Ionotropic凝胶合成Chitosan-Alginate盘系统和交付在体外评估前列腺癌的细胞毒性

文摘

我们报告的合成chitosan-alginate盘(Cs-Al NDs)使用一个简单的方法组成的ionotropic凝胶的方法。三聚磷酸钠(STPP)被用作交联剂促进胺组之间的静电相互作用的壳聚糖和海藻酸羟基和羧基团体。扫描电子显微镜(SEM)图像提供了直接证据的形态学观察纳米盘的集聚由于官能团之间的静电相互作用。此外,动态光散射(DLS)显示的水动力大小Cs-Al NDs 227 nm和152 nm)在酸碱1.2和7.4,分别在协议中观察到的信息扫描电镜图像。提出了化学结构主要是氨基和羧基组由于壳聚糖和海藻酸盐纳米盘的存在,分别,允许通过h联系静电相互作用。根据x射线衍射,我们发现Cs-Al NDs表现出典型的壳聚糖和海藻酸的结构,导致聚电解质复合物的形成。我们也评估了阿莫西林的封装nanodisk,获得74.98%的装载效率,以及最大在体外释放量的52.3%和63.2在pH值为1.2和7.4,分别。Cs-Al纳米盘的最后,细胞毒性效应表现在人类前列腺上皮PWR-1E和高加索前列腺腺癌曲泽细胞系,细胞的生存能力是80%以上表明低抑制和确定Cs-Al NDs控制输送系统是一种很有前途的技术。

1。介绍

最近,多糖等天然聚合物已被广泛探讨的合成纳米材料应用于多个应用程序,尤其是在生物医学和制药领域1,2]。多糖如壳聚糖和海藻酸是丰富的,可以发现很容易在环境中,具有优良的物理化学和生物学性质如生物相容性、生物降解性,低毒性,证明这些生物聚合物适合持续控制药物运载系统(3- - - - - -5]。这些生物聚合物编目(GRAS)通常被认为是安全的食品和药物管理局(FDA),允许他们使用药物输送系统(6]。

壳聚糖是一个线性和阳离子生物聚合物来自几丁质经过脱乙酰作用过程和组成β(1 - 4)2-acetamido-2-deoxy——有关β-D-glucopyranose和2-amino-2-deoxy -β-D-glucopyranose结构,提供丰富的胺(nh)₂)官能团更好的吸附能力和环境适应能力1,7,8]。另一方面,藻酸盐是一种阴离子聚合物来自海藻和化学结构有关的(1、4)β-D-mannuronic和α——ʟ-guluronic酸半个,羟基(-哦)和羧基基团(羧基)提高可用性和稳定性在酸性环境中,提供一个潜在的应用程序封装和控制释放药物(9- - - - - -11]。

壳聚糖和海藻酸的氨基和羧基组,分别通过一个ionotropic凝胶能促进技术快速静电相互作用主要形成聚电解质复合物纳米复合材料广泛用于伤口敷料、组织工程和药物输送12- - - - - -14]。Ionotropic凝胶由生物聚合物的交联的存在多价离子化合物如三聚磷酸钠(STPP);然而,polycationic和生物聚合物的聚阴离子性质可能形成一个复杂聚电解质在水溶液中自发(12,15]。因此,两者的结合生物聚合物是证明是更有效的比壳聚糖和海藻酸分别提高绑定在酸性和碱性环境中性能和稳定性,使更多的交付和控制释放药物根据外部的刺激,也可能扩展到其他特征的环境如温度和离子强度(16,17]。

我们在此报告的合成chitosan-alginate盘(Cs-Al NDs)使用ionotropic凝胶技术,STPP作为高度紧张的代理之间的强烈的静电相互作用促进生物聚合物的官能团。在这项研究中,扫描电子显微镜(SEM)、动态光散射(DLS),傅里叶变换红外光谱(FTIR)和x射线衍射(XRD)进行获得形态和物理信息,分别。我们也评估效率和封装在体外释放的能力Cs-Al NDs在酸性和碱性环境中,使用阿莫西林作为模型药物。最后,我们评估的细胞毒性影响Cs-Al NDs上人类前列腺上皮的细胞生存能力PWR-1E和高加索前列腺腺癌曲泽细胞系。

2。材料和方法

2.1。材料

壳聚糖脱乙酰作用(85%),三聚磷酸钠(STPP)和乙酸购自阿尔法蛇丘,海藻酸钠是丹尼斯克。盐酸(HCl)、磷酸钾(K₃阿宝₄)、氢氧化钠(氢氧化钠)和氯化钾(氯化钾)是从Panreac提供的。从Genfar阿莫西林收购。人类细胞系曲泽和PWR-1E获得美国类型文化集合(写明ATCC)。胎牛血清,penicillin-streptomycin、角化细胞文化、牛脑垂体提取物,EGF重组人类蛋白质是从热费希尔科学提供的。磷酸盐(PBS)、台盼蓝吩嗪ethosulfate (PES)和(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium) MTS是从Sigma-Aldrich购买的。CellTiter 96®水从Promega获得的细胞增殖工具包是一个解决方案。

