SERPINA1基因作为治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏

摘要

-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷是一种遗传疾病，由于编码AAT的SERPINA1基因突变而产生失活/缺陷AAT。这种疾病与肺中AAT活性降低和肝脏中过量缺陷AAT蛋白沉积有关。目前还没有针对AAT缺乏引起的肝病的特殊治疗方法。AAT肺病通常用几种血清蛋白替代产品之一治疗;然而，目前还没有关于SerpinA1替代疗法有效性的长期研究，而且它也不能减少AAT缺乏症患者的肝损伤。mRNA治疗可能同时针对AAT缺陷患者的肝和肺。用SerpinA1编码的mRNA转染AAT患者成纤维细胞和AAT患者成纤维细胞来源的肝细胞，并在细胞培养基中检测SerpinA1的表达。我们的数据显示，AAT患者成纤维细胞和成纤维细胞来源的肝细胞培养液中SerpinA1蛋白增加。野生型小鼠体内研究显示SERPINA1 mRNA在肝脏和肺部的生物分布，以及在这两个靶器官中SERPINA1蛋白的表达，这两个靶器官在AAT缺乏症中受到严重影响。综上所述，我们的数据表明SerpinA1 mRNA治疗对AAT缺乏患者有潜在的益处。

1.介绍

-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是一种严重的疾病，缺乏适当的治疗。目前的治疗方法仅能保护肺部，晚期患者需要经常静脉注射血浆来源的AAT蛋白。AATD患者易患阻塞性肺疾病和肝病(如儿童和成人肝硬化和肝癌)[1-3]。患者的诊断慢性阻塞性肺疾病（COPD）约1-5％估计有α-1-抗胰蛋白酶缺乏[4]。AATD患儿肺气肿极为罕见，但已有报道[3，肝病的发病率随着年龄的增长而增加[3]。后来症状严重者出现在生活中，特别是在吸烟者。AATD的肝症状是晚期可见在生活中，往往需要肝移植。AATD是由内突变的遗传性疾病SERPINA1基因(五]。该SERPINA1基因具有标明为M等位基因两个等位基因（正常患者具有MM基因型）。导致严重的不足AAT最常见的等位基因被称为Z（E342K）6，7]。据报道，严重AATD的患者95％有ZZ的基因型和只有10-20％SERPINA1血清水平[6]。在ZZ突变SERPINA1蛋白质不能正确折叠而不会被肝细胞分泌的情况下;因此AATD不是由无法作出蛋白，但没有能力分泌功能性蛋白引起的。ZZ SERPINA1的严重肝损伤的肝细胞产生的积累[6]。纯合子PiZZ组是相当普遍，发生在1：在北美和欧洲2500-3000胎。

α-1抗胰蛋白酶（AAT），也被称为SERPINA1（丝氨酸蛋白酶抑制剂，组A，成员1），是一种分泌蛋白主要是由肝细胞和由单核吞噬细胞，嗜中性粒细胞更小的程度，并且气道/肠上皮细胞[五，8]。SERPINA1是循环糖蛋白，其也是水溶性的和组织扩散[五]。SERPINA1的主要作用是丝氨酸蛋白酶调控这一行动的主要部位是肺部。在那里，SERPINA1结合并使其失活嗜中性弹性蛋白酶，从而保护免于蛋白水解降解肺泡组织中炎症反应[9]。SERPINA1是最丰富的循环抗蛋白酶和SERPINA1的正常血浆浓度通常达到1-2G / L [五]。

AATD的特点是肝细胞粗面内质网中错误折叠的SerpinA1蛋白聚合，从而降低血液和组织中SerpinA1的浓度和活性[6]。对于严重缺乏的患者，血清SerpinA1水平低于50 mg/dL，而正常水平为200mg/dL。由于血液循环中的SerpinA1水平较低，肺部无法抵抗中性粒细胞弹性蛋白酶的侵袭。中性粒细胞弹性蛋白酶是一种破坏肺泡并导致肺部疾病的酶。因此，AATD最常见的临床并发症是肺气肿和肝病[10]。

