提取2O)形式显示较强的迁移能力和表现出最大的植物毒性,其次是果胶酸盐-和protein-integrated(与1 M氯化钠提取)和不可溶性磷酸盐(HAc提取2%)。相比之下,草酸(与0.6盐酸提取)和残留是最有害的植物36,42]。铬的化学形式如图所示1和补充表S1。在控制植物组织,Cr的形式提取与盐酸(33.2% - -47.8%)是主要,其次是用80%的乙醇提取(33.2% - -37.9%),剩余(7.7% - -16.9%)和d - h2O(4.3% - -11.5%),而形式提取与氯化钠和HAc相当低。Cr治疗后,Cr分数与盐酸提取增加了不同程度和在所有植物组织的主要形式。综上所述,这些数据证明了Cr主要是固定由草酸和Cr的最大分数少移动和有毒的形式存在于黄连。重金属和有机酸可以形成复合物,导致毒性的变化和迁移能力(43]。之前的研究表明,形成强大的债券之间的螯合金属和羧酸盐组和氢氧化酚组有机酸积累起着重要的作用在金属和解毒的植物(44,45]。中有机酸、草酸是一个强有力的二羧酸阴离子和好的为绑定重金属阳离子的络合剂46,47]。在Leersia hexandra斯沃茨,高叶酢浆草的综合Cr含量可能与Cr电阻(47]。此外,液泡的酸性环境有利于摘要酸复合物的形成(44]。我们之前的研究表明,当黄连受到Cr压力,铬离子主要进入穿越后液泡植物细胞壁保护细胞活动(34]。因此,它是可能的,Cr绑定与有机酸及其存储的液泡降低铬的毒性和生物利用度黄连。Cr的治疗和控制组之间的比较显示,铬的比例提取叶子HAc显著增加了271.4% - -878.6%,200.0% - -286.0%的根状茎,根的296.3% - -348.2%。这些结果表明,Cr治疗导致Cr与磷酸结合,产生一个不溶性复杂,研究的结果是一致的水稻(48,49]。因此,黄连解毒的Cr可能与增加的磷酸铬结合以及低迁移能力和生物利用度。磷酸盐沉淀重金属在根细胞液泡因此陷阱重金属在根和影响他们运输到空中的植物部分(50]。外源性磷(P)的应用可提高HAc-extractable金属和减少的数量的80% ethanol-extractable金属在水稻根系P而减轻重金属的解毒压力(51]。
3.3。Cd和Cr FAA概要文件的影响
由于重金属可以破坏植物的氨基酸代谢,改变联邦航空局水平发挥重要作用的机制采用植物应对重金属压力(3,52]。Cd和Cr强调联邦航空局的影响水平叶,根状茎,根表所示2和3和补充数据S1和S2。联邦航空局水平变化在不同植物组织、联邦航空局水平最高的叶子和根最低。同样,在水稻幼苗藿香conyzoidesl .,Crassocephalum crepidioides,美国联邦航空局水平天线部分高于根(6,13]。值得注意的是,黄连的Cd和Cr对总FAA水平没有明显的影响(图2)。Glu,丝氨酸(Ser),丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)是所有控制的主要法斯植物组织和代表大约59%的总联邦航空局内容叶子,53%的根状茎,根为60%。在控制叶子,最丰富的FAA Glu (FAAs)总额的22%,紧随其后的是爵士(13%)、阿拉巴马州和Asp (12%)。在对照组的根状茎,主要的法斯爵士和阿拉巴马州(15%),其次是Asp(12%)和Glu (11%)。对照组的渊源,主要的法斯Glu, Asp(17%),阿拉巴马州(15%),和爵士(11%)。一般而言,上述四个氨基酸的主要法斯在Cd和Cr的压力。
(一)
(b)
的Cd和Cr黄连(表改变了联邦航空局的水平2和3)。重金属浓度之间的相关分析的结果和FAA水平叶、根状茎和根在Cd和Cr的压力下表所示4。缬氨酸的水平(Val),他,苏氨酸(刺),酪氨酸,酪氨酸和Ser与Cd和Cr呈极显著的正相关关系,在所有植物组织中重金属胁迫。Val至关重要的平衡通量在不同氨基酸途径。增加Val的积累可以促进应激蛋白质合成和维持体内平衡氨基酸(53]。同样,据报道,高水平的Val积聚在番茄根Cd曝光后(54]。他大大加剧了其他氨基酸生物合成的调控和金属离子的螯合和运输以及在植物繁殖和生长过程中发挥作用(55]。他可以作为一个有三叉的绑定单元通过一个羧基,氨基咪唑氮,允许它与金属离子形成稳定的配合物56]。据报道他已经明显积累在所有组织马赛草暴露于Cd,涉及的积累和解毒Cd [57]。同样,黄连的积累可能是与解毒的Cd和Cr。刺在结构和极性有足够的给电子体官能团结合重金属(22]。姚明等人报道,ThrCd2 +复杂的能量最低和最高的日志吗β值,这表明它比其他更稳定的氨基酸复合物与Cd [58]。增加的程度用力推Cd胁迫也观察到两个Noccaea种植物(59]。
