文摘
背景。响应基因补充32 (RGC32),激活诱导的补充,已经被定性为一个细胞周期的监管机构;然而,它在致癌作用仍有争议。在目前的研究中我们比较RGC32启动子甲基化模式和mRNA表达在乳腺癌癌组织和邻近的正常组织。材料和方法。六十三年乳腺癌组织和63年相邻非肿瘤的组织都包含在我们的研究中。设计。嵌套methylation-specific聚合酶链反应(Nested-MSP)和定量PCR (qPCR)被用来确定RGC32启动子甲基化状态及其mRNA表达水平,分别。结果。RGC32甲基化模式不是乳房癌组织和邻近的非肿瘤的组织之间的不同(或= 2.30,95% CI -5.54 = 0.95)。然而,qPCR分析显示更高水平的RGC32信使rna在乳房癌组织比非癌变组织(1.073和0.959;),无论启动子甲基化状态。的表达水平和启动子甲基化RGC32没有与任何病人的临床特点()。结论。我们的研究结果证实upregulation RGC32在乳腺恶性肿瘤,但它不是与启动子甲基化模式。
1。介绍
乳腺癌是全球女性最主要的癌症。乳腺癌和其他恶性肿瘤由于逐步正常宿主细胞的基因改变,可能从表观遗传变化的行为不仅恶性细胞,而且宿主细胞相互作用的肿瘤,如免疫,血管,和基质细胞(1,2]。表观遗传是指从父母的基因组信息传播给下一代的细胞不是由主DNA编码序列。表观遗传机制是必不可少的调节基因表达和基因组完整的正常细胞(3]。近50%的基因导致家族性癌症接受methylation-associated沉默在各种零星的癌症,一旦他们在种系突变(4]。
响应基因32 (RGC32)补充蛋白质,最近叫13开放阅读框15号染色体,细胞周期激活引起的监管机构的补充(5,6]。人类RGC32是发现13号染色体的长臂和映射的间隔13 q12-13q14 [7]。
的RGC32基因产物扮演双重角色在细胞增殖和肿瘤抑制在特定类型的癌症8]。放松管制RGC32表达已经检测到在一个大型多种人类癌症。表达下调在高档前列腺上皮内瘤、侵袭性前列腺癌、多发性骨髓瘤、和耐药胶质母细胞瘤,但调节在其他领域,包括皮肤T细胞淋巴瘤,卵巢癌和乳腺癌8,9]。超表达RGC32导致细胞骨架重组和促进细胞迁移,这可能是一个重要的机制RGC32进展癌症的转移(10]。
表观遗传改变,如DNA甲基化调节基因的表达在哺乳动物的正常发展。然而,启动子甲基化起着主要的作用在癌症通过转录沉默至关重要的生长调节剂,如肿瘤抑制基因(11]。最近,金等人报道,RGC32受到表观遗传沉默在非小细胞肺癌(nsclc)。他们发现RGC32DNA甲基化与低或检测不到相应RGC32信使rna表达水平在恶性和非恶性的肺组织(5]。他们的发现表明RGC32表达的转录失活可能是由于基因的启动子甲基化。
因此,鉴于证明RGC32函数作为一个肿瘤抑制基因在某些类型的癌症,在这项研究中,我们分析了启动子甲基化状态的RGC32并评估其相关基因表达在乳腺癌。
2。材料和方法
2.1。病人
这项研究包括63名乳腺癌石蜡包埋的肿瘤样本和63年邻nontumor组织相同的病人。乳腺癌患者的临床病理的特点总结表1。综述了所有的乳腺癌标本由熟练的病理学家。入选标准是女性原发性乳腺癌患者和石蜡包埋组织的可用性以及病人的临床病理的数据。患者以前用新辅助治疗或辅助治疗以及那些缺失的临床病理的数据,例如,HER2,呃,公关,和节点状态,被排除在外。所有受试者的知情同意了,扎黑丹大学医学科学和伦理委员会批准了我们的研究。DNA提取组织蛋白酶K治疗和使用标准协议的盐析提取协议如前所述[12,13]。DNA的质量和完整性检查在0.8%琼脂糖凝胶电泳,量化spectrophotometrically,并存储在−20°C到进一步使用。
