甲醇提取的Euchelus阿斯皮尔防止老鼠的骨质模型中骨吸收

文摘

海洋软体动物是广泛分布在世界各地,许多具有生物活性的化合物具有抗病毒,抗肿瘤,antileukemic和抗菌活动在世界范围内已报告。本研究旨在调查甲醇提取物的有益作用Euchelus阿斯皮尔(EAME)雌激素缺乏诱导骨质疏松症在模型小鼠的骨质。42女性瑞士白化小鼠被随机分配到虚假的操作(虚假)组和六(OVX)子组的骨质如OVX车辆(OVX);OVX与雌二醇(2毫克/公斤/天);OVX EAME的分级剂量(25、50、100和200毫克/公斤/天)。骨代谢标志物如血清碱性磷酸酶(ALP)、血清酸性磷酸酶(ACP)、血清钙和组织学胫骨和子宫的调查进行分析。Metaphyseal DNA股骨骨的内容也进行了研究。Antiosteoclastogenic活动EAME检查。EAME管理能够减少增加骨代谢标记在老鼠的骨质。Histomorphometric分析显示增加骨小梁分离的小梁形成和恢复EAME治疗。Metaphyseal OVX小鼠的DNA股骨的内容增加了EAME管理。 EAME also showed a potent antiosteoclastogenic behaviour. Thus, the present study reveals that EAME was able to successfully reduce the estrogen deficiency induced bone loss.

1。介绍

骨质疏松症是一种骨骼脆弱的条件以骨量减少和骨组织的microarchitectural恶化,由此增加骨折的风险(1]。骨质疏松症是一个世界性的健康问题,不仅在西方国家盛行的疾病也在亚洲和拉丁美洲2]。妇女被发现有比男性更容易罹患骨质疏松症的比例1.6:1。绝经后骨质疏松症源于停止更年期卵巢功能的提高和延长骨质流失的特征的快速阶段绝经后早期(3]。与重大的发病率,死亡率,降低生活质量,并增加卫生保健。大约在3 50多岁妇女一生中经历了骨质疏松性骨折。女性骨质疏松症和骨折主要发生在绝经后雌激素减少的结果和结果的不平衡由破骨细胞骨吸收和骨形成成骨细胞,导致净骨质疏松与每个改造周期。雌激素不足还可以将侵蚀深度通过扩展改造周期通过增加破骨细胞的吸收阶段由于其寿命减少细胞凋亡(4]。

雌激素替代疗法(ERT)和组合激素替代疗法(CHRT)是两种药物治疗通常规定补充的激素水平下降在绝经后妇女5]。Cauley等人的研究表明,激素替代疗法(HRT)可以显著提高骨矿物质密度(BMD),减少椎脊柱骨折的风险,较低的手臂、腰部和臀部不管以前的历史地区,年龄、家族历史、吸烟、饮酒状况,BMD,或骨折风险率(6]。妇女健康倡议(WHI)表明,然而,荷尔蒙替代疗法的长期风险大于好处。它与冠心病有关,乳腺癌和中风。在大多数国家,荷尔蒙替代疗法是只对更年期症状,建议剂量尽可能小,在有限的一段时间。因此,荷尔蒙替代疗法已不再推荐作为一个得力治疗骨质疏松症的预防和治疗。因此,治疗绝经后骨质疏松女性的终极目标是确定化合物不仅降低骨折的风险,也有最小的副作用。

尽管无数的潜在的健康益处的海洋bioactives,很少有相关的数据可能对骨质疏松症的预防作用。努力是需要扩大海洋为基础的药物发现包括骨质疏松疾病,需要广泛和迫切关注的新疗法。

