结合微波吉拉德女士与离子液体矩阵衍生敏感MALDI-TOF人类血清N-Glycans的分析

文摘

我们开发了一个新方法MALDI-TOF检测N-glycans女士来自人类血清。微波吉拉德的协同组合T衍生化固相萃取脱盐,离子液体矩阵(2,5-dihydroxybenzoic酸/苯胺)(GT-SPE-DHB /一)允许N-glycans更敏感的检测比传统离子液体矩阵MALDI-TOF女士证实了我们方法的优越的敏感性N-glycans分配的数量在900 - 2000 m / z范围。使用我们的GT-SPE-DHB /一个方法,我们成功能够分配31聚糖。然而,由于建立方法,即。,DHB/一个method, only 15 glycans were assigned. To the best of our knowledge, this GT-SPE-DHB/An method is the first to combine cationic derivatization of N-glycan and ionic liquid matrix for N-glycan analysis in MALDI-TOF MS.

1。介绍

N-Linked聚糖参与许多生物过程如蛋白质折叠、信息交互和免疫反应(1,2]。更具体地说,血清glycome N-glycosylation变化与癌症和炎症(3),而血清glycome分析可以作为肿瘤生物标记物(4]。因此,N-glycan分析人类血清生物标志物的发现的重要性(5)和癌症诊断(6]。尽管其重要性,然而,以下特点的聚糖多糖分析更具挑战性:异质性N-glycosylation [7glycome]和缺乏一个统一的数据库结构(8]。

多糖分析基于matrix-assisted激光解吸/电离- (MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)有几个优点:样品消耗低,灵敏度高,简单的样品制备。然而,MALDI-TOF分析聚糖女士仍有自己的缺点。他们通常源于固有的电离效率低聚糖(9),可变性在结晶10),和高噪声水平的基质材料minor-abundant多糖分析(11]。

解决这个问题,研究人员已经开发出多糖衍生化方法和离子液体矩阵(ilm)。多糖衍生化包括还原胺,迈克尔加成,酰肼/烷氧基氨基标签,(每)甲基化/ pertrimethylsilylation [12- - - - - -14]。尤其是酰肼化学被广泛用于标签减少碳水化合物(计划的结束1(一))。吉拉德试剂T((羧甲基)trimethylammonium氯酰肼,GT)和P(1 -(羧甲基)吡啶氯酰肼,GP)被用来提高离子化效率的聚糖谱和ESI质谱(15]。吉拉德的永久阳离子试剂在正离子模式下提高峰值强度,也消除了歧义引起的碱金属谱的加合物。另一方面,ilm获得了越来越多的关注,因为他们的优势在真空稳定性和信噪比(S / N)比率较常用的矩阵(16]。一般来说,ilm组成矩阵酸和有机碱,并保持均匀的液态(计划1 (b))。此外,与热的反应相比,微波- (MW)辅助标记反应谱技术优势样品制备,如耦合效率高,反应时间短。

直到现在,化学衍生化和ILM方法已经单独调查解决的问题MALDI-based多糖的分析。在此,我们提出一个化学衍生化和ILM的协同组合。新方法结合微波吉拉德T衍生,SPE脱盐和DHB /离子液体矩阵(GT-SPE-DHB /)是优化和应用于MALDI-TOF女士分析人类血清N-glycans(计划2)。

2。材料和方法

2.1。将军

2.1.1。材料和试剂

Maltohexaose (47873), 2, 5-dihydroxybenzoic酸(DHB, 149357),α-cyano-4-hydroxycinnamic酸(CHCA C2020),p香豆酸(pCA C9008)吡啶(Pyr, 27047),辣根过氧化物酶(77332),NH₄HCO₃D0632 (A6141)、二硫苏糖醇(DTT),三氟乙酸(组织、T6508)从Sigma-Aldrich购买。人类血清购自σ(H4522)。三乙胺(茶,121448),苯胺(一个A0463) 1-methylimidazole (MI, M0508), 1, 1, 3, 3 - tetramethylguanidine (TMG T0148),吉拉德试剂T (GT, B0547)和吉拉德试剂P (GP, G0030)从TCI获得。Peptide-N-glycosidase F (F PNGase P0705L)是来自新英格兰生物学实验室。N₂烘干机SPE干™96双样本集中器系统从Biotage (sd2 - 9600 -国土安全部欧盟)。PNGase F-released聚糖提纯石墨化碳墨盒(GlykoClean™多糖清理站,真空歧管,GC 100, Prozyme)。乙腈是购买从默克公司(1.00030.4000)。溶剂都是高效液相色谱级。

2.1.2。仪表

小叮当LT(旅行社有限公司、韩国)是用于MALDI-TOF杰姆女士发现™微波反应器应用微波反应。Bioshaker (Bioshake智商,德国耶拿分析仪器公司AG)和蒸发系统(EZ-2 Genevac)或Speed-Vac集中器(模块4080 c、韩国)。

