在体外和在活的有机体内抗疟活性热带榕属植物thonningii布卢姆(桑科)和Lophira alata银行(金莲木科),确定从尼日利亚中部地带的民族医学

文摘

耐药恶性疟原虫要求必须开发新药物。植物药物发现和开发的潜在来源。两种植物用于治疗发热性疾病在尼日利亚被检测在体外和在活的有机体内在癌症细胞株抗疟活性和细胞毒性。甲醇、己烷和叶乙酸乙酯提取物热带榕属植物thonningii和Lophira alata是活跃在在体外分析对恶性疟原虫NF54(敏感)和K1抗多种抗菌素的菌株。己烷提取的f . thonningii和l . alata是最有效的提取在吗在体外分析与集成电路₅₀的 克/毫升, NF54和g / mL 克/毫升, g / mL K1应变。提取都是无毒对KB细胞毒性检测人体细胞与IC₅₀超过20g / mL,证明选择性恶性疟原虫。在活的有机体内分析表明,减少parasitaemia己烷提取的植物。最大剂量的测试,l . alata减少了74.4% parasitaemiaf . thonningii减少84.5%,提取物长期动物生存在老鼠身上感染了p .鼠NK65相比,车辆控制治疗。antiplasmodial活动观察证明使用两种植物在治疗发热性条件。

1。介绍

需要改进的疗法治疗寄生虫病的发展是迫切的,尤其是治疗疟疾,廉价和负担得起的抗疟药的耐药性,如氯喹和磺胺多辛/乙胺嘧啶是普遍。此外,逐渐下降的效果以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)在一些疟疾流行地区是引起关注1]。还没有有效的疫苗和向量对杀虫剂的抗性问题,有必要小说发展的实体,将有效对抗耐药寄生虫感染,特别是恶性疟原虫,最严重和最常见的人类疟疾寄生虫(2]。几个世纪以来,植物作为丰富新颖化合物的各种人类疾病的治疗。从植物开发的抗疟药物,包括奎宁来自金鸡纳树皮和青蒿素青蒿。青蒿素是目前的一个关键组成部分介绍药物组合治疗抗感染(3]。民族植物学的调查中发挥着重要作用识别、选择和开发药用植物的治疗药物。在尼日利亚和非洲的大部分地区,大量的人口百分比取决于植物提取物,它还广泛应用于疟疾和其他疾病的治疗,特别是在地区访问的标准治疗是有限的。然而,许多植物源的潜力尚未充分探讨的抗疟药物的科学(4]。民族医学的人种学评价的中间地带区域尼日利亚透露,许多草药传统上用于治疗发热性疾病(5]。最提到的两种植物在这个研究热带榕属植物thonningii布卢姆(桑科)和Lophira alata银行(金莲木科)。叶子从f . thonningii用于传统医学在尼日利亚牙痛,添加了止痛剂和anti-irritant属性(6]。此外,的叶子l . alata已经知道局部治疗发热性疾病,咳嗽,黄疸,胃肠道功能紊乱7]。本研究提出了评价的结果在体外antiplasmodial和在活的有机体内这两种植物的抗疟药活动。可能这些植物的细胞毒性活动也决定为了确定他们选择索引。

2。材料和方法

2.1。工厂收集和验证

两家工厂的样品收集来自不同位置在贝宁,埃多州,尼日利亚。Usang Felix先生分类学者尼日利亚林业研究所(FRIN),伊巴丹,验证植物,凭证标本被沉积在FHI数字为107253f . thonningii和107252年l . alata。

2.1.1。植物提取

两个植物脱水的植物叶子大约48小时使用一个简单的桌面和地面搅拌器。从每个工厂,500克干叶子被提取到甲醇蒸馏而成,己烷,乙酸乙酯在室温下浸渍(29-33°C) 72 h。所有工厂的解决方案都是过滤和集中在减压干燥用旋转蒸发器(Heidolph Laborata 4001年,德国)。提取存储在冰箱(4 - 12°C),直到所需的所有化验。

2.2。抗疟活性

2.2.1。寄生虫

两个恶性疟原虫菌株,NF54氯喹(CQ)(敏感)和K1耐(CQ),请提供美国Kamchonwongpaisan研究,泰国,被用于这项研究。寄生虫在人类红细胞不断培育和维护根据先前描述的方法(8]。

