口腔磷酸酯基转移酶基因的过度表达增强了5-氟尿嘧啶在头部和颈部鳞状细胞癌中的作用体外

摘要

5-氟尿嘧啶(5-FU)是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)广泛应用的药物。在5-FU合成代谢途径中，药物激活的第一步是5-FU被oroate磷酸核糖基转移酶(OPRT)磷酸化，OPRT在5-磷酸核糖基-1焦磷酸存在下直接代谢5-FU生成5-氟嘌呤单磷酸(FUMP)。迄今为止，肿瘤中OPRT的表达与接受5- fu化疗的癌症患者的临床反应或生存有关。在本研究中，我们检测了在头颈部鳞状细胞癌中OPRT表达是否与5-FU的化疗敏感性和细胞增殖相关。我们在HNSCC细胞系中构建表达了OPRT cDNA。OPRT表达对体外检测细胞生长和5-FU的细胞毒性。转染OPRT可增加5-FU的细胞毒性而不影响HNSCC细胞的增殖体外．这些结果表明，OPRT表达在HNSCC至5富化疗的敏感性中起着重要作用。

1.介绍

5-氟尿嘧啶(5-FU)以单药或与顺铂联合的形式最常用于治疗头颈部鳞状细胞癌[1]和结直肠癌系统治疗的选择药物[2］．然而，目前在治疗过程中5-FU耐药已成为普遍现象，这是癌症治疗失败的重要原因[3.］．

据报道，5-FU及其衍生物的反应率是由于酶活性的合成和分解代谢的酶活性。在5-FU的合成代谢途径中，用磷酸磷基转移酶（OPRT）的磷酸化的第一步是5-FU的磷酸化，其在5-磷酰基-1-焦磷酸盐[4］．这一步骤是5-FU激活最重要的机制。迄今为止，肿瘤中的OPRT表达与接受5级化疗的癌症患者的临床反应或存活有关[5，6］．然而，没有研究直接证实了肿瘤内OPRT表达水平的调节是否会影响HUNC 5-FU和细胞活性的疗效。因此，我们研究了OPRT的过表达是否能提高对5-FU的敏感性。

在本研究中，为了探讨OPRT在HNSCC生物调控中的作用，我们在HNSCC细胞系中构建了OPRT互补DNA (cDNA)。OPRT对体外检测细胞生长和5-FU的细胞毒性。

2。材料和方法

2.1。细胞系

人体头部和颈部鳞状细胞癌细胞系，YCu-H，由M. Tsukuda博士在RPMI 1640培养基中培养，并补充了10％胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素1000 IU /ml（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）。将细胞保持在37℃下的潮湿培养箱中，在5％的CO₂．

2．2．载体构建与转染

将包含整个编码序列的全长人类OPRT cDNA(由Taiho Pharmaceutical Co.， Tokyo, Japan提供)以其意义定向亚克隆到表达载体pTARGET的Eco RI-Kpn I位点。根据供应商描述的条件，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)脂质体介导转染pTARGET- oprt质粒和pTARGET载体对照质粒，稳定转染人YCU-H细胞。转染48小时后，在含500的完全培养基中选择转导细胞μ.g/mL基因素(Invitrogen) 2 ~ 3周。选择后，用克隆环随机分离独立的单个无性系，每个无性系分别接种。

2.3。培养细胞的蛋白质印迹分析

如之前报道的那样进行Western blot分析[7，8检测OPRT在YCU-H细胞系中的表达。使用M-Per哺乳动物蛋白提取试剂和“考马斯西”蛋白检测试剂试剂盒(Pierce, Rockford, IL)提取细胞总蛋白并进行定量。等量(10μ.g)细胞裂解液经sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉在PBS中封闭膜1小时，然后用纯化的抗OPRT多克隆抗体(由Taiho Pharmaceutical Co. Ltd.，东京，日本)或抗抗体孵育β-actin抗体(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA)，用于在37°C下负载控制1小时。然后将这些膜与hrp标记的山羊抗兔Ig G二抗在室温下孵育1小时，然后使用增强化学发光(ECL)系统(Amersham International, Buckinghamshire, UK)进行检测。

２.４.体外增殖测定

转染的克隆和载体对照克隆细胞（将细胞/盘子接种在RPMI 1640培养基中加入35mm的盘子加入10％FBS。使用Coulter Counter（Beckman Coulter，Ca，USA），每次48小时每48小时计数细胞的数量每48小时。平均值用于产生生长曲线。

2.5。药物敏感性测定

转染后的细胞和对照细胞以10的密度被置于96孔板中⁴细胞/孔并进一步孵育24小时。然后将培养基除去并用含有5-FU的新鲜培养基（由Kyowa Hakko Co. Ltd. overly提供）另外48小时。然后，10 μ.L无菌MTT染料(3-[4,5-二甲基噻唑-2-yl]-2,5-二苯基溴化四唑，5 mg/mL;Sigma)加入培养基，最终浓度为0.5 mg/mL, 37℃孵育2 h。在此之后，用100μ.L二甲基磺砜（DMSO）10分钟。用微孔板读取器测量550nm处的光谱吸光度。IC.₅₀值由引起50％的细胞活力的药物剂量决定。

