优化超声波提取的酚类化合物淫羊藿brevicornum马克西姆使用响应面方法和评价其体外抗氧化活动

文摘

ultrasound-assisted提取的酚类化合物淫羊藿brevicornu格言是使用响应面建模方法。中心复合设计(CCD)来优化三个提取变量,包括乙醇浓度(X₁),提取时间(X₂)和水的比例乙醇原料(X₃),高成就的酚类化合物的萃取率。优化的条件X₁50% (v / v),X₂27.5分钟,X₃250 mL / g。在这种情况下,实验收益率为4.29±0.033%。抗氧化活性是评价利用DPPH实验和ferric-reducing抗氧化能力(捆牢)。这表明,酚类化合物淫羊藿brevicornu马克西姆具有显著的抗氧化活性。高效液相色谱分析表明,主要的酚类化合物的提取产品被确认为没食子酸、儿茶素(Cianidanol)、羟基苯甲酸、香荚兰酸,咖啡酸,ferulaic酸、芦丁、苯甲酸和槲皮素。

1。介绍

的草Epimedii(家庭小檗科)是普遍的在亚洲,欧洲,中东和远东。这是一个著名的中药,由空中干的部分淫羊藿brevicornum格言,淫羊藿sagittatum(摘要。调查)。格言,淫羊藿下毛竹格言,淫羊藿wushanenset . s .,淫羊藿koreanum纳街(1]。它常用于治疗心血管疾病和其他慢性疾病(不孕,失忆和衰弱,阳痿,老年功能性疾病)在中国2000多年(2]。

自由基,化学反应,和几个不同化合物的氧化还原反应可能会导致蛋白质氧化、DNA损伤、脂质过氧化作用在活细胞3]。多酚类物质,一个大的类植物次生代谢产物,是许多天然产物的重要有效成分从植物,可以保护人体免受自由基和妨碍许多慢性疾病的进展。目前,多酚吸引了广泛关注由于各种生物和药理活性,包括抗氧化、抗菌、抗癌活动(4,5]。

超声波协助提取(UAE)是一种最便宜,简单,快速,高效的绿色萃取技术与传统萃取(6),被应用到从不同的材料中提取生物活性化合物由于其高重现性在短时间,简化操作,显著减少溶剂消耗,和温度,在尊重其他经典方法(7,8]。因此,超声波技术已被应用在某些行业,如食品工业、化工、和材料(9]。

响应面方法(RSM),一个有效的统计方法的建模和优化的复杂过程,已经越来越多地用于优化工艺参数由于更有效和更容易安排和解释的实验相比(8,10,11]。RSM的优点是减少数量的实验试验需要评估多个参数及其交互。因此,它广泛应用于优化提取参数,如多糖(12),花青素(13),酚类化合物(14)和蛋白质(15从不同的材料)。

在这工作,本研究的目的是探讨提取变量(乙醇浓度,提取时间,乙醇和水的比例原材料);优化这些变量的值由RSM酚类化合物收率最大化;并研究了酚醛含量与抗氧化活性之间的关系淫羊藿brevicornum马克西姆此外,酚类化合物的抗氧化活性是通过DPPH实验来评估和收紧。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

淫羊藿brevicornum格言是来自吉林省由张Lianxue教授(中国)和验证(吉林农业大学、吉林、中国)。Folin-Ciocalteu酚试剂,碳酸钠,2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)、没食子酸、儿茶素(Cianidanol)、香草酸、羟基苯甲酸,咖啡酸,ferulaic酸、芦丁、苯甲酸、槲皮素、维生素C (Vc)从阿拉丁(上海,中国)。甲醇(高效液相色谱级)从霍尼韦尔Burdick购买&杰克逊(韩国蔚山、韩国)。超高纯净水用于本研究准备Milli-Q净水系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。其他化学制品均为分析纯。

2.2。酚类化合物的提取

酚类化合物提取的过程淫羊藿brevicornum所以格言的超声治疗进行超声波发生器(250 W, 40 kHz, kq - 250 b,昆山,中国)。干淫羊藿brevicornum格言是由一个粉碎机粉(fw - 200,北京),然后通过80目筛。1克的淫羊藿brevicornum马克西姆粉末用于每个烧杯中。烧杯在超声波发生器和暴露于提取酚类化合物对不同提取时间在不同乙醇浓度不同比例的水乙醇原料。