到目前为止，AATD的治疗只有AAT增强疗法。AAT增强疗法开发于1987年，目前仅被批准用于经选择的严重AATD相关肺气肿患者的商业应用[6，11]。AAT增强不仅有助于提供SERPINA1到肺部它可以帮助防止中性粒细胞弹性损伤。由于血清缺乏是不是肝损害的原因有来自与AATD相关的肝脏疾病的患者尚无特效治疗方法。唯一的治疗方法是典型的肝功能衰竭和肝移植患者失代偿期肝硬化的支持治疗[12]。

AATD是单基因疾病，使它成为基因治疗的理想目标。的mRNA是一种新颖的方式是可能适用于广泛的，因为它比传统的生物和酶替代疗法极大的灵活性疾病。基于mRNA的的疗法利用宿主细胞的生产和靶蛋白的翻译后修饰的内源机械，从而允许治疗学的发展为疾病先前未靶向。我们在体外和体内进行的研究，以确定我们是否能够表达外源编码SERPINA1和基因/蛋白靶向合适的器官。

mRNA的疗法可能同时定位肝脏和AAT的肺缺陷患者（待定当前实验）。在治疗患者AAT成纤维细胞的细胞培养基我们的数据证明增加SERPINA1蛋白，以及在患者AAT成纤维细胞来源的原代肝的细胞培养基。此外，在WT动物通过静脉内注射接受SERPINA1的mRNA，既SERPINA1 mRNA和蛋白SERPINA1，观察在肝和肺都进行本地化。总之，我们的数据表明，基因介导SERPINA1蛋白表达在肺癌能抑制中性粒细胞弹性，虽然它可以促进肝脏MM亚型的表达和AAT患者提供有益的多种途径。

2。材料和方法

2.1。AATD患者成纤维细胞

细胞培养条件。GM11423和GM12445从AATD患者肝和GM02522从AATD患者的皮肤和皮肤正常对照成纤维细胞系ND34769：从所述的Coriell医学研究所，细胞库（卡姆登，NJ）得到下面的患者的成纤维细胞。细胞在Eagle氏最低必需培养基中生长含Earle氏盐，并在5％CO补充有15％胎牛血清，并温育在37℃下非必需氨基酸（赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆）₂。

转染条件。分别转染2.5ug和4个mRNAμ的升的mRNA-在脂质转染试剂（MTI-GlobalStem，盖瑟斯堡，马里兰州），在与每实验3次生物学重复3个独立实验。各mRNA稀释至2.5μg在OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc.，威豪，MA)中稀释，同样适当体积的mRNA-In在OptiMEM中稀释，并按照制造商的建议执行方案。将稀释的mRNA与稀释的脂质混合，室温孵育15分钟后加入细胞。在患者成纤维细胞中加入mrna -脂质混合物后，细胞返回到37℃，含5% CO₂。24小时后细胞轻轻地用PBS洗涤两次并在新鲜的RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO）用1X蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO）裂解。

细胞裂解和总蛋白质定量：成纤维细胞的细胞裂解物的患者收集在0.5毫升的管仪（Eppendorf，汉堡，德国），并在18000×g离心在4℃下以除去细胞碎片。离心后，澄清上清液小心转移到单独的标记的管中并置于冰上。总蛋白质浓度用BCA测定试剂盒（赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，MA）一式两份在96-孔格式根据制造商的方案来确定。

SERPINA1表达的Wes自动毛细管电泳检测。最后的5个样本值μ升每0.4毫克/毫升的蛋白质浓度，制备下列蛋白简单韦斯制造商的说明。使用基于尺寸的蛋白质简单韦斯毛细管电泳系统（; ProteinSimple，圣何塞，加利福尼亚州ProteinSimple WES）裂解物分析。125稀释液（Novus公司NBP1-90309，Novus公司生物制剂，利特尔顿，CO），并在1管家硫氧还蛋白：将尺寸分离的蛋白质以1特异性抗体探测SERPINA1 1000（CST 2429，细胞信号传导技术公司，丹弗斯，MA), visualized using labelled rabbit secondary antibodies and quantitated using the manufacturers’ software. For each lane, the area under the curve (AUC) of the SERPINA1 was normalized to the AUC of the Thioredoxin control.

