文摘

诺瓦克病毒(11月)是一个全球各年龄段急性胃肠炎的主要原因。11月候选疫苗目前正在临床试验是基于非传染性的高免疫原性病毒样颗粒(一种)交付肌内(IM)。自11月是一种肠道病原体,很可能粘膜免疫有重要作用防止肠道感染。因为我11月交付一种不产生粘膜免疫,我们调查是否11月基因型GII.4种coadministered与氢氧化铝(Al (OH)₃)或monophosphoryl脂质(MPLA)诱导粘膜抗体在老鼠身上。系统性以及粘膜免疫球蛋白和抗体IgA在血清和肠道和鼻分泌物进行了测量。正如预期的那样,强烈的血清免疫球蛋白、IgG1 IgG2a抗体以及剂量的影响诱导由Al (OH)₃和MPLA,但未发现粘膜IgA抗体。相比之下,在免疫GII.4一种无佐剂诱导系统性以及粘膜IgA抗体反应。这些结果表明,粘膜交付11月需要一种诱导粘膜反应。

1。介绍

需要诺瓦克病毒(11月)疫苗是明显的,作为11月是最常见的引起的急性病毒性肠胃炎全世界大约200000年度死亡(1]。所有年龄段的感染人类,但孩子< 5岁、老年人和免疫功能不全的个人最高的风险。11月最先进的疫苗在二期临床试验是基于病毒样颗粒(一种)管理肌内(IM)和氢氧化铝(Al (OH)₃)[2]或Al (OH)的组合₃和monophosphoryl脂质(MPLA) [3- - - - - -6]。替代鼻内(在)11月管理一种曾被评价为好(7,8]。尽管缺乏保护11月的明确的疫苗相关关联,粘膜免疫是扮演着一个重要的角色在防止感染和疾病引起的肠道病原体,包括11月(9- - - - - -12]。

目前,只有少数人类使用佐剂批准,也没有粘膜交付(13,14]。铝盐(明矾)和MPLA佐剂通常包括在制定的授权蛋白亚单位疫苗,如VLP-based人类乳头状瘤病毒疫苗(Cervarix®,“加德西”®)和乙型肝炎病毒(Engerix-B®, Recombivax HB®)。明矾,第一和主要辅助人类疫苗,也用来稳定疫苗抗原和交付系统(13,15]。MPLA,新一代toll样受体(TLR)为基础的辅助,TLR4受体激动剂,激活先天免疫(16,17),从而影响适应性免疫的发展。最近,明矾也被认为具有免疫调节功能(18]。这两种佐剂刺激系统性免疫反应,当管理非肠道与疫苗抗原。然而,他们对抗原粘膜免疫的影响尚不清楚。

GII.4 11月我们最近发现,一种导致粘膜保护IgA抗体洗胃的老鼠通过鼻内接种(在),但不是我,路线(9]。如果我在这里,我们调查的11月GII.4制定一种常用的佐剂,Al (OH)₃或者MPLA,影响一代NoV-specific粘膜免疫。

2。材料和方法

2.1。生产重组11月车牌区域

11月gii.4 - 1999(参考菌株加入AF080551)一种用于免疫和重组杆状病毒产生的抗原在免疫分析技术在Sf9昆虫细胞和净化,详细描述了其他地方19]。

2.2。免疫和样品制备

女性7-week-old BALB / c小鼠OlaHsd(5 - 8老鼠/实验组)(Envigo,霍斯特,荷兰)免疫IM两次(在研究周0和3)0.3μ克剂量的GII.4种单独或与100年制定μg (Al (OH)₃(Alhydrogel;圣地亚哥InvivoGen CA)或5μg MPLA的美国明尼苏达州R595(InvivoGen)。此外,两组老鼠收到联合疫苗(20.包含10个)μg GII.4一种通过IM和交付。小鼠接种IM或在载体(仅无菌PBS)作为对照组。免疫接种进行麻醉诱导与氯胺酮的混合物(Ketalar®;辉瑞制药有限公司,纽约)和medetomidine (Dorbene®;Syva、里昂、西班牙)。

检测血清中的抗体反应的动力学,尾巴血液样本(PBS稀释1:200年的时候收集)收集研究周0(多发地血清群)和3。老鼠被斩首牺牲在研究周5,全血时,肠道分泌物(粪便),鼻洗(NWs)和肠系膜淋巴结(mln)收集。血液样本的制备和淋巴组织是根据以前公布的程序进行(21),除了一个单细胞暂停group-wise汇集mln制备血红细胞的裂解一步。粪球和NWs加工之前发表(9,22]。所有的实验过程进行了按照规定和指导方针的芬兰国家实验板。