2.2.2。在体外Antiplasmodial化验

培养基由RPMI 1640 (Gibco-BRL实验室,马里兰州)补充10% heat-inactivated人类O型+血清,NaHCO 25毫米₃25毫米,消息灵通的缓冲区(pH值7.4),和40克/毫升庆大霉素。在体外抗疟活性是由(³H]次黄嘌呤合并方法(9]。所有植物提取物最初在DMSO溶液稀释,然后在完成文化传媒解决方案准备工作。一系列的稀释10倍从100到0.01不等g / mL被准备。整除(25在96 - L)提取的分发microtitre盘子,和200年L 1.5%的细胞悬液含有1 - 2%的感染红细胞寄生虫血症是添加到每个。总板内容孵化有限公司3%₂孵化器在37°C。孵化24小时后,25岁L (0.25Ci) (³H]次黄嘌呤是添加到每个。这种寄生虫文化进一步孵化在相同条件下上述24 h,之后寄生虫被收获到玻璃过滤器文件(美国帕卡德Unifilter)。过滤器被风干,20L液体闪烁液(Microscint Packard)补充道。过滤器上的放射性是衡量使用微型板块闪烁计数器(美国帕卡德Topcount)。的集成电路₅₀值的植物提取物活动获得剂量反应曲线,用非线性剂量反应曲线拟合分析GraphPad棱镜v.3.00软件。任何物质的浓度,抑制50%的寄生虫增长(IC₅₀)确定的s形曲线通过策划的百分比³H]次黄嘌呤合并对毒品/提取浓度。

2.3。在活的有机体内抗疟测试

2.3.1。动物

在活的有机体内测试是根据美国国立卫生研究院指南执行护理和使用实验动物,国家卫生研究院出版(第25卷28号),1996年修订。伊巴丹大学的动物实验都是通过使用实验动物伦理委员会进行研究。天生的瑞士白化病老鼠,重达20至22 g,用于实验。动物得到动物屋的疟疾研究实验室,推动医学研究和培训研究所(IMRAT),伊巴丹大学。老鼠被安置在五组在塑料笼子里,用鼠标数据集,并提供了水随意。

2.3.2。寄生虫

Chloroquine-sensitivep .鼠NK65克隆从疟疾研究和参考试剂获得资源(MR4)和维护在串行通道被用在所有的老鼠在活的有机体内动物研究。寄生的红细胞从donor-infected获得鼠标通过心脏穿刺在酸柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝剂。

2.3.3。在活的有机体内彼得斯Schizontocidal活动为期4天的测试

彼得斯的为期4天的测试使用在活的有机体内药物测试(10]。小鼠接种腹腔内与200年(i.p)1×10 L⁷血红细胞感染p .鼠NK65。提取(己烷提取管理在活的有机体内因为他们最有效的测试在体外测试)治疗动物收到200L(100、200、300、400和500毫克/公斤体重的提取。两个对照组的动物被使用:第一组服用氯喹10毫克/公斤体重,而第二组的动物收到了80 / 10%盐水渐变(汽车解决方案)。植物提取物是可溶性在汽车解决方案和CQ溶解在蒸馏水。所有药物/提取管理寄生虫接种后2小时(0)和1天,感染后2和3。所有提取/药物口服通过套管。血液寄生虫血症是由显微镜检查Giemsa-stained电影取自尾巴剪后第四天感染和显微镜下检查通过计算寄生虫血症1000红细胞。动物的生存是每天监测,直到感染后30天。组织使用的实验老鼠,存活时间被记录在天,平均每组计算。计算平均抑制寄生虫,在那里平均负对照组和寄生虫血症在测试组平均寄生虫血症(11]。

2.4。细胞毒性试验

细胞毒性的植物提取是决定使用一个人类癌症细胞系(KB,口腔表皮样癌),和以前描述(12]。KB细胞生长在标准组织文化被稀释,添加到井96 - microtitre板块。植物提取物水溶性在DMSO和添加到培养KB细胞microtitre板块-20 - 0.03的浓度范围g / mL和孵化了三天;负控制井包含DMSO (13]。经过三天的孵化,这些细胞被固定用100%三氯乙酸和彩色sulforhodamine B (SRB丙烯酰胺,猫。86183号)14]。染料与稀释可溶性三基地和添加到每个好,之后吸收为515 nm的酶联免疫吸附试验板的读者。microtitre板后获得的细胞吸光度值读取每个提取平均,一天的平均值减去零控制和价值获得乘以100给相对于负控制孵化项目增长百分之一。50%抑制浓度计算提取和积极控制(ellipticine IC₅₀= g / mL),利用非线性回归分析。在体外选择性指数确定为每个提取IC₅₀KB细胞/ IC₅₀为恶性疟原虫NF54 [15]。