2.2。α-1抗肝亏

细胞培养条件。AATD患者源性肝细胞由英国剑桥大学的DefiniGen公司通过一种专有的分化方案从AATD成纤维细胞中生成。细胞在DTM培养基和DRM培养基(DefiniGen, Cambridge UK)中生长，并在24孔板中以每孔50万细胞的速度沉积。细胞生长在37℃，5% CO的低氧条件下₂和5％氧气₂与媒体被转染之前基于专有厂商的方案（DefiniGen，英国剑桥）每两天更换10天。细胞在根据制造商的说明，这使细胞生长，而nonhypoxic条件减少细胞生长在低氧条件下生长。

转染条件和ELISA蛋白表达。AATD肝细胞用每2.5ug的mRNALipofectamine®2000（赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，MA）的转染4UL，在3个独立实验，每实验3次生物学重复。然后将细胞温育24小时，48小时和72小时的细胞培养基除去，并测定使用从Abcam公司的ELISA（剑桥，MA）并按照制造商的方案SERPINA1蛋白质浓度之前。

2.3。在活的有机体内学习

所有实验动物房，处理和实验程序/协议获得批准，并按照亚力兄制药公司IACUC准则和条例进行。C57BL / 6雄性小鼠（6周龄）中使用了这项研究。小鼠保持在具有12小时/ 12小时光照 - 黑暗循环的温度控制的环境中，与标准饮食和水随意。

将mRNA合成脂质纳米颗粒并在体内给药。mRNA的构建体使用含有SERPINA1 mRNA中的自组装离子化的脂质纳米颗粒（LNP）制剂。编码mRNA甲GFP用作的mRNA加载的车辆的控制和PBS用作在该实验的阴性对照。的LNPs通过在乙酸盐缓冲液的mRNA的快速混合在与脂质组合，Hepato9 mRNA的试剂盒（精密纳米技术）pH为4.0制备，悬浮在乙醇中的脂质对药物比率的〜11（重量/重量）。动物用通过尾静脉在1.5毫克/千克配制mRNA的单次静脉内剂量的注射。动物注射24小时后处死，组织固定和原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）处理以。

样品采集和FFPE样品制备。动物进行尸体剖检，并且左外叶置于平在组织盒（Fisher Scientific公司）。然后盒放入充有10％中性缓冲福尔马林，NBF（Sigma公司）在最小1:20比率组织体积与固定溶液的固定溶液的容器。让样品固定最少24小时，但不超过在室温下48小时以上。组织固定之后，将暗盒放入填充有PBS为不超过3天的容器。PBS洗涤后，肝组织的处理，并嵌入到石蜡块。

2.4。免疫组化和原位杂交程序

5 .免疫组化在福尔马林固定石蜡包埋的培养基上进行μ使用抗体来SERPINA1（：100阿特拉斯，HPA001292在1）米的组织切片。免疫染色，根据与相应的阳性对照的标准协议在Leica BOND RX平台（徕卡生物系统公司，莱卡微系统公司，Buffalo Grove的，IL）上进行。抗原修复，徕卡BOND RX平台上的标准，所用的徕卡ER1，EDTA-TRIS，pH 8.0的溶液。载玻片在梯度乙醇系列，在二甲苯中清洁脱水，并用Cytoseal安装。载玻片使用VS120系统放大40倍（奥林巴斯）成像。

为了显示mRNA，我们进行了原位杂交(ISH)。设计了自定义RNA原位杂交探针(Affymetrix, Santa Clara, CA)检测SERPINA1 mRNA。使用ViewRNA eZ-L检测试剂盒(Affymetrix, Santa Clara, CA)进行自动RNA ISH检测，使用Leica BOND RX平台(Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc.， Buffalo Grove, IL)。在5微米厚的玻片上制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织，并置于Leica BOND RX上。根据生产的ViewRNA eZ-L试验运行协议,但简单地说,揭露了RNA在95°C债券10分钟孵化抗原决定基检索解决方案1(徕卡生物系统,布法罗格罗夫,IL),其次是20分钟孵化的蛋白酶K债券酶预处理装备1:1000稀释(徕卡生物系统,布法罗格罗夫,IL)。杂交采用SERPINA1 1:40探针稀释后快速检测。为了确保RNA的完整性和检测程序，额外的切片还与肽基丙酰异构酶B (PPIB)探针杂交，这是一种内源性管家蛋白，用于ISH的阳性对照。为了控制非特异性染色，抗细菌蛋白二氢吡啶二羧酸还原酶（dapB的）对照探针被用作阴性对照。所有探头都在1:40稀释。将载玻片风干，在二甲苯中清除，并且使用Cytoseal安装。载玻片使用VS120系统放大40倍（奥林巴斯）成像。