2.2。合成Chitosan-Alginate盘(Cs-Al NDs)

Cs-Al NDs是由ionotropic凝胶壳聚糖和海藻酸钠使用STPP作为高度紧张的代理(18]。壳聚糖(2.25毫克/毫升)添加醋酸溶液中为1% 在700 rpm磁力搅拌,直到生物聚合物溶解完全。然后,海藻酸钠(0.5毫克/毫升)和STPP(1毫克/毫升)解决方案准备在蒸馏水和混合执行壳聚糖交联。凝胶是由一滴一滴地添加海藻酸钠/ STPP解决方案到壳聚糖凝胶后3:1 比率在700 rpm磁搅拌10分钟。最后,暂停离心沉淀在5500 rpm Cs-Al NDs 15分钟,然后上层清液含有未反应的聚合物被轻轻地使用吸管。的as-synthesized Cs-Al NDs和蒸馏水洗几次然后冻干获得最终产品。

2.3。描述

冻干的表面形态和形状Cs-Al NDs使用扫描电子显微镜(SEM)观察技术在高性能JEOL地产6490 LV设备高分辨率为3.0 nm和低真空模式。成像的Cs-Al NDs下降到外面黄金外套溅射涂布机,在室温下晾干。水动力的大小和粒度分布测定使用动态光散射(DLS) Horiba lb - 550设备。官能团测定的那些时光6700傅立叶变换红外光谱(热科学)设备使用NICOLET波长400至4000厘米¹。进行了x射线衍射(XRD),目的是获得水晶信息使用一个爱视宝PANalytical苍天系列二2θ范围从5到80°。Cs-Al NDs分散在2缓冲溶液的pH值1.2和7.4使用超声波浴,然后分析一式五份。紫外可见分光光度法光谱确定阿莫西林的封装效率和释放在pH值1.2和7.4收集使用uv - 2650光谱仪。

2.4。阿莫西林的封装效率

阿莫西林是作为模型药物Cs-Al NDs的封装。nanodisk准备的过程后,阿莫西林(0.1毫克/毫升)添加到STPP解决方案之前交联壳聚糖。凝胶化过程中提到的一样的前一步Cs-Al NDs合成。阿莫西林的封装效率(EE)计算得到的上层清液离心后,其中一个使用uv - 2650紫外可见分光光度计测量吸光度在247海里。校准曲线可以量化的免费阿莫西林在上层清液,然后确定EE %在一式三份

2.5。体外释放阿莫西林

研究阿莫西林执行版本使用PBS解决方案在pH值为1.2和7.4,以评估药物的控制交付和Cs-Al NDs的稳定性在酸性和碱性介质,分别。PBS的pH值1.2准备用50毫升的氯化钾(0.2)和85毫升盐酸(0.2米)的解决方案,在平行,PBS pH值7.4得到混合100毫升的K₃阿宝₄(0.1米)和78.2毫升氢氧化钠(0.1米)。然后,30毫克的阿莫西林加载Cs-Al NDs是分散在120毫升每个PBS溶液和放置在一个孵化器瓶150 rpm在37°C下总段8 h。整除5毫升被每个0.25 h在第一个小时,每个第二小时0.5 h,然后每小时;随后,相同取代新鲜PBS保持总量不变。每个整除离心10分钟,每分钟5500转,其吸光度是收集247海里计算累积释放(CR)的阿莫西林Cs-Al NDs根据 在哪里阿莫西林数量在Cs-Al NDs内容吗 (g)和阿莫西林在Cs-Al NDs内容数量吗 (g)。

2.6。体外细胞毒性评估

2.6.1。人类细胞系培养

人类前列腺上皮PWR-1E和高加索前列腺腺癌曲泽细胞系培养和孵化在96孔板使用杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) 37°C和5%股份₂湿润的空气气氛24 h。DMEM补充10%胎牛血清,1% penicillin-streptomycin,角化细胞细胞培养基。角化细胞细胞培养基以前补充10%牛脑垂体提取物和EGF重组人类蛋白质。细胞株是通过40和扩散,直到达到70 - 80%的confluency之前培养Cs-Al NDs。培育和孵化后,DMEM被删除,取而代之的是新鲜补充DMEM包含Cs-Al NDs, 10点25,50μg / mL用PBS的培养基控制盘以前分散在同一个PBS直到达到200μ克/毫升。细胞系培养,在同等条件下孵化48和72 h和一式三份。