2.3。总酚含量(TPC)的决心

超声波处理后,提取的泥浆离心机在4000 rpm 15分钟收集上层的。总酚类的内容由Folin-Ciocalteu方法(16]。简而言之,稀释样品(0.50毫升)被添加到1:10 Folin-Ciocalteu试剂(2.5毫升)稀释。4分钟后,饱和碳酸钠溶液(约75 g / L, 2毫升)是补充道。孵化2 h后在室温下,反应混合物的吸光度测量在760海里。没食子酸作为参考标准,结果表示为毫克没食子酸当量(mg GAE) / g干重的植物材料。所有的实验进行了一式三份,结果表示为平均数±标准差(标准差)。抗氧化能力之间的相关性和总酚含量使用简单线性回归分析,和相关系数(R²)计算。

2.4。测定体外抗氧化试验

2.4.1。还原能力测定

ferric-reducing抗氧化能力(收紧)据报道过程评估与少量修改17]。不同浓度的淫羊藿brevicornum格言(5 ~ 1000μg / mL)钠磷酸盐缓冲剂(1.5毫升,0.2 M, pH = 6.6)混合了铁氰化钾(1.5毫升,1%,w / v)的混合是在50°C的环境中20分钟。之后,三氯乙酸(TCA, 1.5毫升,10%,w / v)补充道,混合物是离心机在3000 rpm,持续15分钟。离心液(1.5毫升)用去离子水彻底混合(1.5毫升)和FeCl₃(0.3毫升,0.1%,w / v),和吸光度测量在700海里。反应混合物的吸光度的增加表明还原能力。还原能力表示为EC₅₀(μg / mL),样品的浓度导致0.5 OD 700海里。丁基羟基甲苯(二叔丁基对甲酚)作为标准。

2.4.2。DPPH自由基清除实验

DPPH^•淬火的酚醛compoundsfrom能力淫羊藿brevicornum格言是根据Hanato的测量方法18]。甲醇DPPH的解决方案(0.15%)与串行混合稀释(5 ~ 1000μg / mL)淫羊藿brevicornum马克西姆在10分钟后,吸光度是阅读在515海里。反激进主义的活动表示为IC₅₀(μg / mL),反激进主义的剂量要求导致50%的抑制。维生素C作为标准。清除DPPH自由基的能力计算使用以下方程: 在哪里的吸光度控制在30分钟吗样品的吸光度在30分钟。所有样品都是一式三份分析。

2.5。高效液相色谱分析

分析了提取酚醛树脂采用高效液相色谱法(16)做了一些调整。使用高效液相色谱法(cxth - 3000系列,北京通恒创新科技有限公司,有限公司,中国)配有紫外检测器(LC3000,北京通亨)和C₁₈列(5μ米、250毫米×4.6毫米、大连Jiangshen分离技术有限公司)。超纯水作为溶剂一个和100%甲醇作为溶剂B(0 ~ 40分钟,:5% ~ 60%;40 ~ 50分钟,:60% ~ 60%)。标准的解决方案和提取酚醛树脂过滤0.45纳米注射器过滤器。操作条件列温度、30°C;注入体积,20μL;检测波长280 nm;流量,1.0毫升/分钟。酚醛树脂的识别和峰分配是基于比较保留时间和光谱数据与标准。确定了酚醛树脂是量化根据各自标准校准曲线。

2.6。实验设计

中心复合设计(CCD)来确定最佳的组合为酚类化合物提取变量结果的基础上初步单因素测试。提取时间(),乙醇浓度()和水的比例乙醇原料()是独立的变量,和未编码的编码水平表1。萃取率()作为响应设计实验给出了在表S1, S2,表S3,图S1a图印地图就是S1c图S2,图S3、S4,补充材料中显示这将是网上http://dx.doi.org/10.1155/2014/864654。

2.7。统计分析

所有的数据都是一式三份和平均结果来决定。SPSS软件版本18被用来评估DPPH实验和收紧。设计专家软件版本8.0.6.1 (stat容易,明尼阿波利斯)采用回归分析和优化。

3所示。结果与讨论

3.1。乙醇浓度对提取率的影响的酚类化合物

提取工艺进行了在不同乙醇浓度为5%,10%,20%,40%,60%,80%,和95%,而其他参数如下:提取时间30分钟,含水乙醇比原材料300 mL / g。乙醇浓度对提取率的影响如图S1a酚类化合物。萃取率是计算使用以下方程: 在哪里总酚类化合物和内容吗的质量淫羊藿brevicornum的格言。所有样品都是一式三份分析。

萃取率的方差先增加,然后随乙醇浓度的增加,峰值为60% (v / v)。乙醇/水被选为独特的萃取剂,而不是其他人,因为乙醇的低价格,低毒性,从容的回收(这是好从环境的角度来看),和良好的极性提取感兴趣的组件。据报道,水是作为植物膨胀剂,在乙醇被认为破坏溶解物和植物之间的成键矩阵(19]。此外,水的介电常数高,从而导致不同的乙醇浓度与不同极性(20.]。因此,结果可能与溶剂极性和多酚的溶解度淫羊藿brevicornum格言,乙醇浓度60% (v / v)对提取酚类化合物有好处。

