在布基纳法索生活在疟疾季节性高传播环境中的幼儿中恶性疟原虫eba-175、ama-1和msp-3基因型的临床变异

摘要

之间的关联恶性疟原虫eba-175，ama-1和msp-3研究了疟疾致病性的多态性。因此，我们比较了布基纳法索5岁以下有症状和无症状疟疾儿童之间不同等位基因的患病率。在2008年疟疾传播季节，收集了228名5岁以下有症状和199名无症状儿童的血液滤纸。所有患者都在50岁左右生活在萨蓬的农村地区距离布基纳法索首都瓦加杜古公里。恶性疟原虫使用QIAGEN试剂盒提取寄生虫DNA，并通过巢式PCR评估等位基因多样性。然后，根据已描述的等位基因多态性区域，用限制性内切酶消化PCR产物eba - 175，ama-1和msp-3基因。个体等位基因eba - 175 _fcr3和msp-3_K1频率在统计上较高()无症状组与有症状组相比无统计学差异ama-13 d7,ama-1-K1，和ama-1-两组之间的HB3基因型()三、比较分析恶性疟原虫基因型分析表明，该基因的多态性eba-175和msp-3基因型在无症状和有症状的临床组之间存在差异，可能与疟疾的发病机制有关。

1.介绍

根据世卫组织最新的疟疾报告[1]2014年，全世界约有1.97亿例疟疾病例，估计有584例不幸的是，尽管积极实施疟疾控制战略，包括在全球部署青蒿素联合疗法（ACTs），但疟疾仍然是一个主要的公共卫生问题，特别是在撒哈拉以南非洲。疟疾寄生虫的遗传复杂性是有效控制该疾病的主要障碍之一。寄生虫基因型与疟疾临床表现之间的关系在其他地方已有报道[2- - - - - -4]红细胞结合抗原-175（EBA-175）、顶膜抗原-1（AMA-1）和裂殖子表面蛋白3（MSP-3）是裂殖子表面抗原，被认为在寄生虫入侵红细胞中起关键作用[5- - - - - -8］.两者之间的联系ama-1和msp-3疟疾基因型和保护已经在早期血清流行病学研究[先前报道9- - - - - -11.].此外，eba - 175c基因型被发现与严重疟疾的致命结果有关[12.］.2001年，Policy和Conway [13.]揭示了小鼠的等位基因特异性免疫恶性疟原虫msp-3K1等位形式。基于以上临床联系和多态性eba - 175［12.]，msp-3［14.),而ama-1［15.，16.]，我们认为eba - 175，msp-3和ama-1生活在疟疾流行地区，特别是季节性地区的有症状和无症状儿童的单倍型具有科学意义。事实上，目前这项研究的结果可以帮助我们更好地理解疟疾的作用（如果有的话）恶性疟原虫疟疾致病性的基因型多样性。此外，本研究产生的数据可能与基于EBA-175、AMA-1和MSP-3的疟疾疫苗开发背景下的疫苗研究有关。

2.材料和方法

2.1.研究地点和研究人群

的study was conducted in two community clinics, Saponé Marché and Kounda located in the Saponé Health District, approximately 50 km southwest of Ouagadougou, the capital of Burkina Faso. The Saponé Health District is located at 12°13′N, 1°48′W and has approximately 80,000 inhabitants, most of them (>95%) belonging to the Mossi ethnic group. Malaria transmission is perennial and seasonal in this district and is characterized by a peak during the rainy season (May–October). The entomologic inoculation rate was estimated at 200 infective bites/person/year in the study area [17.]5岁以下儿童临床疟疾病例的发病率估计为1.3次/儿童年[18.］.

这项研究的对象是生活在这两个社区的大约500名五岁以下儿童。

在随访期间，所有疟疾病例已得到临床研究人员用没有成本管理。临床管理是基于国家政策的指导方针，其中包括以青蒿素为基础的联合疗法，无并发症疟疾病例和重症疟疾病例奎宁盐（复方蒿甲醚罗氏，巴塞尔，瑞士）。

2．2.道德的考虑

该研究是旨在评估五岁以下儿童疟疾发病率和死亡率的大型流行病学研究（DMID协议06-0020）的一部分。该研究协议由微生物学和传染病部临床研究事务办公室（OCRA）审查和批准（美国国家变态反应和传染病研究所（NIAID）的DMID）。它也得到了布基纳法索健康研究伦理审查委员会的批准。