2.6。统计分析

使用Mann-Whitney进行统计分析U测试。生存资料采用Kaplan-Meier法分析。生存区差异的显著性通过对数秩检验进行分析。差异与值<0.05被认为是显着的。

3.结果

3．1.YCU-H人头颈部鳞状细胞癌细胞中OPRT cDNA的转染

4个独立无性系在添加基因素(500μ.g / mL)。选择具有代表性的克隆H-OPRT用于后续实验。所选克隆和YCU-H细胞的OPRT水平如图所示1．H-OPRT细胞中OPRT蛋白水平较对照细胞分别提高了35倍。

3.2。体外OPRT过表达细胞系的生长

当在10％胎牛血清培养基中生长时，载体对照细胞系和OPRT转染的细胞系显示出类似的倍增时间。没有显着差异体外在OPRT过表达克隆和对照克隆之间的生长(图2）。

3．3.头颈部鳞状细胞癌中OPRT表达水平与5-FU敏感性的相关性

细胞毒性实验采用MTT法检测转染OPRT cDNA是否增加了OPRT过表达细胞对5-FU的敏感性。在H-OPRT细胞中观察到，转染OPRT的细胞对5-FU的敏感性增加。50%生长抑制(IC₅₀)值为11μ.m，低于控制细胞（IC₅₀：150 μ.米)(图3.）。

4。讨论

几十年来，5- fu及其衍生物如5 ' -DFUR和替加呋已被用于治疗癌症患者，5- fu在头颈部鳞状细胞癌中的疗效已得到充分证明。然而，耐药肿瘤细胞的存在，也会与其他化疗药物一起发生，导致对基于5- fu的化疗反应差[3.］．

为了将5-fu磷酸盐进入其核苷酸，已经报道了以下3个代谢途径：途径1：通过OPRT磷酸化至5-氟氨氨酸单磷酸盐（FUMP）;途径2：通过TP磷酸化至5-氟脱氧尿苷（FDUR），并通过胸苷激酶（TK）对5-氟脱氧尿苷-单磷酸（FDUMP）的顺序转化;途径3：通过Up和Unidine激酶（英国）磷酸化至5-氟尿苷（皮草）和液相转换为粉末[9，10］．因此，OPRT是负责人癌细胞中5-FU磷酸化的主要酶之一。此外，一些临床报告表明了癌症患者肿瘤活性与接受5福化疗的癌症患者的临床反应之间的关系[5，6］．但是，奥普尔特表达在HNSCC中的作用尚未建立，并且据我们所知，没有研究调查关系之间的关系体外头颈部鳞状细胞癌中OPRT表达与5-FU的细胞毒性。

为了直接确认OPRT的过度表达是否影响到5-FU的敏感性并审查OPRT在HNSCC细胞中的作用，我们在人HNSCC细胞系YCU-H中转染OPRT cDNA。结果，我们发现OPRT转染的YCU-H细胞中的内成因OPRT蛋白的35倍高表达。本研究还证明，在OPRT过表达细胞中观察到对5-FU的敏感性增加。Inaba等。通过测量人癌细胞系中的酶活性，[11］．Taomoto等人也指出OPRT过表达在提高胃癌对5-FU化疗敏感性中起重要作用[4］．目前的结果与早期的研究结果是一致的。这些结果，结合其他报道，强烈提示在癌细胞中过表达OPRT提高了对5-FU治疗的敏感性。

两组间无显著性差异体外在本研究中，在OPRT过表达细胞和对照细胞之间的生长。这些结果表明，过表达OPRT蛋白与HNSCC肿瘤细胞快速增殖无关。另一方面，在膀胱癌中，有报道称，与正常膀胱癌相比，OPRT活性上调，OPRT可能具有预后价值[12］．Miyake等。亦报道，OPRT可能在调节胰腺癌的恶性潜力方面发挥潜在作用[13］．由于OPRT表达的调节及其对肿瘤增殖的丧失仍然不明确，因此我们无法达到任何关于这种酶与肿瘤进展之间的关系的结论。

综上所述，我们的数据提示OPRT影响5-FU对头颈部鳞状细胞癌的化疗效果体外．目前的结果强烈表明，OPRT过表达在HNSCC对5-FU化疗的敏感性中起重要作用。由于OPRT表达水平可作为5-FU对头颈部鳞状细胞癌疗效的预测指标，准确预测5-FU疗效可能有助于选择患者进行更强化的治疗，包括基于CDDP的放化疗。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

参考

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3. D. B. Longley，D.P.Harkin和P. G.Johnston，“5-氟尿嘧啶：行动机制和临床策略”，自然评论癌症，第3卷，第2期。5，页330 - 338,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
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