3.2。酚类化合物的提取时间对提取率的影响

提取工艺进行了使用提取时间从5到50分钟,而其他参数如下:乙醇浓度60% (v / v)和水的比例乙醇原料300 mL / g。的酚类化合物的提取时间对提取率的影响淫羊藿brevicornum马克西姆如图印地。当萃取时间的增加,萃取率的方差相当迅速,达到一个最大值40分钟,然后提取收益减少,可能是由于多酚的结构破坏和分解在长时间的提取时间21]。因此,40分钟是有利于提取酚类化合物。

3.3。水乙醇比原料对酚类化合物的萃取率

提取工艺进行了使用水乙醇原料比在20到300 mL / g,而萃取时间和乙醇浓度是固定在40分钟,60% (v / v)。的效果比水乙醇原料在酚类化合物的萃取率如图就是S1c。随着含水乙醇原料比的增加,萃取率逐渐增加,最高产量达到250 mL / g,然后稍微降低后含水乙醇原料的比例超过250 mL / g。这种现象可能是由于传质原理和超声波能量密度的分布提取解决方案(22]。比率越低含水乙醇的原料有更高的浓度梯度,导致更高的扩散和提取率。但是当比率超过250 mL / g,超声能量密度的分布的减少提取解决方案为主导和提取率有负面影响。因此,含水乙醇比原材料250 mL / g是充分提取酚类化合物。

3.4。优化提取参数的酚类化合物

表S1显示了过程变量和实验数据包含3复制中心点17分。通过应用多元回归分析实验数据,响应变量的模型可以表现出下列二次多项式方程的形式编码的值:

方差分析见表(方差分析)模型S2。确定系数表明只有0.95%的总变化并不用模型来解释。良好的统计模型,调整决定系数(adj)应该接近。如表所示S2,的(0.9782)接近。此外,pred(0.9664)是在合理的协议调整和确认模型是非常重要的。缺乏合适的测试确定是否足以解释选择的模型实验数据,还是应该选择另一个模型。缺乏合适的价值测试(0.9720)高于0.05,相对于纯误差不显著,表明拟合模型来描述实验数据来说是足够的。足够的精度是一个测量的信噪比,信号噪声的比值大于4被认为是可取的(23]。足够精确的值是26.402,展示一个适当的信号。同时,相对较低的值的变异系数(CV)(3.25)表明一个更好的精度和可靠性的实验值。因此,预测的模型是足够的实验变量的范围。

每个系数测量使用的重要性价值和值是表S3中列出。小和更大的价值值意味着相应的变量会更重要。的模型的值小于0.0001,这表明该模型具有重要意义,可用于优化提取变量。三个独立变量(,,)和三二次术语(,,)显著影响萃取率在99%置信区间,和之间的交互提取时间和乙醇浓度(),以及提取时间()和提取时间(),是重要的()。与此同时,含水乙醇原料(比)是影响萃取率最重要的因素。

3.5。响应面分析

等高线图2 d和3 d响应面回归方程的图形化表达和非常有用的法官独立和相关的变量之间的关系。不同形状的轮廓图表明是否可以相互之间的相互作用是否显著的变量。圆形的等高线图意味着相应的变量之间的相互作用可以忽略不计,而椭圆轮廓显示对应的变量之间的相互作用是重要的。响应面和二维轮廓的三维表示模型生成的数据S2-S4所示。在这三个变量,当两个变量是描述三维表面情节,第三个变量是固定在零水平。在数字S2-S4发现所有三个响应表面凸形状,这表明变量的范围是正确选择。如图S2,提取率增加迅速,当乙醇浓度()和提取时间()的范围增加20 - 47.8% (v / v)和5 - 32.5分钟,分别;但超过47.8%和32.5分钟,萃取率略有降低。这表明乙醇浓度的影响()和提取时间()萃取率是重要的,在良好的协议与S3的结果表。此外,椭圆轮廓图在图S2意味着有一个重要的两个变量之间的交互,也同意表S3中的结果。很明显在图S3;乙醇浓度()和水的比例乙醇原料()二次对萃取率的影响。起初提取率增加,然后下降迅速增加的两个参数,并实现最大提取率当乙醇浓度()和水的比例乙醇原料()49.5% (v / v)和219.0 mL / g,分别。可以看出,相互之间的交互乙醇浓度()和水的比例乙醇原料()是重要的由于椭圆轮廓图如图S3,也证实了S3中的结果表。从图S4,提取时间()和水的比例乙醇原料()二次对萃取率的影响。起初提取率增加,然后下降迅速增加的两个参数,并实现最大提取率当提取时间()和水的比例乙醇原料()是34.5分钟,220.0 mL / g,分别。可以看出,相互之间的交互提取时间()和水的比例乙醇原料()是重要的由于椭圆轮廓图如图S4,也证实了S3中的结果表。