2.5。统计分析

GraphPad Prism 3.0版(美国GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用于所有统计分析。学生的t以及用于分析的差异意味着寄生虫血症水平后治疗起始和组间方差分析(方差分析)是用来比较不同比例抑制寄生虫的生长。对所有统计测试,被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。在体外

的在体外antiplasmodial活动的六个植物提取物对两株恶性疟原虫、KB细胞系和选择性指数展示在表1。测试的植物提取物对非NF54应变恶性疟原虫,己烷提取植物显示测试提取之间的最好的活动,而其他四个提取活跃度较低。对耐药K1应变,己烷提取物l . alata显示最高的活动,而三个(f . thonningii正己烷和乙酸乙酯提取物和l . alata甲醇提取)显示适度的活动。乙酸乙酯提取物l . alata和甲醇提取物f . thonningii不活跃(集成电路₅₀> 20对这株g / mL)恶性疟原虫。植物提取物通常显示更好的活动对药物敏感NF54比耐药菌株K1应变。总的来说,己烷提取的l . alata树叶最活跃的提取与集成电路测试₅₀=和 分别对K1和g / mL NF54。这是紧随其后的叶子的己烷提取f . thonningii与集成电路₅₀的 g / mL反对恶性疟原虫NF54。的集成电路₅₀己烷提取物的f . thonningii的K1应变恶性疟原虫是 克/毫升。

3.2。细胞毒性的活动和选择性植物提取物的索引

细胞毒性的活动f . thonningii和l . alata提取表所示1。被列为noncytotoxic摘录,当集成电路₅₀大于20克/毫升(12]。细胞毒性结果显示,所有的提取物noncytotoxic。在这个实验中,ellipticine,用作积极控制药物,有一个集成电路₅₀的 克/毫升。选择性指数也决定,这被定义为IC的比值₅₀价值的细胞系IC₅₀值对恶性疟原虫NF54。高选择性指数表明强烈的选择性杀死疟原虫。所有的植物提取物进行选择性的显示恶性疟原虫()。

3.3。在活的有机体内Antiplasmodial活动

的抗疟活性f . thonningii和l . alata己烷提取物对p .鼠NK65瑞士白化菌株感染小鼠使用为期4天的方法抑制测试提出了表2。经过四天的抗疟筛选f . thonningii提取(100 - 500毫克/公斤),观察chemosuppression以剂量依赖的方式。意味着parasitaemia(%)的范围从对待动物来,而意味着parasitaemia对照组。意味着parasitaemial . alata提取(100 - 500毫克/公斤)范围从2.3±0.4,6.7±0.8。所有剂量的己烷提取的f . thonningii和l . alata测试,有显著抑制百分比parasitaemia与未经处理的控制(相比)。在所有剂量测试,f . thonningii提取更有效l . alata提取物在治疗p .鼠感染。平均chemosuppression最高剂量(500毫克/公斤)是测试类似于观察到CQ治疗组。热带榕属植物thonningii己烷提取物也延长了生存的动物感染,虽然提取不能提供完整的保护作用,作为CQ观察治疗组。己烷提取的l . alata也显示出剂量依赖性chemosuppression寄生虫血症,尽管chemosuppression最高剂量并不明显的f . thonningii提取物治疗组。此外,l . alata提取也是不一样的f . thonningii提取在延长受感染动物的生存。

