文摘
一个新颖的方法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在低浓度,使用ultrahigh-order引导模式作为探针兴奋对称金属包层的波导,提出。方法使用的吸收峰的最小值与样品的浓度成正比,发现实现检测乙型肝炎病毒的浓度极低。它是意识到低浓度的表面测量依赖于吸收峰的最小值原理和浓度有良好的线性关系。测量结果表明,这种新方法可以精确检测表面抗原的浓度较低的地区临床灰色区域(即。,below 20 ng/mL), the lower region of the current clinical gray area of HBsAg (below 20 ng/ml) can be measured, and the resolution can be reached (2 ng/mL).
1。介绍
众所周知,乙型肝炎病毒(HBV)的感染会引起急性和慢性乙型肝炎,甚至可以导致死亡的人被感染(1]。患者乙肝病毒在很长一段时间内可能发展为肝纤维化、肝硬化,肝癌,和一系列的门静脉高压综合症和肝性脑病等并发症,严重威胁到他们的生命(2]。据不完全统计,全世界大约有二十亿人在他们的生活中感染乙型肝炎病毒(3,4),约12%的他们开发了慢性乙型肝炎病毒感染。大约有650000人失去了生命,因为肝功能衰竭,乙型肝炎病毒感染引起的肝硬化,肝癌(5- - - - - -7]。的速率引起的肝硬化和肝细胞癌(HCC)乙型肝炎病毒感染是30%和45%,分别为(8),因此,它是非常重要的开发方法,能够精确地检测乙肝病毒在人类血液的浓度,对临床医学和我们的社会。
定性检测HBsAg的主要依据是乙肝患者在诊所。HBsAg的常见检测方法包括胶体金免疫层析法测定(GICA) [9),酶联免疫吸附试验(ELISA),化学发光法(CLIA) [10),电化学发光免疫测定(ECLIA) [11]。有四个主要检测方法的优缺点。目前,最广泛使用的技术是ELISA世界上因其灵敏度高。它非常简单,低成本,GICA和敏感。CLIA可用于检测低浓度或microconcentration样本的反应,但检测是有限的。ECLIA免疫测定技术是一个新的标签等后,酶免疫分析法、化学发光免疫分析法。垄断检测条件,检测设备昂贵,临床可访问性很差。
提高分辨率的检测、光学检测技术、表面等离子体共振(SPR)技术,提出了一些研究人员检测液体样品中包含的物质的浓度。SPR技术使用共振吸收峰探针兴奋在接口的金属和非金属激光之间的交互和自由电子在金属和高敏感性检测。SPR技术还具有以下突出优点:不需要庞大的设备,实时检测、label-free测量,和小样本数量要求(12]。由于实时检测的突出优点和小样本数量要求,SPR技术已广泛应用于生物分子之间的相互作用的研究,结合动力学之间的抗体和抗原(13]。Biacore是最典型的商业使用了SPR技术的仪器。
在我们的初步研究中,我们发现,尽管SPR技术已经广泛应用,其工作原理有一些问题或担忧。首先,表面等离子体波只能在金属和介质之间的界面传播,然后半宽度(应用)的衰减全反射吸收峰很大,因为金属吸收可见光和近红外波长范围的光。其次,由于棱镜耦合系统的耦合角度的表面等离子体波很大,棱镜耦合系统有一个很大的有效折射率。这两个问题严重限制了进一步提高检测灵敏度的SPR传感器。此外,自从SPR技术使用隐失场作为探测器,探测范围内只有几百纳米,这限制了SPR技术的应用只大分子样品的检测。尽管一些新技术,如漏水的光波导(LW) [14),反向对称波导(RSW) [15),和远程表面等离子体波(LSPR) [16),已经开发出来,这些新开发的技术没有突破SPR技术的工作原理和在现有SPR技术一样,在这些新开发的技术,样品仍放置在光场的隐失场是虚弱的。这些问题的考虑在现有的SPR技术的工作原理,提出了一种新的高灵敏度检测技术来检测HBsAg基于对称金属包层的波导技术。
2。工作原理
2.1。检测原理
一个传感器芯片的结构原理图命名对称金属包层的波导(SMCW)如图1。从下到上,传感器芯片由基质玻璃(0.5毫米)厚的金属(金或银)电影(200海里)气急败坏的一方面,垫片玻璃(0.5毫米)的圆孔中心,上玻璃(0.5毫米),金属(金或银)薄膜(30 nm)气急败坏的一侧。
(一)
(b)
(c)
衰减全反射光谱图所示2可以获得的入射角入射电子束扫描从0到90°三层对称金属包层的波导结构。图2显示一个衰减全反射光谱的吸收峰小入射角。
据曹(17),吸收峰的最小衰减全反射的三层结构的铁壳的波导可以写成 在哪里是内在损失由波导材料的吸收和是辐射损失由上层金属膜的厚度决定。
从方程(1),显然,当 ,即。,when the intrinsic loss is equal to the radiation loss, the minimum value of the attenuated total reflection peak is equal to zero. When the sensor chip for the experiments is prepared, the structural parameters of the sensor chip are determined, and then the radiation loss of the sensor chip is also determined. If there is a change in the concentration of the ingredient to be detected in the sample, the intrinsic loss will vary, and then the minimum of the absorption peak of the attenuation total reflection will also change. According to this principle, the detection of sample concentration by measuring the minimum of the absorption peak of the attenuation total reflection may be realized.