在自愿获得受试者或其法定监护人的书面知情同意之前，向受试者解释了研究的明确说明以及所有预期风险和益处。

２．３．样品收集

通过手指穿刺从3-59个月大的儿童身上获取血样。厚薄的涂片和滤纸上的血迹（Whatman No.2）在2007年2月和9月分别在旱季和雨季进行的两次横断面调查中收集的样本，用于检测无症状病例。然后在相关社区诊所对儿童进行为期一年的随访，以检测疟疾症状病例。

厚薄涂片用吉氏染色，在光镜下进行疟原虫鉴定和计数。

在基因分型分析之前，用硅胶干燥剂将斑点滤纸保持在室温下。

本研究采用以下定义:症状性疟疾病例定义为腋窝温度≥37.5℃无性生育的儿童恶性疟原虫不考虑寄生虫密度的寄生虫；无症状疟疾病例被定义为存在无性生殖恶性疟原虫寄生虫不论寄生虫密度的，在没有临床症状。

2.4。显微镜检查

用Giemsa对厚血涂片和薄血涂片进行染色，并在显微镜下检查以确定单一感染恶性疟原虫．无性恶性疟原虫寄生虫对200个白细胞进行了估计，寄生虫密度是根据每微升血液中8000个白细胞的平均值计算的。

2.5.恶性疟原虫DNA提取

根据制造商的协议，使用QiAmp DNA血液微型试剂盒从血点提取寄生虫DNA（Qiagen；加利福尼亚州瓦伦西亚）。DNA样本在无菌试管中等分，并储存在−20°C，直到聚合酶链反应（PCR）扩增。

2.6.EBA-175，msp-3和ama-1碎片放大

EBA-175基因分型是通过巢式PCR进行的，如其他地方所述[4].引物序列和扩增反应条件如表所示1．采用精检测PCR方法对该菌的多态区进行扩增msp-3基因（见表1)．这个区域主要限于先前鉴定为抗原的多样性的MSP-3多肽中的位点[七肽重复内的N端末端19.］.简单地说，进行了两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增以5µ1份DNA模板，最终体积为25 µL.第二次试验与第一次试验相似，试验结果为2.5 µ第一个PCR产物的L为DNA模板。每个PCR轮扩增包含1个µ每种引物M，1单位Taq DNA聚合酶（加州卡尔斯巴德Invitrogen），2.5 µL 10倍PCR缓冲液（Invitrogen），2.0 mMgCl₂和200 µM核苷酸(表达载体)。第一个和第二个反应的PCR循环条件如表所示1．


	序列	PCR条件

	eba - 175
第一反应	5′-CAAGAAGCAGTTCCTGAGGAA-3′ (forward) 5“-CTCAACATTCATATTAACAATTC-3”(反向)	D（94°C，适用于1小时最低温度），A（56°C，持续1小时分钟）， Ex (72° for 2 min), FEx (72°C for 3 min), Cy (29 cycles)
第二反应	5′-Gaggaaaacactgaaaatagcacac-3′（前进） 5′CAATTCCACTGTGACACAT-3（倒档）	D(94°C for 1 min)， A(56°C for 1 min)， Ex（72°C，适用于2 最低温度），FEx（72°C，持续3小时最小），周期（24个循环）
	阿玛-1
第一反应	VM785/3: 5“-CCGGATCCCCTTTGAGTTTACATATATG-3”(向前) VM990: 5 ' -AAA TTC TTT CTA GGG CAA AC-3 '(反向)	D (95°C for 2 min 30 s), A (51°C for 30 s), Ex(68°C for 45 s)， FEx(68°C for 5 min)， Cy(30个循环)
第二反应	VM815/3:5′-GGA法案CAA TAT AGA CTT CC-3′（转发） VM990: 5 ' -AAA TTC TTT CTA GGG CAA AC-3 '(反向)	D (95°C for 2 min 30 s), A (51°C for 30 s), Ex（对于45 s），FEx（68°C，5小时最小），周期（35次循环）
	msp-3.
第一次PCR 反应	华氏159度：5′-ATGTTGCTAGTAAAGAAATTG-3′（前进） 745R：5′-CataactAgAttCttTgc-3′（反向）	D(94°C for 30 s)， A(54°C for 30 s) Ex（68°C，适用于2 最低温度），FEx（68°C，持续5小时最小），周期（30次循环）
第二个聚合酶链反应反应	华氏188度：5′-ATATCTTAACTTAAGAATGC-3′（前进） 745R：5′-CataactAgAttCttTgc-3′（反向）	D(94°C for 30 s)， A(54°C for 30 s) Ex（68°C，适用于2 最低温度），FEx（68°C，持续5小时最小），周期（40次循环）

