遗传变异影响TLR43'UTR的非小细胞肺癌遗传易感性

摘要

Toll样受体（TLR）表示不仅在免疫细胞中，而且在多种肿瘤细胞的。单核苷酸多态性位于所述的TLR（SNP）的启动子或3'非翻译区可以通过影响启动子的活性或调节mRNA的结合的miRNA影响基因表达。这项研究旨在探讨的SNP中TLR基因的易感性的非小细胞肺癌的关联。此病例对照研究涉及700名肺癌患者和700个健康对照。所有个体进行基因分型，使用聚合酶链反应为基础的测试（PCR）限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和TaqMan SNP基因分型测定法中TLR基因所有选定的SNP。与易感性NSCLC的TLR遗传变异的相关性，通过用或无条件的逻辑回归（95％CI）来评价。评估转录因子或miRNA的生物信息学方法结合能力后，六Toll样受体，确定了进一步分析。我们没有发现TLR3rs5743303，TLR4rs1927914号，TLR4rs11536891，TLR5rs1640816和TLR7rs3853839用非小细胞肺癌风险（ ）。我们的数据显示，TLR4rs7869402 C > T polymorphism reduced the risk of NSCLC with OR (95% CI) of 0.63 (0.45–0.89). When stratified by gender and age, the individuals carrying at least one rs7869402T allele significantly decreased the NSCLC risk among males (OR = 0.58, 95% CI = 0.38–0.87) and among youngsters (OR = 0.43, 95% CI = 0.27–0.69). Smoking stratification analysis showed that the rs7869402T allele-containing genotype reduced the risk of NSCLC with OR (95% CI) of 0.50 (0.29–0.87) among smokers but not among nonsmokers ( ）。When the individuals were classed by the pathological type, we found that the rs7869402T-containing genotype was associated with the risk of adenocarcinoma (OR = 0.62, 95% CI = 0.41–0.92) but not with that of squamous cell carcinoma (OR = 0.71, 95% CI = 0.44–1.13) and other types (OR = 0.23, 95% CI = 0.03–1.70). Compared with theTLR4一个_rs1927914号-C类_rs7869402-T型_rs11536891单倍型，对于g_rs1927914号-T型_rs7869402-T型_rs11536891单倍型与非小细胞肺癌发病风险降低相关，OR（95%CI）为0.57（0.41-0.80）。这些结果表明TLR4rs7869402变化影响的遗传易感性的非小细胞肺癌。

一。介绍

癌症是全球主要的公共卫生问题。2018年，全球新增癌症病例1810万，癌症死亡960万，其中肺癌最为常见[1，2]。非小细胞肺癌（NSCLC），作为主要类型的肺癌，是多基因和环境因素，如吸烟，大气污染，和职业暴露的相互作用的结果。

在癌症的发展过程中，免疫系统对抗恶性细胞是一个重要的过程。免疫系统杀死或消除恶性转化细胞。反过来，恶性细胞为了促进自身的发育而逃避免疫监视。Toll样受体是进化上保守的天然免疫受体，属于模式识别受体（PRR），它识别微生物的特定分子结构（PAMPs和DAMPs）。在识别PAMPs或DAMPs后，TLRs招募并激活下游分子，如TRIF和MyD88，然后激活NF-κB诱导产生I型干扰素和炎症因子[3]。

Toll样受体表达不仅在免疫细胞，而且在多种肿瘤细胞。一些研究表明，TLR2，TLR4，和TLR9肺癌组织比正常肺组织高表达[4-6]。的沉默TLR4通过siRNA可促进细胞凋亡和转移，抑制肺癌细胞生长[7，8]。高架TLR5表达容易发生NSCLC患者中改善的预后[9]。的表达TLR7也与预后不良和对新辅助化疗的抵抗有关[10个]。

单核苷酸多态性（SNP）广泛存在于基因组中，是最常见的遗传变异类型。位于启动子区域的snp可能通过改变转录因子的结合能力来影响启动子活性。位于3′非翻译区的snp可能调节miRNA的结合，进而影响mRNA的翻译效率。

Toll样受体发挥各种肿瘤的发病机制中起重要作用。通过生物信息学分析，我们发现了6个单核苷酸多态性可能影响的功能TLR4。在这项研究中，我们探讨是否这些潜在的功能变异体与非小细胞肺癌的风险。

2。材料和方法

2.1。研究人群

这组设计的病例对照研究包括700名例NSCLC患者和700个健康对照。非小细胞肺癌病例从2012年在唐山公人医院和科学技术的中国北方大学在中国人民医院收集至2014年。所有的NSCLC病例组织病理学证实。无放疗或抗肿瘤化疗采血前进行。在样品取样，性别，年龄，病理类型，和肺癌患者的阶段的时间并不仅限于。与肿瘤既往史的患者被排除在外。健康对照者中，当参与癌症患者同一时期从唐山地区体检人群招了。所有健康控制性别和年龄（5岁）患有癌症和频率匹配的案件没有历史。所有参加者签署知情同意书。这项研究是由科学技术的中国北方大学的机构审查委员会的支持。