2.2。敏感性分析
三层平面光波导的基本结构如图3。
TE模式分布的电场在三层平面光波导可以获得 在哪里 , , , ,和 。
TE引导模式的色散方程可以很容易地来源于[18]边界条件如下:
通过微分方程的两边(3),我们可以
的力量TE模式(从一个来b)获得波导 在哪里真空磁导率。该地区从一个来b可以在衬底或波导芯层: 在哪里光功率耦合到样本吗总输入功率的激光光束。的导数的有效折射率引导模式可以获得 在哪里样品的折射率是发现和谐振模式的有效折射率。
同样,TM模式的有效折射率的导数可以获得 在哪里 。
然后,统一的灵敏度公式年代一个光波导传感器的共振模式可以写成 在哪里相关物理量的偏振激光和传感器的结构,即, TE模式和 对TM模式。
自 和 表面等离子体共振结构,它可以从方程(9), 。然而,对于一个传感器基于三层对称金属包层的波导结构,分析物位于该地区以来的振荡场光能量非常高,对入射激光几乎所有耦合到波导,也就是说, 。由于入射角θ空气很小,有效折射率吗 接近为零。根据方程(9),原则上,敏感年代方法到正无穷,因此,这种检测方法的灵敏度基于三层对称金属包层的波导结构是非常高的。
模拟的敏感性SPR传感技术利用棱镜耦合技术,LSPR传感技术使用棱镜耦合技术,和RSW传感技术使用棱镜耦合技术和SMCW传感技术与自由空间耦合技术进行。中使用的参数模拟和这些模拟的结果在表列出四个传感技术1,如图4,分别。仿真结果表明这里传感技术的敏感性提出了使用吸收峰的变化的最小值( )与样品的消光系数和基于三层对称金属包层的波导结构是至少两到三个数量级高于其他三个传统的光学传感技术。
(一)
(b)
(c)
(d)
3所示。样品制备
原始的、国家和量化标准样品的表面(NIBSC代码:00/880)是由世界卫生组织提供的。HBsAg的内容在每个瓶冻干血清16 ng,浓度是160 ng / mL后0.1毫升无菌超纯去离子水添加到每个瓶子。根据样品溶液的稀释因子,共七个标准实验样品与不同浓度除了纯蒸馏水准备。
进一步的样品制备过程如下:(1)增加100μL的七个标准与不同浓度的HBsAg实验样本,分别相同的七井涂有乙肝表面抗体,摇匀,然后将油井的孵化器37°C约1小时。(2)增加50μL biotin-labeled捕获抗体(二次抗体)每个好了,然后把井的孵化器37°C约30分钟。(3)用洗涤剂洗几次,洗掉未装订的捕获抗体,然后添加50μL(辣根peroxidase-labeled链霉亲和素,嗯,摇匀,把井的孵化器37°C 30分钟。(4)洗后,增加100μL反应的底物o-phenylenediamine(门诊部当)每个好,摇匀,然后将油井的孵化器37°C 30分钟。(5)在每个通过添加100年终止反应μL酸,然后六橙红色液体氧化后的颜色的不同深浅门诊部当。指定的各种使用实验样品浓度和相应的标签表中列出2。
4所示。实验测量
4.1。设置
原理图的实验装置用于测量如图5。激光源使用的型号是mw - sl - 532的输出激光的中心波长为532 nm和最大输出的光功率 。这两个小洞(孔1和孔径2),以确保激光准直的线。偏振控制器(偏振器)用于选择激光的TM偏振状态。高,镜子是用来改变光路的方向,以确保激光的入射光传感器芯片的中心位置。传感器芯片是放置在测角仪连接到两个独立旋转部分由步进电机控制,内部和外部,外部的角速度是里面的两倍。
使用的光电探测器(PD)是光电的检测管ALPHALAS inc .)生产的德国(模型没有。UPD-35-UVI),响应波长350 - 1700纳米的范围。在光电的检测管,响应信号由模拟信号放大器放大,然后放大模拟信号转换为数字信号的模拟数字信号转换电路。最终的数字信号输入计算机信号采集模块,获得的数字信号由计算机软件能够进一步处理,然后测量结果将显示在其监控。在实验设置中,标本的注入到传感器芯片实现了电动蠕动与低噪声采样器。
4.2。测量