2.2。样品制备和矩阵

2.2.1。隔离N-Linked聚糖

5µL(辣根过氧化物酶(30毫克/毫升)被添加到每个血清样本(50μL),然后50μL (NH 200毫米₄HCO₃含有二硫苏糖醇添加10毫米。蛋白质变性是由样品放置到Bioshaker在65°C (1500 rpm) 5分钟。N-linked聚糖被释放从变性蛋白质的1000单位PNGase F . PNGase F进行消化在微波快速酶消化系统(输出功率= 400 W,旅行社有限公司韩国)8分钟的37°C。然后,冰冷的乙醇(450μL)补充说,蛋白质被使离心沉淀在4°C (3700 rpm) 50分钟。蛋白质沉淀了,上层清液携带N-linked聚糖被转移到新管和干N₂干燥器1 h。然后,550年μ蒸馏水和5 LμL maltohexaose (25μg / mL)被添加到干多糖样品。

2.2.2。多糖纯化

的PNGase F-released聚糖被固相萃取提纯石墨化碳墨盒(Carbograph Alltech Associates Inc .)。在装货前,墨盒是平衡与CH组织0.1% 80%₃CN和水多次。多糖的解决方案(550μL)是预先处理应用于弹药,然后随后墨盒是用水洗。的聚糖20%最终被筛选了CH₃CN。每个筛选了多糖样品被蒸发干燥系统在70°C。干聚糖溶解在15μL的水用于衍生化和MALDI-TOF MS分析。

2.2.3。衍生化的Maltohexaose GT(或全科医生)试剂(热条件)

GT的溶液(或全科医生)是由溶解1毫克(6μ试剂的摩尔)1毫升的乙酸/水(10:90,v / v)。Maltohexaose (15μL股票2毫米)添加到100μ解决方案的L(20倍)螺旋帽瓶。衍生化样本加热在75°C 3 h。Speed-Vac溶剂被移除。残留于120年解散μL (CH₃CN/water (70:30, v / v),由MALDI-TOF直接分析了整除。

2.2.4。衍生化的N-Glycans GT试剂

(1)热衍生化。16μL N-glycan样本(maltohexaose作为内标,是混合了20μL GT衍生化解决方案(6毫米)在醋酸/助溶剂(15:85,v / v)。助溶剂是由CH₃哦/水(1/1,v / v)。32μL酸乙酸/助溶剂(15:85,v / v)添加到样本。加热的解决方案是在埃普多夫全能料理机(1000 rpm, 75°C, 3 h)。残留溶剂蒸发,是应用于石墨化碳盒去除多余的未反应的GT,纯化GT-tagged聚糖干和稀释30μL (CH₃CN/water (1:1, v / v)。

(2)微波衍生化。32µL N-glycan样品(没有飙升的)是100年混合µL GT的解决方案(6毫米)在醋酸/助溶剂(20:80,v / v)。在微波反应器进行反应(酶消化方式,纤维光学温度计,权力= 60 W)在75°C 1 h。溶剂被免职,残渣纯化的石墨化碳盒。Speed-Vac干燥后的多糖衍生化与60个样本稀释µL (CH₃CN/water (1:1, v / v)。

2.2.5。离子液体基质制备

ILM准备如下:矩阵(DHB 5 CHCA 6.1p分别为CA 5.4毫克)溶解在1毫升的CH₃CN/water (1:1, v / v)和基地(苯胺8.8,7.6米,TMG 12日茶13.4,Pyr 7.8μ分别为L)添加到矩阵的解决方案(1:3摩尔比率的矩阵为基础)。

2.3。MALDI-TOF女士测量

使用小叮当MALDI-TOF质谱得到LT仪器(旅行社有限公司、韩国)。女士MALDI-TOF是在正离子模式下,操作电压检测器(−1.9 kV),激光功率N-glycans maltohexaose(60%和90%)。质谱是由1600年激光枪。数字转换器的采样率是在1250 MS /秒(megasamples每秒),和完整的数字化仪的扫描速率为0.1 V。质谱是获得800年和2400年之间m / z。多糖样本与ilm的混合比率(1:1,v / v)和1.5μ我被加载μ专注不锈钢板(旅行社有限公司、韩国)。板在真空室干5 h后分析。

3所示。结果与讨论

3.1。ILM的筛选候选人和衍生化试剂

在第一步中,15 ILM组合(3矩阵(DHB CHCA,pCA))和5个基地(一个MI, TMG,茶,和Pyr) (ESI图就做好了准备S1)和测试三种不同的方法(吉拉德的T、P和nonderivatization作为参考)。45(3×5×3)组合筛选,和maltohexaose多糖被用作模型。在15 ilm,五双(DHB /, DHB / Pyr CHCA /一个CHCA /茶,和CHCA / MI)显示相对较高的R / N比率(表1)和峰值强度(ESI表S1)。考虑到ILM的多样性,我们选择三个ILM的候选人(DHB / CHCA / MI, CHCA /茶)下一步。