2.3。NoV-Specific血清和粘膜抗体的ELISA检测

血清样本个体的老鼠连续稀释双重从1:200(免疫球蛋白)或1:20 (IgA)和ELISA检测存在的11月GII.4-specific免疫球蛋白,IgG1 IgG2a, IgA抗体所描述的其他地方(10,21]。粪便悬浮液(10%)和NWs双重连续稀释从1:5和研究了免疫球蛋白和IgA抗体。短暂,96 -一半区域聚苯乙烯板(纽约康宁公司康宁)涂上50 ng GII.4每口井的一种。样品稀释被添加在盘子,结合抗体检测辣根过氧化物酶,(合)共轭anti-mouse免疫球蛋白(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)IgG1(表达载体,卡尔斯巴德,CA) IgG2a(英杰公司)或IgA (Sigma-Aldrich)和SIGMAFAST门诊部当衬底(Sigma-Aldrich)。光密度值(OD)在490 nm衡量标(维克多²1420;PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。如果OD样本被认为是积极的_490年超过截止值(OD意味着什么_490年+ 3×SD的老鼠和OD的控制_490年> 0.1)。端点的效价被定义为最高的倒数与OD稀释_490年截止值。与OD对负样本_490年以下截止极限,半稀释开始被分配的效价。

2.4。检测由MLN NoV-Specific抗体分泌细胞

Group-wise汇集MLN细胞(4×10⁶从小鼠免疫刺激细胞/毫升)在体外(23,24]5μ克/毫升GII.4种或培养基(RPMI 1640补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ50 g / ml链霉素,μM 2-mercaptoethanol,谷酰胺约2毫米;所有从Sigma-Aldrich)。在37°C了10天,孵化后上层清液被收集并存储在−20°C到分析anti-GII ELISA。4免疫球蛋白和抗体IgA如上所述。

2.5。统计分析

确切概率法来评估免疫球蛋白和IgA端点浓度组间差异。的Mann-WhitneyU测试和克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用来比较两个或两个以上的独立的非参数观测之间的差别组。所有分析都是由IBM SPSS统计为Windows版本23.0 (、IBM公司,纽约Armonk)。定义为统计上的显著差异 。

3所示。结果

3.1。11月GII.4-Specific诱导血清免疫球蛋白和IgA抗体

效应的两个常用的佐剂11月GII.4-specific血清免疫球蛋白和IgA免疫抗体反应研究的实验老鼠IM 0.3或10的两倍μ克GII.4种单独或0.3μg剂量结合Al (OH)₃或MPLA。相比之下,一群老鼠获得10项提名μg GII.4一种通过交货。IM免疫为0.3μ克GII.4种不引起显著的血清免疫球蛋白反应(几何平均效价,格林尼治时间= 119;95% CI = 74 - 192),而共同服用0.3的μg一种与Al (OH)₃或MPLA导致健壮(格林尼治时间> 5 log10) 11月GII.4-specific免疫球蛋白水平(数字1(一)和1 (b))。另外,即时通讯和管理10μ克剂量的一种诱导高水平的anti-GII。4免疫球蛋白抗体(数字1(一)和1 (b))。无显著差异( )中观察到的大小反应引起的0.3μ克剂量的一种与佐剂和10μ克剂量的一种通过IM或路线。

肠外无佐剂没有引起一种检测血清anti-NoV IgA抗体,但非常低血清IgA是观察小鼠免疫接种后1/5 0.3μg剂量与Al (OH)制定₃(格林尼治时间= 13;95% CI = 6-27)或MPLA(格林尼治时间= 11;95% CI = 8)(数据1 (c)和1 (d))。相反,在管理GII.4一种单独生成一个显著提高( )IgA响应(格林尼治时间= 119;95% CI = 73 - 194)与即时通讯管理佐剂的车牌区域配方(数字1 (c)和1 (d))。未发现GII.4-specific或IgA免疫球蛋白抗体的血清控制老鼠(数字1(一)- - - - - -1 (d))。

3.2。动力学和Th1 / Th2 Al (OH)引起的二分法₃和MPLA

研究Al (OH)的影响₃和MPLA GII.4-specific 11月血清抗体反应动力学,1:200稀释血清免疫小鼠肠剂治疗计划在三周的时间间隔检测的抗体免疫球蛋白。第一次免疫后,0.3μ克剂量的GII.4种制定与Al (OH)₃或MPLA以及10μ克剂量的一种单独导致免疫球蛋白反应( )(图2(一个))。这些抗原剂量的配方在第二周3增强已经建立了强大的反应实验组( ),观察到星期5(图2(一个))。控制老鼠仍负面GII.4-specific免疫球蛋白(OD_490年< 0.1)在研究期间(图2(一个))。