2.2。亚硫酸氢钠的修改和PCR扩增RGC32启动子
亚硫酸氢钠处理DNA样本,把unmethylated C,然而,当甲基化发生在C残留物,他们将承受治疗。亚硫酸氢协议申请修改的DNA是前面描述的11,14主要的修改。简洁,10μL的DNA(约。一个μg),氢氧化钠溶液添加到最后一个0.3米的浓度。孵化后变性的DNA链发生有效的混合50°C,持续15分钟。这种混合与50混合μL 2%的低熔点(LMP)琼脂糖和孵化50°C,持续15分钟。一个15μL下降这个混合物用移液器吸取到300年μL冷矿物油(σ)。DNA琼脂糖/下降迅速硬化在石油和琼脂糖珠形状一旦他们孵化−4°C 30分钟。700年整除μL 5 M的亚硫酸氢试剂(5 M亚硫酸氢钠,默克公司;125毫米对苯二酚,默克公司;pH = 5.0)被添加到每个反应管包含一个珠子。管是轻轻地倒珠子进入水相,在55°C水浴孵化4-18排除光下人力资源。治疗停止平衡对1毫升1 x TE(2×15分钟)其次是desulphonation在500毫升0.2 M氢氧化钠(2×10分钟)。最后,珠子是用1毫升1 x TE (Tris-EDTA)缓冲其次是平衡与1毫升ddH2O(1×15分钟)。珠子被直接用于PCR或保持在−20°C几个星期没有任何质量损失。
启动子区域的甲基化状态RGC32基因是由嵌套methylation-specific聚合酶链反应(Nested-MSP),提高了灵敏度检测hypermethylated发起人50倍以上。使用的引物的第一阶段但不区分甲基化MSP区分bisulfite-modified模板和unmethylated模板。引物用于RGC32Nested-MSP nested-forward (F): GGGTAAATATTTGGGGTTGTAAT nested-reverse (R): TTCAACCCTACCAATCCCTTC;methylated-F: TCGCGGTTTTAGGGCGGGCGC methylated-R: CCGCTCCCAACACGATCCGCG;unmethylated-F: TTGTGGTTTTAGGGTGGGTGT和unmethylated-R CCACTCCCAACACAATCCACA。循环条件的第一阶段Nested-MSP 95°C的10分钟紧随其后30变性的周期为15秒95°C,退火30 s 60°C,在72°C 45 s扩展,最终在72°C扩展了10分钟。PCR产物的第一阶段(282个基点)稀释1:50并受第二阶段的Nested-MSP使用两对引物,一个特定的甲基化等位基因和另一个特定的unmethylated由金et al。(如前所述5]。PCR条件的第二阶段Nested-MSP完全变性DNA在95°C 10分钟和35周期涉及变性为15秒95°C,退火30年代在63°C, 45 s在72°C扩展,最终在72°C扩展了10分钟。PCR验证在2%琼脂糖凝胶含有0.5的产品μg / mL溴化乙锭,一张照片显示不同的甲基化模式(图1)。甲基化和unmethylated等位基因的扩增子大小为194个基点。检查我们的实验的准确性,我们重复的DNA甲基化测量随机样本的10%。甲基化的结果是100%和第一个结果一致。
2.3。RNA隔离、准备和实时PCR