Euchelus阿斯皮尔属于类的海洋软体动物,腹足纲,是shell-oriented动物。它是常见沿整个西海岸,在印度东南海岸延伸到(7]。它可以发现低潮标志附近的岩石海滩上。它是被当地人。有机基体从软体动物的壳有可能调节碳酸钙沉积和结晶。生物矿化是一个至关重要的元素生物,以保护自己免受掠食者和形成多细胞聚集,例如,在细菌生物膜的形成,或在多细胞生物中,例如,在动物和植物8]。生物矿化是一个高度策划软体动物的生物过程。软体动物指导有机基体的结晶和晶体的沉积和速率也受激素控制产生的软体动物(9]。早些时候我们小组的研究表明,醚溶性部分Euchelus阿斯皮尔(运算单元)表现出免疫抑制活性在活的有机体内通过空斑形成实验(10]。在目前的研究中我们试图调查antiosteoporotic甲醇提取物的效果Euchelus阿斯皮尔(EAME)。

2。方法和材料

2.1。制备EAME及其分馏

生物体暴露在退潮的时候收集的岩石海岸各庄Danda,孟买,印度马哈拉施特拉邦。是deshelled和甲醇的体重是cold-percolated 3 - 4天。由此产生的甲醇提取物是过滤和剩余动物质量再次沉浸在新鲜甲醇。这个过程被重复,直到甲醇提取成为无色。过滤提取是汇集和集中在减压和原油橡皮糖甲醇提取获得的收益率为1.25%。这是冷藏−20°C到进一步使用。

2.2。动物和治疗

女性瑞士白化动物屋的老鼠在18到22岁的g维护ACTREC被用于这项研究。本研究是动物伦理委员会批准的机构(ACTREC IAEC)、塔塔纪念中心,孟买,印度。他们用标准实验室饮食和水随意。小鼠随机分为7组,每组6动物组成。

A组。虚假的控制老鼠处理车辆(虚假的控制)。

B组。双边切除卵巢的控制处理车辆(OVX)。

C组。双边切除卵巢的控制处理estradiol-2毫克/公斤体重(积极的控制)。

D组。双边切除卵巢的控制处理EAME 25毫克/公斤体重。

E组。双边切除卵巢的控制处理EAME 50毫克/公斤体重。

F组。双边切除卵巢的控制处理EAME 100毫克/公斤体重。

G组。双边切除卵巢的控制处理EAME 200毫克/公斤体重。

所有老鼠都是双边切除卵巢的与氯胺酮麻醉的后+甲苯噻嗪。经过7天的康复手术恢复期,动物组D, E, F, G和口服药物通过与EAME胃管,25岁,50岁,100年,和200毫克/公斤体重EAME,分别。车辆或提取溶解在水消毒,每天服用4周。动物对照组A和B收到水(车辆控制)和C组雌二醇(积极的控制)。动物的体重记录每周在实验期间。

2.3。体重的测量

在完成实验周期,最后身体重量的动物的所有7组记录。深麻醉下的动物被牺牲在预定日期和鲜重的子宫被记录。

2.4。生化估计

2.4.1。估计血清钙、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶

血液收集retroorbital地区和离心机1500 g×20分钟。血清立即分开,是储存在−80°C。血清碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)活动估计spectrophotometrically 510海里使用跨诊断工具包,跨度诊断有限公司,印度。血清也分析钙的存在。据估计,干化学生化分析仪体外DT60II。

2.5。组织学检查

2.5.1。组织收集和处理

胫骨和子宫在迅速收获和固定Bouin的解决方案2 h,其次是脱钙作用于胫骨硝酸为5%,在酒精脱水,二甲苯清算,最后进一步在石蜡包埋组织切片和组织学染色(11]。

2.6。Metaphyseal DNA内容

测量骨DNA含量、股骨骨的metaphyseal组织动摇了4.0毫升的冰冷的0.1 M氢氧化钠溶液均化后24 h骨头组织(12]。碱性萃取后,样本在10000×g离心5分钟,上层的收集。DNA含量的上层的决心使用方法二苯胺反应和表达的DNA毫克/克湿重的骨组织13]。