D:变性;答:退火;例句:延期:FEx:最后的延期;循环次数。

第一个PCR反应与上述相似msp-3使用一套引物(VM785/3和VM990)进行首次扩增反应，见表1.第二轮反应混合物ama-1在最终的50卷中进行µ我有5个 µ1份10倍PCR缓冲液（Invitrogen）和2个单位的Taq DNA聚合酶，其中1份 µ我每个人ama-1VM815和VM990引物。从PCR产物ama-1第二个反应用三种限制性内切酶消化均方误差我过磷酸钙我和BfCUI，生成的片段大小与3D7、K1、HB3/7G8对应ama-1等位基因类,分别。

2.7。内部质量控制和数据解释

纯化DNA自恶性疟原虫3D7（MRA-102G）、HB3-B2（MRA-149G）和K1（MRA-159）由美国类型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）疟疾研究和参考试剂资源中心提供，并在PCR扩增期间用作阳性对照。阳性对照用于评分和解释片段大小。

的EBA-175等位基因CAMP和FCR3为单个片段，长度分别约为714和795个碱基对。的msp-3K1和3D7等位基因被鉴定为单片段，长度分别约为500和400个碱基对msp-3另据报道不同大小的片段。最后，ama-1k1,ama-1-3D7，以及ama-1-HB3/7G8等位基因被鉴定为长度分别为285、400和335个碱基对的单个片段，这些片段在用酶消化时被识别均方误差我过磷酸钙我和BfCU一、分别。

混合感染定义为K1和3D7 msp-3等位基因或F和C同时存在eba - 175碎片或两个或三个ama-1相同样本中的片段。

2.8.统计分析

等位基因数据输入为Excel格式的双条目，并使用统计软件Epi Info v6.04a进行分析(http://www.cdc.gov/epiinfo/Epi6/EI6dnjp.htm)．利用该软件获取不同等位基因的载波频率。使用GenAlEx 6.5估算单个等位基因频率[20.］.

包含在组合数据集被限制在样品不超过一种标志物缺失数据。

为了评估msp-3，eba - 175和ama-1等位基因随着年龄的增长而变化，该数据被分为基础上在获得性免疫发展的差别三个年龄组（≤1今年1至3年，> 3年）。

卡方和Fisher精确检验用于数据分析用作统计显着性阈终点值。

通过基于三种抗原组合确定杂合性来估计遗传多样性，其中杂合性范围从0到1，其中频率是多少个等位基因。的-该测试用于比较不同组之间的平均杂合度。

3.结果

共有427名儿童，平均年龄为2.2岁（95%置信区间（CI），2.1-2.4）基因分析包括427个样本，分别代表从无症状和有症状疟疾儿童中采集的228个和199个样本。该基因分析仅包括显微镜下已知的疟疾阳性样本恶性疟原虫因此成功地获得了三个基因中的至少一个。

３．１．有症状和无症状疟疾病例的等位基因流行情况

我们调查了无症状和有症状的疟疾患者是否在患病率上存在差异eba-175等位基因。基因分型分析表明FCR3等位基因的频率在无症状感染显著更高相比对症感染（)．的ama-1-HB3等位基因在无症状感染中也有较高比例，但差异无统计学意义(表)2)．然而,msp-3_K1与无症状携带者相比，等位基因在有症状携带者中显示出显著的患病率()(表2)．


等位基因	无症状		症状的		值（组之间的）
等位基因	没有(%)		没有(%)		值（组之间的）

AMA-1_K1	75 (33.3)	0.44	39（32.8）	0.44	0.9
AMA-1_3D7	78 (34.7)	0.45	43 (33.3)	0.44	0.8
AMA-1_HB3/7G8	131 (58.5)	0.48	55 (47.8)	0.50	0．06
值（组内）	«0.0001		0.03
EBA-175_FCR3	202 (88.6)	0.50	95 (67.9)	0.46	0.0001
EBA-175_营	107 (46.9)	0．20	51 (36.4)	0.44	0．05
值（组内）	«0.0001		«0.0001
MSP3_K1	83 (36.4)	0.46	103（59.5）	0.49	0.00001
MSP3_3D7	115 (50.4)	0.50	98 (56.32)	0.49	0.2
值（组内）	0.002		0.5