2.2。SNP选择

基于在dbSNP的数据库和ENSEMBL数据库中的数据，我们筛选TLR的其分别位于所述启动子区和3'非翻译区（UTR）的SNP（TLR3，TLR4，TLR5，和TLR7). 选择小等位基因频率大于0.05的SNPs预测可能的功能。对于TLRs启动子区的SNPs，用TRANSFAC程序预测转录因子结合能力。用mirSNP和SNPinfo程序预测3′UTR中的snp与microRNA的结合能力。

2.3。在TLR变体基因分型

聚合酶链反应（PCR）限制性片段长度多态性（RFLP）分析和TaqMan SNP基因分型测定法中施加用于基因分型[11个，德意志北方银行]。基因分型TLR4用PCR-RFLP技术检测rs1927914和rs7869402的变异。用于识别TLR4rs1927914或TLR4rs7869402多态性为5′-tagcatgaaaatgaagaggagatagggg-3′/5′-gagcttaggatgaaatgggg-3′和5′-tggggatccctcccccctgtagc-3′/5′-agggattgcccacagg-3′。6 进行PCR检测μL PCR reaction mixture with 2 × Taq PCR StarMix, 0.1 μM each primer, and 20 ng genomic DNA. The thermal cycling conditions forTLR4rs1927914号和rs7869402variants were 5 min at 94°C followed by 30 cycles (30°s at 94°C, 30°s at 58°C, and 30°s at 72°C) and 5 min at 72°C. PCR amplification products forTLR4rs1927914号一个 > G (524 bp) andTLR4rs7869402 C > T（102 bp）被Nsi消化一世（NEB，Ipswich的，MA，USA）和ALU一世（NEB，Ipswich的，MA，USA）。DNA测序来证实的PCR-RFLP的结果的准确度（图1和2）。将10％的样品被随机选择且regenotyped，并且发现的所有结果为100％一致。基因分型等遗传变异（TLR3rs5743303，TLR5rs1640816和TLR7rs3853839）中的溶液使用TaqMan SNP基因分型测定（C_27310258，C_8812434，和C_2259573）（赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，USA）进行。

2.4条。统计分析

所有的分析都用SPSS23.0（SPSS公司，芝加哥，USA）进行。受试者的基本信息（性别，年龄，吸烟状况）被分析χ²测试。对照组中所有测试的SNP的Hardy-Weinberg平衡（HWE）通过估计χ²测试。在调整了可能的混杂因素后，遗传变异的在关联Toll样受体与易感性NSCLC通过用非条件Logistic回归OR（95％CI）进行评价。

3.结果

3.1。学科特色

700名NSCLC患者和700个健康对照组的基本信息汇总表1。的情况下组中的性别和年龄的分布是与那些控件组中（一致 ）。病例组吸烟者比例为44.4%，高于健康对照组（28.1%）( ）。累计吸烟的情况下，与对照组之间的分布无显著差异（ ）。在所有NSCLC病例中，有402例腺癌（57.4％），279例鳞状细胞癌（38.6％），以及28例其他病理类型（15腺鳞癌，5大细胞癌，8例支气管的癌）。

3.2。TLR变种协会与非小细胞肺癌的风险

该SNP信息示于表2. 各遗传变异与非小细胞肺癌易感性的关系如表所示3。频率TLR4病例组和对照组rs7869402 CC、CT和TT基因型分别为90.7%、9.0%、0.3%和86.0%、13.3%和0.7%。结果表明，与CC基因型携带者相比，至少有一个T等位基因的个体降低了非小细胞肺癌的发病风险（OR = 0.63，95%CI = 0.45–0.89）。我们没有发现其他snp在TLR3，TRL4，和TLR7病例和对照组之间。

3.3。的分层分析TLR4变体和非小细胞肺癌风险

进一步分析TLR4rs7869402的遗传变异和非小细胞肺癌的风险，我们的性别，年龄，吸烟状况和病理类型（表进行分层分析4）。当按性别分层，男性与至少一个T等位基因具有NSCLC的比那些与CC型或0.58（0.38-0.87）（95％CI）的风险较低。TLR4rs7869402不与女性之间的非小细胞肺癌的风险与OR为0.78（0.43-1.41）（95％CI）相关联。一世ñstratified analysis by age, the younger subjects (age ≤ 60) carrying at least one T allele had a decreased risk of NSCLC with OR (95% CI) of 0.43 (0.27–0.69), which was not found among old subjects. When stratified by smoking status, compared with CC genotype carriers, the T allele-containing genotype contributed to a reduced risk of NSCLC (OR = 0.50, 95% CI = 0.29–0.87) among smokers but among nonsmokers (OR = 0.74, 95% CI = 0.49–1.13). Further stratification analysis of smoking levels showed that the T allele-containing genotype contributed to decreased risk of NSCLC among light smokers (≤30 packs/year) with OR (95% CI) of 0.46 (0.23–0.92) but not among heavy smokers with OR (95% CI) of 0.44 (0.17–1.14). A stratified analysis of different pathological types revealed that individuals with at least one T allele were associated with the risk of adenocarcinoma with OR (95% CI) of 0.62 (0.41–0.92) but not with the risk of squamous cell carcinoma with OR (95% CI) of 0.71 (0.44–1.13) and other types of NSCLC with OR (95% CI) of 0.23 (0.03–1.70).