2.7。细胞MTT测定的可行性分析

从瑞士白化小鼠脾脏被移除(在18到22岁的g)在无菌条件下和脾细胞被孤立。淋巴细胞被Ficoll-Hypaque试剂隔离。在96孔板的小鼠脾细胞被镀在浓度为1.5×10⁵细胞/。EAME在DMSO溶液溶解,稀释rpmi - 1640年准备补充10%的边后卫和细胞培养72小时。在5%的公司₂在37°C。对照组接受相同数量的DMSO溶液。淋巴细胞的一般扩散指出了减少黄色染料3 - (4 5-dimethythiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)形成一个蓝色的产品。后4小时。甲瓒产品的孵化,MTT (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在DMSO溶液溶解,减少和吸光度是使用多平台的读者阅读。药物作用是量化比例的控制减少染料的吸光度540海里。细胞毒性浓度范围内的检查EAME 0.97 -500μ克/毫升(14]。

2.8。在体外Osteoclastogenesis

骨髓细胞分离的骨髓4 - 6周大的老鼠。股骨的骨的两端都是截止,骨髓腔冲洗α最小基本介质(αmem Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。洗了获得的骨髓细胞αmem和培养在同一介质含胎牛血清(的边后卫)1×10⁷在24孔板细胞/毫升,在10 ng / mL - csf在37°C公司5%₂。24小时后,不依从细胞进一步培养盖玻片在35毫米文化菜1×10的浓度⁶细胞/毫升和孵化30 ng / mL巨噬细胞集落刺激因子(csf) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和30 ng / mL核因子kappa-B配体受体激活剂(RANKL) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。一半的取代原有的媒介新鲜中第三和第六天。提取物添加到培养基初当时文化和媒介变化从200年在不同浓度μ12.5 g / mLμ克/毫升。这些细胞被培养为7天(15]。

7天后在文化、贴壁细胞被固定并使用陷阱陷阱染色进行解决方案(16]。简单地说,细胞与柠檬酸缓冲丙酮固定。固定细胞培养1小时。在室温下在包含10毫米醋酸缓冲酒石酸钠和磷酸萘酚AS-MX (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)作为底物和快速红紫磅盐(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)的染色反应的产品。陷阱(+)多核细胞含有三个或三个以上核被算作osteoclast-like细胞。

2.9。统计分析

数据提出了意味着±SEM和分析学生的t以及或单向方差分析其次是图基的测试。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。体重的测量

治疗4周后最终身体重量的组之间没有显著不同的组(数据没有显示)。

OVX引起萎缩的子宫组织相比,虚假的组。这个子宫萎缩是由于卵巢的雌激素提供的损耗,从而表明卵巢已经完全由手术便可以切除。这种萎缩的子宫组织反映在他们的重量。ovariectomy-induced萎缩的子宫被雌二醇部分预防治疗。EAME剂量的200、100和50毫克/公斤引起uterotrophic效应通过减少萎缩引起的子宫卵巢切除术(表1)。

3.2。生化估计

3.2.1之上。估计血清钙、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶

OVX小鼠高释放血液中的血清钙与虚假的集团()。这个版本的钙OVX小鼠被EAME镇压100年,50岁和25毫克/公斤治疗的价值与意义。EAME 200毫克/公斤治疗组显示增加血清钙与OVX组(表1)。

高山和ACP是骨形成和骨吸收标记,分别估计,可以探讨骨周转率(17,18]。高山和ACP值记录在第一和第四星期EAME口服。高山和ACP值后第一周的口服被发现是随机的(图1(一))。实验结束时(经过4周的口服),OVX的高山活动是高于虚假的集团()。同样OVX小鼠也增加了机场核心计划活动。治疗EAME 200、100、50 (),25毫克/公斤()可以显著降低高山水平增加,而EAME 200毫克/公斤(),100毫克/公斤(),50毫克/公斤(),25毫克/公斤()治疗组还显示减少机场核心计划值与OVX组。雌二醇治疗也可以有效地降低升高的高山和ACP活性(图1 (b))。

3.3。组织学检查胫骨和子宫

胫骨的组织学研究显示稀疏,打乱了小梁骨和骨髓空空间的OVX小鼠EAME治疗组。虚假的控制老鼠好胫骨小梁形成,骨髓空间。恢复小梁网少intertrabecular空间在EAME 200毫克/公斤,100毫克/公斤和50毫克/公斤。雌二醇治疗组也展示了一些改善的小梁形成(图2)。