2.6.2。台盼蓝和CellTiter 96®水可行性分析

PWR-1E的可行性和曲泽细胞株是通过两种不同的方法评估,台盼蓝和CellTiter 96®水。培育和孵化后,DMEM摘除和细胞系与PBS洗几次,消除残余Cs-Al二重唱。对于第一种方法,新鲜的DMEM和10μL(台盼蓝也添加到每个的体积比10:1,分别。细胞系然后在相同条件下孵化2 h。孵化后,细胞系被置于一个纽鲍尔室为手动细胞计数来确定细胞生存能力每毫升(CV)。在计算细胞排斥台盼蓝,简历是根据计算

第二种方法是在一个比色法技术使用解决方案组成(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium) MTS和吩嗪ethosulfate (PES)作为电子偶联剂。这个试验是使用CellTiter执行96®水一个解细胞增殖装备,20μL MTS / PES的稳定的解决方案是添加到细胞系文化井,然后允许孵化2 h的37°C。细胞生存能力评估使用Multiskan FC微型板块光度计热费希尔科学,吸光度的测量在490 nm确定可行的细胞总数的文化吸光度值直接与这个总数成正比。

2.7。统计分析

的统计分析研究了单向方差分析(方差分析)确定的重要性水平 。GraphPad棱镜v6.0计划是用于分析的实验数据进行了一式三份,表示为 。

3所示。结果与讨论

3.1。表征Cs-Al NDs

扫描电子显微镜(SEM)图像如图1(一)和1 (b)确定的形态特征as-synthesized Cs-Al二重唱。集聚可以观察到自盘是冻干之前,但磁盘仍然可以看到明显的形状如SEM图像如图所示1 (b)(19]。的纳米颗粒被成功合成更多的磁盘比通常的球形或常见的结构形状,呈现常规和表面光滑但宽尺寸范围,这可以归因于许多因素如生物聚合物浓度和静电相互作用,发生在ionotropic凝胶使用三聚磷酸钠(STPP)作为一个高度紧张的化合物20.,21]。壳聚糖和海藻酸导致的自发的聚集和形成聚离子复合物通过羧基和胺组的相互作用在结构的聚合物,分别为(22]。此外,静电相互作用有助于形成聚电解质复合物通过使用交联剂如STPP,导致交联和取向的纳米颗粒在增长23- - - - - -25]。一些报道表明,几个参数的变化等壳聚糖和海藻酸的浓度和重量比,以及pH值的解决方案和添加顺序,可以极大地影响最终的纳米颗粒的大小和形状,甚至可以是异构的结构或同质(22]。Wasupalli时发现,平衡pH值的解决方案和强大的静电相互作用导致纳米纤维的形成,而较弱的相互作用往往会形成nanocolloids [22]。其他报告由Jeddi和Mahkam Nalini等人显示使用壳聚糖纳米棒的形成,海藻酸,和一个高度紧张的代理,也证实了强烈的静电相互作用是工作之间的交联聚合物,这是符合这一研究获得的结果(26,27]。此外,密集的存在和凝聚Cs-Al NDs图1(一)可以很容易地与胺的可用性和羧基官能团产生强烈的静电相互作用表面(28]。这种行为也可以观察到颗粒大小分布如图2。

壳聚糖/海藻酸重量比和pH值的解盘分布起到重要作用等物理性质的水动力大小,聚集,多分散性(29日]。根据直方图,粒度分布是影响PBS溶液的pH值,表明不同的反应在酸性和碱性介质。Cs-Al NDs粒径的增加显著如图1.2 pH值2(一个),获得水动力平均直径 ,可与壳聚糖分子结构的崩溃由于去质子化胺表面官能团和分子间氢键的形成在凝胶过程中(30.]。水动力相比平均直径Cs-Al NDs在PBS溶液pH值7.4,下降 观察图2 (b),表明在中性ph稳定性好从STPP钾离子的存在似乎是一个非常重要的因素在nanodisk形状的形成,主要集聚的迅速增加和粒子的大小由致密膜壳聚糖表面的纳米盘(31日,32]。这些结果的粒度分布和水动力大小上面报告的扫描电镜图像是一致的和一致的结果在文献中报道的合成壳聚糖/海藻酸凝胶纳米粒子通过ionotropic [6,33]。