3.结果

3.1。mrna来源的人SerpinA1在患者成纤维细胞和成纤维细胞来源的原代肝细胞的细胞裂解物和细胞培养基中的表达

从TriLink是人类SERPINA1基因转染到AATD患者的成纤维细胞，从卡瑞尔研究所获得的。在细胞裂解物中观察到人类SERPINA1蛋白表达显著增加（图图1（a））和细胞培养基（图图1（b）)，转染野生型(WT)或带标记的SerpinA1。

（一个）

（b）中

人类SERPINA1的mRNA转染，可以在从DefiniGen获得的患者的成纤维细胞来源的原代肝细胞中进行。WT SERPINA1蛋白到培养基中的分泌在24h增加相比，车辆仅GFP mRNA的控制。我们观察到在SERPINA1蛋白质表达随时间持续增加如在转染后48h和72h图可见（2)。

3.2。在野生型小鼠体内人SERPINA1表达

随后在WT C57bl/6小鼠中评估人SerpinA1蛋白的表达。肝脏中观察到人SERPINA1 mRNA(图)图3（a））作为可以考虑到的mRNA被包封在脂质纳米颗粒通常提供大量其货物至肝脏可以预期的。一个有趣的发现是，SERPINA1的mRNA也被在小鼠的肺中检测到（图图3（b）)。使用人特异性SerpinA1抗体检测SerpinA1蛋白表达。两个肝脏均可见SerpinA1蛋白(图)图3（c）)和肺(图3 (d))。在肝脏SERPINA1蛋白表达的正弦分布模式表明，SERPINA1蛋白可能是被分泌到血液中由肝细胞。

（一个）

（b）中

（C）

（d）

4.讨论

AATD是需要有效的疗法使患者受益毁灭性的疾病。当前增强治疗是不充分的，以避免对患者AATD的肝脏的长期损害。目前，许多团体都在寻求新的方式来提供急需的疗法，如基因疗法。例如，源自骨髓的干细胞移植已在AATD小鼠中测试并表明肝细胞退化的一些救援[13]。基因替换策略也正在临床试验[14，15]，其中，WT SERPINA1基因被插入到肝脏并表示适当SERPINA1蛋白。仍然需要现有的方法进行优化和AAV介导的基因递送可引起蛋白分泌抗体介导的降低或病毒衣壳的免疫反应。

我们评估SERPINA1 mRNA的瞬时表达在小鼠肝脏中的效果的mRNA递送到肝脏是相对简单的，并且经由脂质纳米颗粒（LNP）成立，并且我们可以管理LNP包封的mRNA不显著免疫反应。最初，我们测试了我们在AATD患者的成纤维细胞和患者成纤维细胞衍生原代肝细胞的假说。我们的数据清楚地表明，我们可以编码SERPINA1与mRNA和随后从两种类型的细胞表达蛋白SERPINA1。我们还表明，SERPINA1蛋白从这些细胞和蛋白水平分泌可在上清液/细胞培养基进行测定。这意味着，与mRNA编码的蛋白质SERPINA1被折叠并在细胞内适当地修改，以使分泌出来的ER并进入细胞培养基这是该mRNA疗法的一个重要特征。利用基因疗法，我们可以利用人体自身的细胞作为工厂合成蛋白质，翻译后修改它，最后它分泌到血液中。细胞培养基的初步分析表明，分泌SERPINA1处于中性白细胞弹性蛋白酶抑制测定酶促活性（数据未显示）。我们在图数据1，2,3建议SERPINA1蛋白的水平比基线或阴性对照水平显著较高。这些水平应足以降低嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性在血浆和肺部，从而防止肺泡降解和肺气肿，这是AATD的特性。