OVX组显示许多明显外翻和增生的上皮细胞也被观察到。OVX组显示数量的减少子宫腺体出现萎缩。EAME 200毫克/公斤,EAME 100毫克/公斤,EAME 50毫克/公斤抑制子宫上皮失真。OVX控制老鼠的增生减少EAME治疗。EAME治疗可以保持完整无缺的间质组织类似于虚假的对照组。雌二醇治疗组,子宫腺体肿大和萎缩,上皮细胞显示失真的雌二醇治疗组。EAME治疗组显示没有这样的失真子宫腺体相似的假对照组(图3)。

3.4。Metaphyseal DNA内容

骨骼生长也可以通过调查研究其DNA含量也揭示了许多骨细胞包括破骨细胞,成骨细胞和骨细胞骨细胞(19]。metaphyseal组织DNA含量增加了EAME治疗(图4)。EAME 200毫克/公斤(),100毫克/公斤(),50毫克/公斤()增加了metaphyseal DNA含量与OVX相比。虚假的控制也增加了metaphyseal DNA内容但没有发现是重要的。

3.5。细胞MTT测定的可行性分析

为了选择生物的浓度,细胞毒性的提取测定小鼠脾细胞。如图5,比例生存的细胞治疗EAME被发现超过控制暴露没有细胞毒性EAME对细胞的影响。EAME没有任何细胞毒性的浓度范围500μ0.97 g / mLμ克/毫升。

3.6。在体外Antiosteoclastogenesis

Anticlastogenic EAME呈现在图的数据6这表明RANKL-mediated EAME抑制破骨细胞形成明显的浓度50μ克/毫升()和25和100μ克/毫升()。

4所示。讨论

绝经后骨质疏松症是一种estrogen-deficient状态表现为骨质疏松,骨吸收和骨形成之间的平衡转向增加骨吸收的水平(20.]。荷尔蒙替代疗法的安全性受到由于其合规问题严重的副作用。因此,它似乎是合理的和逻辑寻找物质副作用比雌二醇希望识别一些天然营养补充剂,减少更年期症状,也许,有利于骨没有与荷尔蒙替代疗法相关的负面影响。

骨质(OVX)小鼠或大鼠模型模拟骨代谢的变化观察到绝经后骨质疏松症和被认为是黄金标准临床前模型对绝经后骨质疏松21]。在小鼠卵巢切除术的结果在松质骨周转率增加导致骨量减少(22]。雌二醇是作为积极的控制在我们的研究中,因为它是被证明有骨保护作用,具有良好的骨合成代谢活动在活的有机体内(23]。

在目前的研究中,我们试图探讨口服甲醇提取物的效果Euchelus阿斯皮尔雌激素缺乏导致骨质流失。雌激素物质的uterotrophic效应导致子宫湿重的增加,这是一个终点利用标准uterotrophic试验(24]。明显萎缩的子宫被用作证据卵巢切除术的成功,因为雌性激素直接影响子宫重量(25]。的子宫重量减少卵巢切除术是由EAME补充比虚假的建议EAME uterotrophic活动的化合物存在。骨作为水库的钙和磷。磷酸盐和维生素D衍生品降低血钙过多的风险(26]。在我们的研究中,口服EAME抑制血清中钙的损失表示它在生理作用钙水平。

骨代谢标志物临床可靠预测失衡骨形成和骨吸收,因此,预测骨质流失的速度(27]。碱性磷酸酶(ALP)是一个关键酶对骨骼钙化和提供了一个骨形成细胞分化指数(17]。酸性磷酸酶(ACP)、骨吸收的一个重要标志,积极与histomorphometric指数的骨吸收。众所周知,雌激素降低血清水平的这些标记(18]。血清浓度的高山和ACP也显著大于控制老鼠的骨质显示骨周转率高,减少EAME管理。绝经后骨质流失是由于快速的骨代谢,骨重建高。更年期女性显著增加骨吸收超过地层由于低水平的雌激素从而诱导加速骨质流失(28]。在目前的研究还卵巢切除术显示高装修增加骨代谢标志物减少EAME补充。