总RNA与福尔马林固定石蜡包埋组织样本使用RNeasy®FFPE装备根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成应用RevertAid执行™第一个链cDNA合成装备(Fermentas)根据制造商的过程。定量反向transcriptase-PCR(存在)RGC32使用LightCycler ABI 7500系统和执行Maxima®SYBR绿/火箭(Fermentas)。特定的信使rna扩增的引物RGC32如前所述,使用重的et al。15]。反应20卷μL由10μM底漆,10μ12.5 M反向引物μL Maxima SYBR绿色/火箭,和3μL (cDNA PCR模板。基因表达是比较量化的Ct方法,Ct值正常化看家基因GAPDH和计算相对表达式的值。下面的程序条件申请中存在运行:95°C 10秒钟紧随其后40 95°C的周期为1分钟10秒和60°C。表达水平正常化GAPDH,放大后在相同的运行和上述相同的步骤。基因表达分析方法。Q-PCR分析的引物序列GAPDH(173个基点)和RGC32(105个基点)GAPDH-F: TTGCCATCAATGACCCCTTCA GAPDH-R: CGCCCCACTTGATTTTGGA;RGC32-F: AGCCTTCATTGCTGATCTTGA和RGC32-R: GCAGGTCCTCGGAACTTTCT。
2.4。统计分析
数据的统计分析是使用SPSS 18.0软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。甲基化模式之间的关系进行评估计算比值比(或)和95%置信区间(95% CI)从逻辑回归分析。
克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析或单向方差分析测试是用来评估可能的甲基化模式和协变量之间的联系。值低于0.05定义具有统计学意义。
3所示。结果
启动子的甲基化状态RGC32基因检测的DNA样本63零星的乳腺癌肿瘤(平均年龄:63年)和相邻的非癌变组织相同的病人。如表所示2,MM表型更频繁的在乳腺癌肿瘤比良性肿瘤(4.8%比0%),但两组之间没有显著差异被发现(或= 2.30,95% CI -5.54 = 0.95)。我们也检查了RGC32甲基化状态在63年乳腺癌患者的血液样本,我们发现所有样本unmethylated(数据没有显示)。考虑协变量的影响不同的在当前的研究中,我们发现之间没有关联RGC32启动子甲基化和患者的年龄(),年龄时期()、更年期年龄(),肿瘤年级()、阶段()、淋巴结的转移()、雌激素受体()、孕激素受体()和HER2 ()。
qPCR分析表明RGC32信使rna在乳房癌组织中表达水平是高于良性乳腺组织()。GAPDH / RGC32 mRNA的比率和分别在乳房癌和相邻的非癌变组织(图2)。RGC32表达水平是与其DNA甲基化模式关联和相关病人的临床病理的特点()。
4所示。讨论
在当前的研究中,我们发现启动子的甲基化之间没有显著差异RGC32基因在乳腺肿瘤组织和邻近nontumor组织。然而,RGC32信使rna在乳腺癌组织中与相邻的非癌变组织相比,但它不是与DNA甲基化模式有关RGC32基因。此外,甲基化模式和表达水平RGC32与患者的临床特征。
有关RGC32表达,我们的研究结果支持不同的研究报告的结果,RGC32调节卵巢的恶性肿瘤,肺癌、乳腺癌和结肠癌8,16]。Fosbrink et al。16]本地化RGC32蛋白质在不同癌包括肺癌、结肠癌、乳腺癌和邻近地区中发现RGC32是过表达的肿瘤癌(8]。同样,我们的研究结果表明,RGC32在乳腺肿瘤与邻近nontumor组织强调RGC32的似是而非的作用在肿瘤发生。符合我们的发现,Vlaicu等人发现RGC32蛋白没有从正常结肠上皮细胞肿瘤邻近的反对其拟议的肿瘤抑制作用(8]。