我们扩展我们的研究，以确定是否基因编码SERPINA1可以在体内表达。我们的研究表明，静脉注射人类SERPINA1表达达到野生型小鼠的肝和肺（图两图3（a）和图3（b）)。因此，脂质包封的mRNA疗法可能潜在目标AATD的两个位点（肝和肺）。更重要的是，人类SERPINA1蛋白在肝脏和WT小鼠的肺（图都制作图3（c）和3 (d))。在肝血窦的SERPINA1蛋白表达模式表明，蛋白由肝细胞或肝另一细胞类型分泌如星状细胞正常表达SERPINA1。我们的数据不能排除该基因进入或通过其他肝细胞的肝外表现的可能性，而这将需要进一步的工作。这可能是在肺部人类SERPINA1蛋白可以从两个来源是未来：在SERPINA1基因是通过静脉注射达到肺注射，以及由人类SERPINA1 mRNA的肝脏产生的分泌的人SERPINA1。在任一情况下，SERPINA1蛋白表达和定位在肺和肝脏中的潜力是有前途，因为它可以阻止在肺嗜中性粒细胞弹性蛋白酶介导的损伤，而在肝中可能会降低PiZZ组形式。后者的假设是基于Karadagi等人的研究。[9]其中，由增强治疗的增加SERPINA1蛋白证明在AATD患者PBMC的PiZZ组形式的降低。这引起了该mRNA编码的蛋白质SERPINA1，在肝脏中表达时，能降低肝脏生产PiZZ组的形式，并且进而抑制肝纤维化的可能性。肝纤维化和内质网应激的抑制可以最终降低/消除AATD患者进行肝脏移植的需要。我们的假设需要在体内演示肝纤维化和进展至肝癌的AATD的模型进行测试。

虽然这些数据令人兴奋，但我们想指出，mRNA疗法需要改进，才能为AATD患者提供潜在的慢性益处。目前外源传递的mRNA的半衰期在组织中通常为24-48h，而蛋白质的半衰期取决于蛋白质及其降解机制。增加mRNA半衰期的策略目前正在研究中，早期数据表明，我们可以通过调节密码子优化的mRNA侧翼的UTRs来增加mRNA的稳定时间[16]。合理的蛋白质工程策略也以促进蛋白质半衰期的增加为目标，这将导致酶活性的增加，并最终减少mRNA治疗的剂量需求[17]。这些新的改进可能导致mRNA治疗的减少，并保持足够的酶活性，如SerpinA1蛋白，以提供临床改善。另一个可以改善mRNA治疗的方面是LNP传输的安全性，我们可以每隔几周给LNP剂量。目前的LNP技术有利于一个月一次的给药方案，但不支持更频繁的给药，如果我们配对剂量与疗效。如前所述，lnp封装的mRNA治疗可以增加剂量，而不像某些aav -基因治疗，并且剂量可以通过滴定来为患者提供最大的益处。

5.结论

我们的研究提出了一种新的治疗形式，mRNA的治疗，由此缺失或无功能的蛋白质可被替换以进行正常的功能的潜力。我们的研究结果表明，脂质封装的mRNA可以有针对性地对肺和肝这是在AATD疾病的两个主要站点。虽然以前的研究探索的mRNA治疗AATD已经显示在A549和HEK293细胞[在24h蛋白表达18]，我们的研究证明在AATD患者的成纤维细胞和患者来源的肝细胞其对于疾病相关的细胞系SERPINA1蛋白质表达。另外，我们通过证明脂质封装的mRNA可以提供鼠标肝，肺和农产品SERPINA1蛋白对患者功能相关的在这一领域的延伸了先前的研究。进一步的研究需要以AATD的疾病模型来进行，以确保在啮齿动物和高等动物基因的多次给药的安全考虑这种方式供人类使用之前。总之，我们的研究提出了有趣的可能性，即利用SERPINA1基因mRNA的疗法可能是AATD患者有益。

数据可用性

发布本文中的所有数据支持的结果在文章中提出的。有没有其他可用数据。

利益冲突

所有作者都是员工和亚力兄制药公司，，开发治疗罕见和ultrarare疾病公司股东。

作者的贡献

布伦丹Connolly的设计和进行细胞培养，转染，和体内样品处理。克莱奥艾萨克斯设计，并进行了IHC。垒成设计并进行了实验ISH，稿件写作，和体内研究。Kirtika H.阿斯雷尼进行western印迹，免疫测定，以及在体内的样品处理。罗梅什R.萨勃拉曼尼亚设计的试验，审查资料，并撰写稿件

致谢

Alexion Pharmaceuticals, Inc.被认可为资金。

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