免疫球蛋白亚型测定浓度显示生成的两个IgG1 (th2型响应)的标志(图2 (b))和IgG2a (Th1型响应)的标志(图2 (c)通过配方加入佐剂GII.4车牌区域)的抗体。无统计差异被发现IgG1浓度( )由0.3μ的一种g Al (OH)的存在₃MPLA或10μ克的一种(图2 (b))。相比之下,IgG2a浓度实验团体(图之间的不同2 (c)),Al (OH)₃佐剂组有显著降低浓度比其他组( )。端点效价IgG1 / IgG2a (Th1 / Th2)比率为2:1小鼠免疫结合一种和MPLA 10: 1种和Al (OH)₃。没有GII.4-specific免疫球蛋白亚型的血清抗体检测控制老鼠(数字2 (b)和2 (c))。

3.3。11月GII.4-Specific抗体诱导粘膜分泌物

为了研究如果11月种coadministered与Al (OH)₃粪便或MPLA诱导抗体在粘膜表面,10%悬浮液和NW样本的实验动物检测anti-GII的存在。4免疫球蛋白和IgA抗体。正如所料,小鼠免疫IM为0.3μ克剂量的GII.4单独一种没有出现肠道免疫球蛋白抗体(图3(一个))。相反,所有其他实验群体有类似水平的免疫球蛋白( 肠(图)3(一个))。

IM提供一种佐剂的缺席没有产生肠IgA抗体(格林尼治时间= 2.5),但粪便IgA反应是在1/5和2/5发现老鼠后共同为0.3μg剂量与Al (OH)₃(格林尼治时间= 3;95% CI = 2 - 7日)或MPLA(格林尼治时间= 5;95% CI =男童)(图3 (b)(图),确凿的血清IgA响应1 (d))。大大增强肠道的IgA水平( )是由粘膜引起的交付10μ一种g(格林尼治时间= 25;95% CI = 12-53)(图3 (b))。

鼻灌洗与肠抗体实验小组还测试了GII.4-specific和IgA免疫球蛋白抗体的存在。类似于粪便标本,可比免疫球蛋白水平( 0.3)引起的μ的一种g Al (OH)的存在₃(格林尼治时间= 6;95% CI =男童)或MPLA(格林尼治时间= 6;通过IM交付95% CI = 4 - 8),或10μg(一种仅通过IM(格林尼治时间= 7;95% CI = 3-16)或交货(格林尼治时间= 12;95% CI = 4-33)(图4(一))。相比之下,只有在政府的一种导致代IgA抗体(格林尼治时间= 30;95% CI = 9 -鼻腔分泌物(图102)4 (b))。

3.4。Al (OH)₃或MPLA诱导生产MLN IgA抗体的细胞

为了证实缺乏粘膜IgA抗体诱导两种佐剂的粘膜分泌物(数字3和4),MLN细胞Al (OH)₃和MPLA免疫小鼠进行免疫球蛋白和抗体IgA的生产测试。细胞从老鼠接受一种Al (OH)的存在₃或通过IM MPLA交付大量免疫球蛋白生产在体外刺激与GII.4种(数字5(一个)和5 (b))。相反,不添加佐剂的配方也能引发IgA生产MLN细胞(数字5(一个)和5 (b)),这表明mln没有归纳的IgA在肠道分泌物后我发现免疫反应。没有anti-GII。4IgG or IgA production was detected when MLN cells were stimulated with the culture medium only (data not shown).

4所示。讨论

抵御病原体在粘膜表面在很大程度上是依赖于分泌IgA有效地诱导免疫(25,26]。因为11月传播通过肠道粘膜,粘膜免疫诱导11月可能是一个关键因素是考虑11月疫苗的发展。虽然肠外免疫路线不通常被认为是有效的粘膜免疫诱导物9,10,27- - - - - -29日],我们调查如果粘膜抗体引起的肠免疫BALB / c小鼠11月GII.4和广泛使用的一种制定系统性佐剂Al (OH)₃黄金标准交付系统,或MPLA TLR4受体激动剂。它最近被证明TLR配体(TLR3 / TLR4)改变树突细胞的迁徙模式在活的有机体内,促进粘膜反应诱导codelivered抗原由于antigen-loaded树突细胞迁移到排水和nondraining淋巴结(30.]。因此,我们还调查了如果我11月车牌区域的免疫抗原与这些佐剂codelivered导致淋巴细胞传播像MLN远程站点。