RGC32起着关键的作用在调节细胞cycle-specific激酶的活性,从而调节细胞周期进程。本地化在细胞质中,RGC32身体与细胞周期蛋白依赖性激酶associates意思是CDC2和在肿瘤发生和免疫过程中发挥作用6- - - - - -8]。RGC32超表达可能通过下调细胞周期抑制剂和促进细胞复制导致恶性肿瘤的发病机理,表明RGC32参与肿瘤的转换和发展(6]。此外,RGC32起着重要的作用在调节组蛋白的乙酰化作用,这一过程可能导致转录激活,从而支持RGC32的可能功能在肿瘤进展17]。Vlaicu et al。17)表明,RGC32调节组蛋白乙酰化作用的H2B赖氨酸5 (H2BK5) H2BK15, H3K9 H3K18, H4K8。他们的研究结果建议RGC32可能参与结肠癌的发展通过调节染色质组装。尽管越来越多的证据指向RGC32在促进细胞增殖的作用,一些研究涉及RGC32作为肿瘤抑制。金等。5最近报道说RGC32受到启动子甲基化,其DNA甲基化与降低RGC32在nsclc的表情。相比之下,我们并没有发现任何差异甲基化的模式RGC32启动子在癌和良性乳腺肿瘤。
关于各种癌RGC32的双重功能,推测这些反对报告可能源于矛盾RGC32在不同细胞类型的函数。调节皮肤T细胞淋巴瘤,冒号,卵巢,和乳腺癌,导致细胞增殖和肿瘤发生、侵袭性前列腺癌中表达下调,而多发性骨髓瘤,耐药胶质母细胞瘤作为一个肿瘤抑制功能(8]。
全球hypomethylation和地区研究了甲基化在广泛的癌症18最近,但CpG位点DNA甲基化对癌症研究中心的吸引力。最近来自不同组织的DNA分析表明组织差异甲基化区域(dmr) [19]。dmr基因组区域有不同的甲基化状态在多个样本(组织、细胞、个人或其他人)。他们被视为可能参与基因转录调节功能区域。dmr的识别在多个组织提供了一个全面的调查表观遗传差异人体组织(20.,21]。例如,这些甲基化区域独特的特定组织允许个人区分组织类型,如精液和阴道分泌物(22]。此外,dmr癌症与正常样本(C-DMRs)展示的异常甲基化在癌症和可能影响致癌过程。异常甲基化的tDMRs据报道在不同类型的癌症,并可能修改肿瘤抑制基因和/或致癌基因(22]。量化的特定站点CpG甲基化是通过测定亚硫酸氢allele-specific测序等几种方法,bisulfite-pyrosequencing,芯片的全基因组分析。所有这些新技术将改善我们的理解癌症的病理生理学(18,23,24]。
尽管所有的先前的研究已经启用了一个更广泛的观点全基因组DNA甲基化模式,仍有问题需要回答,例如,tDMRs是如何建立和的函数是什么gene-body tDMRs。确定人类tDMR剖面不仅会提供重要的见解的正常流程组织分化;它也可以识别标记的致病过程,比如癌症。
到我们所知这是第一个研究检查协会RGC32启动子甲基化和基因表达在乳腺癌。RGC32 mRNA在乳腺癌组织中表达水平远远高于在nontumorous组织,但它不是与甲基化的模式有关RGC32启动子。此外,我们发现RGC32启动子甲基化并不是不同乳腺肿瘤的组织和nontumorous组织,尽管甲基化表型更频繁地观察肿瘤的组织比nontumorous乳房组织(分别为4.8%和0)。与此同时,我们发现没有启动子甲基化在患者的血液样本。这些发现表明RGC32癌组织中DNA甲基化可能是突然相比,非癌变组织。有一个主要的限制。本研究可能的小样本大小有限的统计力量识别组之间的差别。因此,更大的样本量和深入分析亚硫酸氢盐测序或CpG位点专一的测量可以帮助理解的作用RGC32DNA甲基化在乳腺癌。
相互竞争的利益
没有任何利益冲突。
确认
穆罕默德Hashemi谢天谢地承认扎黑丹大学医学科学支持Ebrahim Eskandari-Nasab的硕士论文。作者感谢所有人自愿参加这项研究。