：杂合性。
重大值< 0.05。

比较各组（无症状或有症状）内等位基因的患病率发现ama-1_HB3等位基因和eba - 175＿FCR3等位基因在两组中都是最普遍的。的MSP-3_3D7这是最常见的msp-3无症状组的等位基因。

对单个等位基因频率的分析表明eba-175 FCR3和msp-3 K1无症状组和症状组的等位基因更常见，差异有显著性(表)2)．

3.2.年龄对健康的影响msp-3，ama-1和eba - 175等位基因频率

为了评估msp-3，eba - 175和ama-1等位基因随着年龄的增长而变化，该数据被分为基础上在获得性免疫发展的差别三个年龄组（≤1今年1至3年，> 3年）。由年龄不同等位基因的分布的统计分析表明在等位基因频率一些结构。分布msp-3等位基因显示出更高且具有统计学意义的感染率msp-3D7与…相比msp-3 K1所有年龄组中的等位基因，无论临床特征如何，但“1-3岁”类别中的等位基因频率在统计学上显著较低()的msp-3观察到3D7等位基因（表1）3.)．


	等位基因	无症状的疟疾病例			症状疟疾病例
	等位基因	≤1年（45）	1-3年（99）	>3年（84）	≤1年（66）	1-3年（92）	> 3年(41)

eba-175	EBA-175_营地	46.7	52.5	40.5	30.3	17.4	36.6
	EBA-175FCR	95.6	87.9	85.7	48.5	48.9	43.9
	价值	0.4	0.01	0．12	0．08	0.005	0.4

ama-1	AMA-1_K1	37.8	38.4	23.8	12.1	21.7	26.8
	AMA-1_3D7	37.8	38.4	27.4	15.2	30．4	12.2
	AMA-1_HB3	66.7	49.5	61.9	22.7	29.3	31.7
	价值	0.006	0．18	0.00001	0．24	0．35	0.1

msp-3	MSP-3_K1	42.2	34.3	35.7	45.5	59.8	43.9
	MSP-3_3D7	51.1	52.5	47.6	60.6	39.1	53.7
	价值	0.00001	0.00001	0.00001	0.03	0.00001	0.5

重大值< 0.05。

分析ama-1等位基因显示，即使HB3等位基因是所有年龄组中最常见的一个，这种差异仅在症状组<1岁和>3岁的儿童中具有统计学意义（表1）3.)．

高发病率eba - 175 _fcr3等位基因与营地除3岁以上有症状的儿童外，所有年龄组均收到通知（表1）3.).两组的差异仅在1-3岁儿童中具有统计学意义．

4.讨论

本研究旨在分析生活在布基纳法索南部地区有症状和无症状疟疾感染儿童中三种主要疟疾候选疫苗的等位基因多样性。该研究集中在AMA-1的I域，代表该基因的最多态区域[13.，16.，21.]被称为抗AMA-1保护性抗体的主要靶点[22.].电缆的N端末端msp-3在此遗传分析中选择的七重重复序列内和侧翼的基因在以前的研究中被确定为MSP-3多肽之间抗原多样性的位点[19.］.最后，多态区域eba - 175根据目前的遗传分析，外显子I位于区域II，已知该区域编码两个Duffy结合样结构域（F1和F2）的重复序列。通过在FCR-3菌株（F-loop）中插入一个342碱基对片段或在CAMP菌株（C-loop）中插入一个423碱基对片段，两个结构域F1和F2被高度发散的二形区III分开。

在以往的各种研究中讨论了这种已知表面抗原在疟疾发病机制中的遗传多样性影响，得出的结论需要在不同的疟疾环境中进行进一步研究eba1-175在生活在中非特别是加蓬的儿童中发现了二型性和疟疾临床状态[12.，23.］.

AMA-1作为疟疾候选疫苗的重要性为探索该抗原中遗传多样性的作用提供了进一步的理由。强烈的不平衡ama-1先前的一项研究强调了症状性感染和无症状感染之间的遗传多样性[24.]表明疟疾发病率可以是菌株特异性的。

本研究的结果证实eba - 175如先前的研究所示，该基因是二型的，F和C等位基因普遍存在[25.- - - - - -27.］.虽然F等位基因占优势，但结果也表明，这与患者的临床状态(无症状和有症状)没有关系。但研究显示无症状病例中C、F等位基因混合节段感染比例较高。这一发现与此前在亚洲的报道一致[28.在非洲[29.］.