4所示。讨论

为了提供更好的药物对耐药菌株恶性疟原虫(最近间日疟原虫)需要寻找新的分子从新的来源(16]。药用植物过去的一些最成功的抗疟药物如喹啉类药物和青蒿素衍生物,仍然可以作为药物发现这样一个源(17]。因此,尼日利亚,大量未开发的自然资源,是一个理想的地方,从植物中寻找新的药物。先前的研究在植物上土著尼日利亚已经产生了一些高活性抗疟提取物(5,18]。在这一趋势的延续,摘录热带榕属植物thonningii(桑科)和Lophira alata(金莲木科)进行了测试研究在体外对两种菌株的活动恶性疟原虫和在活的有机体内对鼠体内。此外,在体外细胞毒性活动两种植物提取物对KB癌症细胞系进行了测试。在体外antiplasmodial测试执行与提取的f . thonningiiCQ敏感菌株恶性疟原虫NF54透露,己烷提取显示最高的活动与甲醇和乙酸乙酯提取物也活跃,但由于更高的集成电路₅₀。己烷提取物也呈现出最高的活动K1应变的寄生虫,尽管效力低于观察NF54应变。从抗疟活动观察,似乎这些提取的假定的积极原则中亲脂性的提取的一部分。同时,集成电路₅₀的值f . thonningii提取物对寄生虫与描述植物疗法的不同起源显示高的抗疟活性(19- - - - - -26]表明f . thonningii叶提取物具有一些活动恶性疟原虫并将证明这种植物的使用传统的治疗疟疾的尼日利亚的一部分。最近的一项研究的植物提取物从刚果布拉柴维尔(27结果显示抗疟活动。f . thonningiimethanolic提取,这表明获得活性化合物的提取方法是至关重要的(s)或(s)活性化合物的浓度取决于当地的植物。以前的在体外抗疟桑科家族的其他成员的研究显示了所观察到的类似的结果f . thonningii在这项研究中。从水果中提取面包果整数(桑科)受欢迎在泰国也发现抗疟活性在体外(28]。Maquira coriacea(桑科)所使用的植物在玻利维亚Chacobo印第安人的传统治疗疟疾,也显示活动恶性疟原虫(29日]。这个物种的茎提取物是活跃在体外对氯喹耐药菌株和不活跃的敏感F32应变恶性疟原虫。结果从一个在体外马达加斯加的植物筛选的乙醇提取物用于治疗疟疾的报道,空中的部分f . reflexa表示相同的属植物f . thonningii表现出在体外活动对氯喹耐药哥伦比亚应变FcB1 [30.]。其他研究报告在西非的抗疟活性植物用于治疗疟疾、发现的FcB1应变恶性疟原虫ethanolic叶中提取的f . campensis另一个属的成员,显示在体外antiplasmodial活动(31日]。

提取的l . alata对不同菌株的叶子也活跃恶性疟原虫测试在体外。家庭金莲木科的植物,其中l . alata属于没有antiprotozoal活动进行了广泛的研究。此前,提取的l . alata茎皮对多重耐药菌株K1的测试恶性疟原虫和被发现具有抗疟活性5]。的茎和叶Campylospermum deltoideum(金莲木科)也被描述在马达加斯加治疗疟疾和发热性疾病(32]。的报告5]和[32已出版)是唯一使用的植物的家庭金莲木科用于治疗疟疾。因此,这项工作是第一个报告的叶子的活动l . alata对疟原虫菌株。己烷提取物l . alata显示最高的活动对NF54氯喹敏感菌株恶性疟原虫体外。类似的活动也观察到对耐多药K1应变。这些结果非常令人鼓舞的l . alata,建议进一步净化叶子可能会帮助隔离化合物可能会积极对耐药菌株恶性疟原虫。

的p .鼠来华的小鼠模型已广泛应用的初步测试在活的有机体内活动潜在的抗疟药物,因为它提供了一个基础的任何迹象在活的有机体内潜在的生物活性以及可能的毒性测试的样品(33,34]。在体外系统用于筛查抗疟活性不足,尤其是当他们不考虑任何药物前体的影响或免疫系统在控制感染的作用[17]。出于这个原因,在这项研究中己烷提取的植物还测试了在活的有机体内抗疟活性对鼠标的压力p .鼠。这项研究的结果表明f . thonningii和l . alata己烷提取物的无性红血球的阶段活动p .鼠的剂量依赖chemosuppression寄生虫血症和延长感染动物生存在两个治疗组。不同的是在体外测试对恶性疟原虫在哪里l . alata提取更有效f . thonningii,反被观察到在活的有机体内研究。Lophira alata提取的相对比较少在活的有机体内;这可能是由于宿主代谢产生生物降解的活性化合物(s)和/或生物之间的差异恶性疟原虫和p .鼠(33,34]。

5。结论

这项研究的两个工厂测试antiplasmodial活动后选择一个民族植物学的植物学期刊评价用于预防和治疗发烧的中间地带的尼日利亚。两种植物展示活动在体外antiplasmodial和在活的有机体内抗疟化验。他们也缺乏细胞毒性测试对KB细胞时,证明他们的用于治疗发热性疾病。详细调查获得通过分馏和隔离活性化合物从这些植物可能导致鉴定的化合物可以作为有用的抗疟药物发现和开发。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到联合国儿童基金会的支持/联合国开发计划署/世界银行/世卫组织热带病研究和培训特别规划980046年(ID)。作者感谢生物鉴定研究中心的研究设施,NSTDA,泰国,进行细胞毒性测试。

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