当前候选疫苗在11月车牌区域的最先进的阶段临床试验管理IM MPLA的配方和/或Al (OH)₃,有效地诱导高系统性抗体反应(3- - - - - -6]。后的挑战,保护被认为对中度到重度的形式的急性胃肠炎,没有显著减少脱落[11月6]。粘膜反应,即antibody-secreting细胞(对asc)和粘膜自导表型,源自召回粘膜反应之前曝光所吸引,11月可能负责观察保护(31日]。在无菌的小腿,粪便IgA-mediated免受致命的牛11月的挑战是证明只有在粘膜的免疫接种牛种[11月32]。其他报告也显示粘膜免疫的重要性,尤其是IgA,保护从11月感染9,11,12]。同样,非肠道交付血清灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)产生保护性抗体但不是本地肠道内肠粘膜抗体,因此足以预防疾病但不足以阻止野生脊髓灰质炎病毒在肠道内复制和传播环境(33,34]。

在这项研究中,高水平的血清免疫球蛋白抗体被两种佐剂诱导。Al (OH)₃,MPLA提升> 30倍剂量爱惜nonadjuvanted剂量(0.3以上μg和10μg剂量,resp)和诱导IgG1水平相当,Th2反应的标记,以及IgG2a Th1反应的一个标志。尽管MPLA促进Th1偏见(17,35),我们的数据显示感应平衡的Th1 / th2型响应佐剂。相比之下,Al (OH)₃刺激Th2-biased响应,一致以前的观测(13,36,37]。有偏见的反应取决于几个因素,如交付的路线,动物病毒,和使用的疫苗抗原,从而解释明显差异的结果。尽管不同的机制两种佐剂的使用在目前的研究中,一个主要交付或仓库系统,另一个一个immunostimulator [13),我们的数据表明,Al (OH)₃11月和MPLA工作同样IM交付一种剂量爱惜,动力学和系统性免疫球蛋白抗体的生成。

我们最近的研究表明,IgA水平粘膜组织与阻塞活动,建议IgA,但不是免疫球蛋白,是主要的抗体中和11月在粘膜表面9]。一致(9),目前的结果表明,粘膜IgA抗体引起的,但不是我,11月管理一种佐剂。只检测到低水平的粪便IgA在几个老鼠免疫IM与11月GII.4佐剂的一种,要么。因为同样的IgA水平低在这些动物血清,检测到的抗体可能是系统性IgA被动地流露出血清粘膜分泌物。为了确保没有11月GII.4-specific粘膜分泌IgA反应是错过了,我们还测试了NWs和阴道冲洗(数据未显示)IgA抗体的存在。只有在交付GII.4 11月一种诱导IgA抗体在这些分泌物。此外,在支持血清IgA的起源,未发现对asc IgA MLN细胞的小鼠免疫与疫苗11月车牌区域制定与Al (OH)₃或MPLA佐剂。同样,Bessa和他的同事们检测到免疫球蛋白,但不是IgA,对asc在MLN皮下免疫疫苗的老鼠平台基于一种(38]。

我们的研究结果清楚地表明缺乏粘膜IgA抗体生成在天真的动物我11月交付一种无论佐剂Al (OH)₃或MPLA使用。其他人已经表明,肠外交付(IM和皮内)用粘膜佐剂的疫苗抗原dmLT(一种解毒heat-labile肠毒素大肠杆菌)促进粘膜免疫24),可能通过诱导粘膜归航B细胞受体及其迁移到粘膜隔间(39),但确切的机制并不完全清楚。因此,11月疫苗领域的发展应该考虑粘膜疫苗(交付11月车牌区域40),或者至少包含的粘膜佐剂或组件针对粘膜走私、免疫天真的人,如婴幼儿,以确保诱导肠道粘膜反应,肠病毒像11月港的条目。

5。结论

目前的研究表明IM管理11月GII.4种制定与Al (OH)₃或MPLA并不产生显著的粘膜IgA抗体在老鼠身上。相反,在免疫GII.4单独一种引起NoV-specific粘膜免疫。这些结果强调粘膜送货路线的重要性诱导有效的粘膜反应。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认的技术援助疫苗研究中心的实验室人员。特别感谢博士是由于Kirsi Tamminen, Eeva Jokela,桑娜Kaven,和玛丽安Karlsberg。