ILM的三个候选人和GT / GP试剂与maltohexaose飙升N-glycan样品进行了测试,找出它们的最佳组合(ESI图S2)。GT衍生导致比医生更好的光谱。此外,DHB /一副比CHCA /茶或CHCA / MI对女士的信号强度和背景噪音。因此,我们选择了GT和DHB /一个组合的进一步优化。这酸/碱选择同意Perreault的报告(17),DHB / ILM显示在本地低聚糖的敏感性显著改善MALDI-TOF女士。

3.2。样品制备

成功N-glycan MALDI-TOF女士分析GT-DHB /组合,应该满足两个条件:完成GT耦合和高信噪比。常规参数,如GT等效、反应温度、醋酸的比例,被从先前的报道15,18](相当于GT, 75°C, 15%乙酸),我们检查了GT标记效率条件下。不幸的是,报道N-glycan样本参数没有很好地工作。实现完整的GT耦合和高信噪比,我们利用微波(MW)辅助GT衍生化和固相萃取(SPE)脱盐。研究人员已经使用MW-assisted多糖衍生化(19和脱盐N-glycans的样品制备20.]。脱盐过程更重要的在我们的实验中,因为过多的使用GT试剂的量。

三个条件进行测试:1 = MW-assisted GT衍生化条件没有SPE脱盐,2 =传统GT与SPE脱盐衍生化条件,和条件3 = MW-assisted GT与SPE脱盐衍生化。我们匹配观察到山峰女士与人类血清N-linked glycome图书馆由s . r .报道Kronewitter et al。21]。总共有13个山峰一般的条件。的平均增强因素条件3分别为16.6±7.0对条件1和2.1±0.5条件2(表2)。MW-assisted GT衍生化和SPE脱盐都必须加强N-glycan女士强度分析。

3.3。人类N-Glycan MALDI TOF MS分析

我们能够确认的优势GT衍生化的组合和优化MW-assisted DHB / GT衍生化和SPE脱盐条件(图1)。N-glycan分析相比DHB /方法,我们GT-SPE-DHB /方法的噪声水平显著降低。的y设在规模增长了7倍左右我们的方法(7.1×10⁵与1。1×10⁵)。我们安排31聚糖使用GT-SPE-DHB /优化方法。

为了证明我们的方法的优越性N-glycan分析,我们比较所有分配的峰值强度女士聚糖通过方法1 (MW-assisted GT derivatization-SPE desalting-DHB / ILM组合)与方法2 (DHB / ILM)。峰值强度分配聚糖表中列出3,并总结了它们的S / N比ESI表S2。峰值强度和信噪比都表现出同样的趋势在排名和增强因子。

31聚糖被分配方法1,和15聚糖通常由两种方法。峰值强度排名在维恩图解(图进行了分析2)。31日聚糖可分为两组。设置一个(紫色的颜色,)包括聚糖通常由方法1和2。与此同时,设置B(红颜色的,),这是一个互补的设定,包括聚糖只分配方法1。峰值强度相关的特定的多糖是多糖的丰度和MALDI电离效率。所有的高级聚糖(组1,排名规模从1到10)很容易由两种方法。然而,只有4种聚糖组2(排名从11到20度)和1多糖组3(规模排名从21到31)被分配方法2。另一方面,16聚糖在B组属于组2和3(低丰度和可怜的MALDI电离效率),新分配的使用方法1。简单地说,我们的GT-SPE-DHB /一个方法表现出更好的灵敏度比常规DHB /方法。

GT-SPE-DHB /方法的灵敏度提高多糖女士也证实了峰值强度增强。我们计算增强因素(EFs) 15通常分配聚糖组答:方法1显示峰值强度高8.8倍(STD±6.5)比方法2。改进的EF表明,方法1有效地抑制噪声和提高MALDI电离而DHB /方法。这些数据支持聚糖具有相对较低的丰度和穷人MALDI电离效率可以检测到我们的GT-SPE-DHB /一个方法。

4所示。结论

我们提出了一种新的方法结合化学衍生化和离子液体为敏感MALDI-TOF矩阵分析N-glycans女士。我们的方法包括微波吉拉德T衍生,SPE脱盐和DHB /离子液体矩阵(GT-SPE-DHB /一个)。它们的协同组合导致更敏感的多糖检测比传统DHB /方法MALDI-TOF女士使用GT-SPE-DHB /一个方法,我们成功能够分配31聚糖从人类血清N-glycan样品900 - 2000 m / z范围。然而,由于建立方法,即。,DHB/一个method, only 15 glycans were assigned. To the best of our knowledge, this GT-SPE-DHB/An method is the first to combine cationic derivatization of N-glycan and ionic liquid matrix for N-glycan analysis in MALDI-TOF MS.

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由韩国卫生技术研发(HI16C1010 TWK)项目由韩国卫生部&福利和支持的新兴产业技术开发项目(# 10045057,KHP)由朝鲜贸易、工业、分别和能源。

补充材料

每个辅料都有自己的标签(图S1;表S1),标签是包括在手稿(例如,ESI表S1)。(补充材料)

引用

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