增加骨重建与瞬态亏损骨骼,软骨下地区孔隙度增加,并降低密度(29日]。OVX组老鼠显示的胫骨骨痂形成和一个空的骨髓与骨小梁减少近端胫骨。然而,重塑线条老鼠的骨质后,观察其与EAME 4周类似于虚假的对照组。组织学评估建议EAME诱导新在近端胫骨松质骨的形成地区在同等程度上见虚假的控制。Norzoanthamine,隔绝Zoanthussp,属于刺胞动物门的海洋生物,保护作用的肱骨骨小梁和皮质骨的骨质的小鼠模型。Norzoanthamine也加速形成collagen-hydroxyapatite复合骨有助于骨形成,因此它可以是一个有前景的候选药物对骨质疏松症的治疗和预防30.]。

OVX组的组织学评估子宫上皮细胞显示许多明显外翻和上皮细胞的增生。EAME治疗小鼠没有任何上皮细胞的增生和外翻。也在目前的研究中,雌二醇治疗小鼠表现出子宫内膜增生的骨质。类似的结果是由以前的研究报道与炔雌醇治疗骨质产生显著增加小鼠子宫内膜厚度、子宫内膜上皮高度,和子宫内膜腺体的数量31日]。但EAME没有显示任何雌激素效应所看到的雌二醇治疗。尽管类似的对骨的影响,提取并没有模仿雌激素的副作用在生殖组织。谢等人进行的类似研究的植物提取物草epimedii骨,也产生了有益的影响没有诱导生殖器官(潜在的有害影响32]。

骨骼组织DNA含量是索引的骨骼生长和骨细胞的数量19]。补充含锌的摄入量和的结合β玉米黄质(10⁻⁹米)+锌(10⁻⁶米)被发现导致碱性磷酸酶活性显著增加,生长板和metaphyseal组织中DNA含量在大鼠33]。山口等人的研究表明锌的synergestic效果β隐黄质骨组件通过研究影响metaphyseal DNA含量(34]。在目前的研究中,DNA含量metaphyseal组织增加了EAME治疗。

通过激活破骨细胞骨吸收与后续沉积新矩阵的成骨细胞引起骨骼结构的形成和骨重建。不平衡骨形成和骨吸收是关键病理生理事件在许多成年人骨代谢障碍,包括骨质疏松、骨质流失的结果(35]。因此,因此认为药物提高成骨细胞的活动,促进骨生成和抑制破骨细胞的活动推迟骨质溶解在骨质疏松症的理想药物。

的在活的有机体内研究了antiosteoporotic EAME效果很好。我们旨在进一步研究这种效应是否反映在破骨细胞通过展示的antiosteoclastogenesis提取。破骨细胞被培养的小鼠骨髓细胞RANKL的存在,csf和提取物。从EAME我们发现小说抑制剂筛选染色陷阱活动参与破骨细胞的成熟破骨细胞的骨吸收过程。陷阱被认为是组织化学标记的破骨细胞和破骨细胞中高度表达在正常条件36]。EAME显著降低的RANKL诱导破骨细胞的形成。骨流失过多的破骨细胞形成的结果,而不是损害成骨细胞活动。因此,药物的发展,调节破骨细胞的形成是很重要的预防骨骼疾病。与这些结果一致,Iejimalides获得海洋被囊类动物Eudistomacf。rigida这是独一无二的24 member-macrolides显示antiosteoporotic活动通过抑制破骨细胞(37]。我们以前的调查表明,软体动物涡轮brunneus抑制骨吸收的作用于T细胞减少肿瘤坏死因子α负责成熟破骨细胞分泌,还揭示了一种强有力的antiosteoclastogenic活动(38]。

总之,目前的研究表明,EAME能减少骨质流失迅速发生在老鼠导致不平衡的骨质代谢利用双边老鼠的骨质模型。我们的证据清楚地表明Euchelus阿斯皮尔可以被认为是一个自然选择激素替代治疗绝经后妇女骨质疏松的预防和治疗。进一步的研究需要阐明和识别生物活性化合物存在于EAME开出抗再吸收效应的的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者要感谢美国生物技术(印度生物技术部),BT /公关/ 10171 / AAQ / 03/378/2007提供财政支持。

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