3.4。的单倍型分析TLR4变体

为了评估多个snp相互作用对NSCLC风险的影响，我们使用SHE-sis在线程序测试统计推断的单倍型与NSCLC风险的相关性。我们的结果显示TLR4单倍型的G_rs1927914号-T型_rs7869402-T型_rs11536891非小细胞肺癌患者和健康对照组之间有统计学差异（表五). 与TLR4一个_rs1927914号-C类_rs7869402-T型_rs11536891单倍型，对于g_rs1927914号-T型_rs7869402-T型_rs11536891单倍型相关的一个与OR为0.57（0.41-0.80）（95％CI）发展非小细胞肺癌风险降低。

四。讨论

本研究探讨了TLR基因的遗传变异和易感性非小细胞肺癌之间的关系。我们筛选在启动子和TLR的3'UTR可能影响由生物信息学预测的基因表达6个SNP。我们的发现表明，TLR4rs7869402 C > T variation decreased the risk of NSCLC. However,TLR3rs5743303，TLR4rs1927914号，TLR4rs11536891，TLR5rs1640816和TLR7rs3853839的基因变异与NSCLC风险。这些研究表明，TLR4rs7869402 C > T变异可能参与NSCLC的发病和进展。

人类TLR家族共有10个基因亚型[13个]。TLR4是研究最早、最广泛的toll样受体之一。TLR4位于9号染色体上，包含四个外显子。TLR4通过在肿瘤微环境中诱导M2巨噬细胞浸润和血管生成，参与细胞凋亡、MyD88依赖和独立的信号转导或其他生物学过程，参与肿瘤的发生和发展[14个-16个]。有研究表明，TLR4过表达在肺癌组织中，和的敲低TLR4能促进A549细胞的细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的生长[17岁]. 因此，TLR4可能成为肺癌早期筛查的敏感性生物标志物，提高肺癌患者的生存率。在这项研究中，我们首次展示了关键的关系中Toll样受体的调节区域和非小细胞肺癌的风险的变体，结果发现TLR4rs7869402 C > T与非小细胞肺癌的风险相关。在一项卵巢癌研究中，研究人员发现TLR4rs7869402变化减少卵巢癌的总体存活[18岁]。在口腔鳞状细胞癌的研究，TLR4rs7869402多态性曾与肿瘤发生，发展和无进展生存期[无关联19个]。对于TLR4的其他单核苷酸多态性，rs1927914影响各种肿瘤的风险，包括肝癌[20]， 前列腺癌 [21]，胃癌[22]，和恶性黑色素瘤[23]而不是肝癌的危险[24]。Shi等。发现无相关性TLR4rs11536891突变与前列腺癌的风险或死亡，而Tsilidis KK等。表明TLR4rs11536891与结直肠癌易感性相关[25]。

肿瘤的发展是与年龄和性别。在性别和年龄层次分析，我们发现至少有一个TLR4rs7869402T等位基因在男性，低年龄组患肺癌的风险降低。此外，环境因素如吸烟，空气污染和职业环境被认为是肺癌的危险因素[26]。TLR4直接与环境，这可能对肺癌的贡献效果相互作用。吸烟分层分析表明，TLR4rs7869402T等位基因降低吸烟者但不吸烟者中肺癌的风险。这些结果表明，TLR4rs7869402的遗传变异可能会影响肺癌的风险，由于遗传和环境的相互作用。

TLRs调控区的关键snp可能改变基因的功能，进而影响肺癌的进展。总之，我们的结果提供了新的证据TLR4有助于肺癌的发展。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

道德认可

所有研究程序均经华北科技大学（唐山）伦理委员会批准。

同意

所有参与研究的个体均获得知情同意。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

红椒吴晖高同等贡献这项工作。所有作者同意的手稿出版的最终版本。

致谢

作者感谢所有的患者和对照组的参与。这项工作是由中国国家自然科学基金（81272613到十张），科学基金为河北科学委员会（H2012401022到十张），河北省创新团队领军人才培养计划杰出青年基金（LJRC001支持到十张），以及中国的河北省自然科学基金（H2017209233）。

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