一般来说,Glu和阿拉巴马州水平显著负相关与Cd和Cr积累在各植物组织在Cd和Cr(表压力4)。Glu参与氮同化和运输在植物。此外,Glu介导对环境和非生物胁迫的响应在高等植物3,12]。缓解Cd毒性、植物合成大量的防御细胞内通过食用Glu [60]。Glu是主要氨基供体其他氨基酸的合成。Glu含量急剧下降已经观察到在水稻Cd压力(61年,62年水稻谷粒,Glu水平与Cd压力呈负相关。这个结果可能归因于利用Glu Glu-Cd形成螯合物,从而减少Glu的水平和生物活性和毒性的Cd (12,63年]。雷德等人描述的两种机制,Glu与重金属离子螯合物:一个是金属和羧基之间的直接交互,另一个是静电相互作用引起的羧基(64年]。在目前的研究中,Glu可能被迅速转化为所需的产品或Glu-metal螯合,导致Glu的水平下降。
Pro是一个指示器和保护者在高等植物发展在生物和非生物压力,如接触重金属、干旱、高盐度和极端温度(12]。箴植物重金属胁迫的作用是多方面的。它可以与重金属形成螯合物,与过多的氧自由基反应消除活性氧的有害影响,和调节植物细胞渗透和水平衡65年,66年]。Cd-induced积累职业也观察到绿豆和小麦植物(67年,68年]。然而,没有积累的职业在生菜Cd胁迫(69年]。在目前的研究中,专业水平的变化在Cd压力不同于在Cr压力。Cd胁迫下,不同程度的减少在专业水平在所有植物组织中观察到。然而,在Cr压力,专业水平增加了145.1%和194.2%,叶和根状茎,分别与控制。这些结果暗示有两种截然不同的应力防御通路黄连。专业的具体监管机制在黄连Cd和Cr的压力下仍然需要进一步研究。此外,已知氨基酸代谢影响的不同重金属治疗和不同植物物种,基因型,甚至植物的不同部分(13]。
3.4。隔离和生物信息学分析CcMT2
MTs发挥重要作用在植物生长发育的调节和植物对生物和非生物胁迫的响应,包括重金属毒性(1]。MTs的金属螯合剂对重金属体内平衡,因为他们生产metal-thiolate复合物结合重金属在植物细胞中。这种机制是植物中与金属解毒和抗逆性密切相关(8]。理解函数的MTs黄连,金属硫蛋白编码基因CcMT2是孤立的。的长篇CcMT2cDNA由402个核苷酸组成,其中包括一个ORF的246个基点(拉伸在40 - 285个基点),编码81个氨基酸的蛋白质(图S3)。与理论预测CcMT2重达8.17 kDπ为4.65。植物MTs可以分为四个亚科根据蛋白质校准和系统发育树分析(1]。在目前的研究中,MT基因隔绝黄连与两个Cys-rich区域编码的一种蛋白质。CcMT2蛋白质包含14个半胱氨酸残基Cys-Cys,两个Cys-X-Cys,和一个Cys-X-X-Cys图案的氨基端地区三个Cys-X-Cys图案c端地区。这是典型的株型2 MT基因,因此命名CcMT2。分析NCBI保守域的数据库显示,CcMT2包含保守域的株型2 MT基因和属于是总科(图S4)。系统发育树显示CcMT2共享同一分行CjMT 2 (BAF35950.1)c .粳稻TwMT2 (XP_038680125.1)雷公藤,MrMT2 (KAB1226012.1)Morella rubra(图3)。蛋白质序列比对表明,CcMT2有100.0%与CjMT2身份,与MrMT2 TwMT2 64.4%,和56.4%。因此,CcMT2推测在黄连有类似的功能。有人建议,α和β的半胱氨酸残基域和一些残留的间隔区域CjMT 2对Cd交互(很重要70年)(辛格et al . 2019年)。因此,CcMT2的功能可能与重金属的积累和宽容,包括Cd和Cr。
3.5。的表达CcMT2在组织和应对重金属