测量开始时,内部的旋转部分,传感器芯片是手动调整,激光的入射点在中心位置的传感器芯片,和激光的入射角是关于2°。激光的入射角是由计算机程序控制的扫描范围在2°和60°。最窄的半高全宽与最低的ATR吸收峰在电脑屏幕上选择工作的高峰。然后,开始和结束的激光入射角度选择工作峰值被设置为激光的入射角扫描范围的测量,然后激光扫描设置入射角扫描范围内来回多次,以确保这种扫描可以重复。因为向前和向后螺丝之间的差距会引起错误的测量实验数据,激光扫描在同一个方向获取实验数据。
毕竟运动部件的稳定的工作条件,确保样品在慢慢注入到样品室的传感器芯片使用电动蠕动泵。样品的解决方案完全填充后的样品室的传感器芯片,蠕动泵的关闭,样品室的样品的解决方案是让稳定测量开始前的几分钟。计算机软件然后打开控制激光扫描在一个方向上从集合开始结束事件集的角度。吸收峰获得了在每个扫描存储测量数据。获得更可靠的实验数据,在测量,实验装置中的组件保持静止,激光扫描是确保只是在一个方向上。
传感器芯片必须与无菌超纯去离子水冲洗多次之前用来测量下一个样本,直到所有的七个样品测量和测量过程的每个样本的重复上述过程测量样本。
5。结果与讨论
5.1。结果
图6显示的情节吸收峰的最小值( )对HBsAg标准样品的浓度。图的右下角插图6显示所有的测量曲线衰减全反射吸收峰,和插图图左上角6是一个放大视图的底部部分的测量峰值曲线右下方插图所示图吗6。图显示一个很好的线性测量之间的关系和表面抗原的浓度范围的样本浓度测量。也注意到,ATR吸收峰变化的最小值约为0.05,变异20 ng / mL的HBsAg样品的浓度。由于数据采集和计算机显示器的分辨率,解决这种测量方法来区分的最小值( )ATR的峰值不小于0.004。考虑其他噪音的影响在测量过程中,这种光波导检测方法的灵敏度不会低于2 ng / mL。
5.2。讨论
在图所示的阴谋6表明ATR吸收峰的最小值( )不是绝对等于0时HBsAg的浓度为零。对这种现象的原因是和光波导的不是绝对平等自上耦合金属薄膜层的厚度不是绝对等于最优厚度的传感器芯片的制备,但这不会有任何影响测量精度的检测方法。
我们注意到,在图6,衰减全反射吸收峰不同的样本不仅相互转移在垂直方向,但在水平方向上也略有变化。这些水平和垂直变化的衰减全反射吸收峰是由于折射率的实部和虚部的样本,然后是水平和垂直变化的衰减全反射吸收峰完全不相关。因此,水平变化的衰减全反射吸收峰也不会有任何影响了测量参数所提出的检测方法。
我们还注意到,在图6有一些偏差,实验数据的理论预测。我们相信这些理论预测的实验数据的偏差相关的主要是以下三个因素:(1)传感器芯片准备时,存在岛结构上部金属薄膜表面,然后上层金属膜的厚度的均匀性是没有保证的。(2)输出的并行性和半角选择激光模式的激光超过了理论预期。(3)的操作温度传感器芯片激光辐照时增加,导致不一致的温度环境传感器芯片实验测量之前和期间。我们相信这个问题可以解决,如果工作装置的传感器芯片可以放置在一个高精度的孵化器。
6。结论
理论和实验结果表明,这里介绍的最低分辨率传感技术,基于对称金属包层的波导配置,检测表面抗原在低浓度可以达到2 ng / mL,这将是有用的诊断和治疗的乙肝病人。根据检测原理的新方法,该方法可以用来检测定量水平的任何物质,只要物质可以与显色剂,色如乙型肝炎e抗原(e抗原)和c反应蛋白(CRP)。光学检测技术的应用可能对临床检测提供了新的技术路线。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求和资助者的许可。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号。11664043,11664043,11764020),科技江西省登陆教育部的项目(批准号KJLD14089),江西省省级自然科学基金(批准号20192 bab202005和20192 bab201048),和科技项目的教育部江西省(批准号GJJ190862)。