的分析ama-1与以前的研究结果相比，我们研究中的等位基因显示基因型流行率与疟疾感染之间缺乏关联。有症状和无症状感染之间的严重不平衡表现在多个基因簇多态位置的残基分布上ama-1基因型(24.］.然而,ama-1_与其他基因型（K1和3D7）相比，有症状组和无症状组中HB3/7G8基因型在研究区域的比例过高本研究中使用的普通PCR方法不能提供足够的分辨率来识别我预测的由于保护性免疫反应导致的多样化选择而产生的结构域中的单个点突变[13.，30.- - - - - -32.］.直接排序ama-1基因产物可能会更好地解决这些多态性在疟疾发病机制中的作用。

的msp-3_K1等位基因相关()表中显示临床疟疾风险较高2. 然而，这种相关性仅在1岁至3岁之间的有症状人群中具有统计学意义，而在其他年龄组（年龄<1岁和>3岁组）中没有统计学意义。与此平行的是MSP-3_3D7等位基因仅在1-3岁年龄组与无症状疟疾相关。这些发现突出了分析该基因多态性的相关性恶性疟原虫以年龄间隔较短而不是年龄范围较大的亚类为基础的寄生虫。先前分析年龄等位基因特异性免疫的研究完美地说明了疟疾抗原多态性的复杂性[33.]其中多态性是寄生虫逃避免疫的常见机制[34.］.

本研究采用PCR-RFLP技术分析等位基因多样性。尽管这是一种基于分析的有用方法，成本低廉且易于确定感染个体患者的不同寄生虫基因型的数量或评估感染的多样性（MOI），但该方法在将某些模式解释为大小本身方面的效用有限（多态性原理）可能正在选择中[35.，36.]或用于确定在多个多态性影响同一限制性内切酶识别位点的情况下的确切变异[37.］.

5.结论

的等位基因多态性的作用，这种比较分析eba - 175，msp-3和ama-1基因恶性疟原虫来自无症状和有症状疟疾病例的分离株表明，在我们的研究区域，无症状和有症状疟疾组之间的多态性具有可比性eba - 175和msp-3等位基因频率，这三个基因的多态性整体一起没有表现出有症状或无症状的疟疾任何等位基因的关联。然而，这些研究结果提供了有关的一般分布广泛的见解恶性疟原虫多态性用于开发疟疾疫苗试验地点。我们的研究结果强调，需要使用更先进的技术，如DNA测序，以阐明这一相关的辩论。

缩写

恶性疟原虫：	恶性疟原虫
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
DNA:	脱氧核糖核酸
AMA-1：	顶端膜antigen-1
eba - 175:	红细胞结合抗原-175
MSP-3：	裂殖子表面蛋白-3
PCoA：	主坐标分析
行为：	青蒿素联合疗法
人:	世界卫生组织
DMID:	微生物学和传染病科
ASY:	无症状
SYM：	有症状的。

利益冲突

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Issiaka Soulama设计了分子分型研究，进行了PCR，分析了数据，撰写和审核了论文，并批准了最终版本。Samuel S. Sermé进行了PCR并分析了数据。Alphonse Ouedraogo、Amidou Diarra和Edith C. Bougouma进行了实地研究并批准了最终版本。Sodiomon B. Sirima、Issa Nebie、Amadou T. Konate和Alfred B. Tiono设计了这项研究，协调了研究执行，撰写了报告，科学地审查了论文，并批准了最终草案。

致谢

作者表示感谢参与这项研究，Saponé卫生区的卫生工作人员的人口，和CNRFP的所有调查人员。他们感谢蒂莫西·斯特德曼对他的援助和培训和迪尔德丽A.喜悦博士，项目官员，寄生虫基因组学（寄生虫学与国际计划科，微生物学和传染病，NIAID的司国立卫生研究院DHHS）在统计分析和论文批判性评论方面的帮助。他们还感谢MR4（美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国类型文化收藏（ATCC）为他们提供疟原虫菌株作为阳性对照和引物序列。本研究得到了美国国立变态反应与传染病研究所、美国国立卫生研究院贝塞斯达传染病部、马里兰州国家卫生研究院/NIAID/DMID（DMID协议N_06-20，合同号HSN266200400016C）经常预算的支持。

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寄生虫学研究杂志

临床变异恶性疟原虫eba-175，ama-1和msp-3在布基纳法索疟疾季节性高传播环境中生活的幼儿的基因型

摘要