3.6。模型的验证

模型的适用性方程预测最优响应值测试使用选定的最佳条件。最优条件是乙醇浓度()的50.8% (v / v)、提取时间()为27.9分钟,比水乙醇的原料()250.7 mL / g,预期收益率为4.28%。然而,考虑到可操作性在实际生产中,最优条件修改如下:乙醇浓度()的50% (v / v)、提取时间()28分钟,含水乙醇原料(比250 mL / g),根据该实验收益率% (),同意与预期收益率,因此指示RSM模型是令人满意的和准确的。

3.7。减少的力量淫羊藿brevicornum格言

的结果淫羊藿brevicornum马克西姆还原能力被显示在图1(一)。它显示的还原能力淫羊藿brevicornum马克西姆相比标准二叔丁基对甲酚;的还原能力淫羊藿brevicornum马克西姆的样本数量的增加而增加。欧共体₅₀的价值淫羊藿brevicornum格言和二叔丁基对甲酚μ克/毫升,μ分别g / mL。这些结果表明,酚类化合物淫羊藿brevicornum马克西姆显示很高的还原能力体外。

3.8。清除DPPH自由基活动

为中心的稳定氮自由基DPPH,已经被用来评估天然抗氧化剂的激进淬火能力在一个相对短的时间内,与其他方法相比(24]。的清除活动淫羊藿brevicornum格言对DPPH自由基相比,标准的维生素C是如图1 (b)。淫羊藿brevicornum马克西姆DPPH活动表现出明显的剂量依赖性抑制作用,抑制了50% (IC₅₀)的浓度μ克/毫升。的集成电路₅₀维生素C的价值。31μ克/毫升。这些结果表明,酚类化合物淫羊藿brevicornum格言对清除DPPH自由基有显著的影响。

3.9。抗氧化活性和总酚含量之间的相关性

相关系数()与抗氧化活性之间的总酚含量淫羊藿brevicornum马克西姆决心(表2)。抗氧化活性和总酚含量表现出良好的相关性在收紧和DPPH提取物。和收紧在DPPH也表现出良好的相关性。

3.10。高效液相色谱分析,提取成分和多酚含量

图2显示标准混合物的色谱图和提取。高效液相色谱的色谱图显示,没食子酸、儿茶素、羟基苯甲酸、香荚兰酸,咖啡酸,ferulaic酸、芦丁、苯甲酸和槲皮素的主要酚类化合物淫羊藿brevicornum的格言。的内容没食子酸、儿茶素、羟基苯甲酸、香荚兰酸,咖啡酸,ferulaic酸、芦丁、苯甲酸和槲皮素淫羊藿brevicornum格言是计算从各自的标准校准曲线表所示3和没食子酸值是0.14%,儿茶素为1.50%,对羟基苯甲酸0.50%,0.13%为香草酸,咖啡酸0.07%,0.05% ferulaic酸,1.12%为芦丁,槲皮素为苯甲酸0.19%,0.14%。这些结果表明,儿茶素和芦丁主要负责抗氧化活性。

4所示。结论

在目前的研究中,增强的条件提取的多酚淫羊藿brevicornum格言,阿联酋与中心复合设计优化基于响应面方法。

基于单因素测试,中心复合设计被用来评估和ptimize提取变量(乙醇浓度,提取时间,乙醇水溶液比原料)的萃取率。优化条件如下:乙醇浓度50%,萃取时间27.5分钟,含水乙醇比原材料250 mL / g。在这些条件下,实验收益率为4.29%,同意与预期收益率为4.28%。这个优化提取增加了1.68%的总酚含量产生明显与之前的研究相比,由黄等。25]。抗氧化活性是评价利用DPPH实验和ferric-reducing抗氧化能力(捆牢)。这表明,酚类化合物淫羊藿brevicornum马克西姆具有显著的抗氧化活性。高效液相色谱分析和提取的DPPH实验表明,由没食子酸、儿茶素、羟基苯甲酸、香荚兰酸,咖啡酸,ferulaic酸、芦丁、苯甲酸、槲皮素和显著的抗氧化活性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

严赵,迎迎侯,国盛汤的贡献同样工作。

确认

本研究工作是由中国自然科学基金会支持下批准号31000154;中国国家科技支撑项目批准号。2011年bai03b01;2009 gjb10031;下的中国国家非营利行业研究特殊项目批准号201303111;吉林省科技发展计划下批准号。20126046;20140204013 yy;20130303094;20140311050 yy; Special Program in the Pharmaceutical Industry in Jilin Province under Grant no. YYZX201258.

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