MT基因不同的组织表达模式植物。一般来说,1型MT基因表达在根,2型MT基因在叶子,3型脊髓灰质炎病毒引起MT基因在叶和成熟水果、和类型4 MT基因在发展中种子和生殖器官(71年]。检查的组织表达模式CcMT2在黄连,存在分析进行总RNA提取叶,根状茎和根。结果显示,CcMT2主要表达在叶子和弱表达在植物的根状茎和根,这是符合一般2型MT基因的表达模式。的表达水平CcMT2在叶与根相比增加了11.2倍和77.2倍增加与根状茎(图4)。组织表达的模式CcMT2也符合2型MT基因在其他植物,如烟草(1),麻风树l . (72年]。
据报道,在MTs半胱氨酸残基可以提高植物耐重金属(73年)和发挥重要作用的重金属解毒(15]。当植物暴露于重金属,MT基因表达通常是刺激(数字5和6)[71年]。的CcMT2叶子表达水平显著增加8 - 72 h Cd了治疗,达到峰值后24 h与控制相比增加了2242.1%。的表达水平CcMT2在Cr压力下降在第一次4 h,在12 - 72 h,然后大幅度调节达到峰值72 h与控件相比增加了3211.4%。的表达水平CcMT2在植物的根状茎抑制8 h后重金属暴露,但在12 - 72 h大大增强。表达水平达到24小时在72 h Cr Cd压力和压力和增加了2173.2%和978.9%,分别与控制。类似的模式在根治疗Cd和Cr的表达水平CcMT2根明显诱导的Cd和Cr压力在12 - 72 h和24小时达到高峰,显示增加了334.7%和1189.0%,分别与控制。太内容和/或MT基因积累重金属的潜在生物标记物和生物防御20.]。作为CcMT2表达式是调节在所有植物组织中,这些结果表明,CcMT2参与的积累和解毒Cd和Cr黄连。此外,CcMT2表现出不同的反应模式重金属压力在不同的植物组织。这个结果符合观察玉米,表明植物有不同的监管机制不同重金属压力(23]。甘蔗(蔗糖制成Roxb)已被证明移植MT基因的表达赋予Cr公差(74年高MT基因的表达),这是与高重金属耐受性报道一致栽培稻l . (8),景天属植物alfredii拱腰(75年),而美国lycopersicum(71年]。通过特定的机制CcMT2影响光盘和Cr积累和解毒作用需要进一步研究。
4所示。结论
解决的问题在黄连种植Cd和Cr含量高,Cd和Cr吸收的特点,化学形式的Cr, FAA和MT基因表达水平的变化在黄连Cd和Cr的治疗进行了分析。结果表明,根保留Cd和Cr可能是一个重要的宽容策略黄连保护光合组织。Cr的化学形式的分析表明,铬主要是草酸固定的组织;然而,Cr治疗后,Cr与磷酸结合,产生一个不溶性复杂。低生物利用度和迁移能力的化学形式的Cr有助于减少铬毒性黄连。FAA在重金属压力的变化显示,一些法斯,例如Val,他,Glu,亲,可能参与的积累和抗Cd和Cr通过各种解毒的策略。这些策略包括通量在不同氨基酸的平衡路径,通过一些特定的团体与重金属离子螯合,合成大量的防御等,并与过多的氧自由基反应消除活性氧引起的伤害。这些结果也表明了,氨基酸代谢的影响的不同重金属的治疗和在同一植物的不同部分。太基因已经被鉴定为生物标志物候选人重金属积累在黄连和宽容。在目前的研究中,我们孤立CcMT2在首次黄连和显示,主要表达在树叶。CcMT2是诱导下Cd和Cr压力在所有植物组织中,指示CcMT2蛋白参与的积累和宽容Cd和Cr。具体的函数CcMT2在Cd和Cr性能需要进一步的研究。综上所述,我们的研究结果提供基本信息的积累模式和解毒机制Cd和Cr在黄连,这可以用来降低Cd和Cr含量在未来这一重要的药用植物。
数据可用性
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的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(No.81903751),自然科学基础研究项目的陕西省科学技术厅(2019号金桥- 877),陕西中医的科研项目(编号2019 - zz zy018),博士陕西中医大学研究基金项目和创新团队的药效物质和应用程序的“秦巴特色Qi-Medicines”太白山脉,陕西省中医药大学。我们表达我们的感谢吴胜利(西安安德制药有限公司)进行协助样本收集。
补充材料
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