相关信息的化学结构Cs-Al NDs准备使用STTP ionotropic凝胶剂图所示3。频谱显示了标本,确定不同官能团的振动。宽带3370至2950厘米¹对应于h和s伸展地振动,分别代表脂肪伯胺和酒精组(34,35]。峰值为2874厘米¹证实脂肪族碳氢键的存在拉伸(36,37]。N-acetylglucosamine决定了可能的变形Cs-Al胺和磷酸基的相互作用,这可以证明存在的在1592年达到顶峰,1529厘米¹,以及峰值为1407厘米¹指示一个甲基的反对称变形由于静电作用与STTP [37- - - - - -39]。海藻酸的存在可以证明的伸缩振动羧酸在1382,1214,1027厘米¹(36,40]。高峰在1306、1129、1065和891厘米¹与叔酰胺集团C-O-C糖苷键,切断伸缩振动,和C-O-C伸缩振动(36,37]。波数范围790 - 440 cm - 1是由于官能团之间的静电相互作用的壳聚糖和STTP,可以被描述为一个派生的联系- h对称振动(38]。

的结晶度和Cs-Al NDs是评估通过使用x射线衍射(XRD)技术。衍射模式如图4,证明了特征峰对应于壳聚糖和海藻酸聚合物。山峰在9日和19°证实壳聚糖的存在在纳米盘的结构和之间的氢键的形成是由于壳聚糖的氨基和羟基和稀释在醋酸,分别为(23),而峰12°也广泛峰从35°对应海藻酸的存在(14,29日,41]。强烈的峰值是观察到23°表明Cs-Al NDs的存在,可以推断,海藻酸是影响壳聚糖的结晶性质通过氢键和静电相互作用和负面的正电荷,证实了聚电解质复合物的形成采用离子凝胶法(14,23,42]。这些结果与文献中报道的,协议允许声明Cs-Al NDs高结晶度,强烈的静电相互作用,良好的微晶19]。Cs-Al NDs的微晶尺寸计算是1.6 nm的峰值强度最强的23°,根据以下粉末方程(1): 在哪里(nm)是微晶尺寸,谢勒常数(0.94),( )x射线波长,的应用,rad)是半宽度,和(rad)是布喇格衍射角。

3.2。封装疗效和在体外药物释放

Cs-Al NDs的阿莫西林封装效率计算从上层的一式三份,给的效率 。这一结果表明,这些纳米盘是一个合适的材料成功地装载了阿莫西林,与其他文献的报道结果一致壳聚糖/海藻酸纳米粒(36,40,43]。STPP交联剂的存在影响封装效率特性由于壳聚糖/ alginate-TPP复杂的形成产生羧基和氨基官能团之间的静电相互作用的壳聚糖和阿莫西林,增加阿莫西林在Cs-Al NDs的加载44]。然而,封装效率是增加在集聚ionotropic凝胶如图1,预计减少表面积纳米盘的可用性,导致聚合物基质中药物的饱和负荷(36,45]。

的在体外释放的阿莫西林Cs-Al NDs是在PBS溶液pH值1.2和7.4,并监控作为时间的函数,如图5。封装药物释放曲线,显示是相当高的,获得了最多8 h内释放量在pH值1.2和7.4 52.3%和63.2,分别。累积阿莫西林有两个阶段释放Cs-Al NDs的pH值,在最初释放迅速增加,不断在第一2 h(破裂效应)由于有限的药物分布到表面,然后在接下来的6 h,释放略微下降,变得更加稳定(46,47]。从而释放概要Cs-Al NDs的阿莫西林胶囊是可持续的,这是一个重要的因素在减少肝毒性影响和破坏健康的细胞抗癌药物运载系统(27,48]。

虽然也观察到类似的结果对pH值条件下,Cs-Al NDs pH值在7.4内最好的释放封装药物8 h,这表明Cs-Al NDs可以有能力去把握和阿莫西林的控释能力。因此,这些结果可以被认为是积极的,因为长期的药物输送系统更适合抗癌治疗,由于低肝毒性药物浓度控制,并减少剂量需要作为一个经济和治疗的优势49]。这长时间和减少剂量pH值7.4可能归因于官能团之间的静电相互作用的壳聚糖/ alginate-STPP复杂,药物,提供良好的pH敏感性使Cs-Al NDs的控释能力(50,51]。相反,更快的释放在pH值1.2可以找到相关的高溶解度和肿胀Cs-Al NDs的能力,因为有复杂结构的改变可能由于羧基的质子化作用和胺组削弱与STPP,从而减少了π- - - - - -π阿莫西林和Cs-Al NDs结构之间的相互作用51,52]。结果显示,部分释放的观察阿莫西林这可能是由于一个事实,即纳米盘测试期间的退化很低。然而,更大的降解聚合物框架发生的盘接触到酸性pH值,指示的扩散阿莫西林由于高分子链松弛,这些结果是在协议与文献报道36,53]。

3.3。在体外细胞毒性评估

台盼蓝和CellTiter 96®水测试进行评估使用不同浓度的细胞毒性(10、25、50μg / mL) Cs-Al NDs的两个细胞系,PWR-1E曲泽。根据两种方法的结果如图6(一)- - - - - -6 (d)和7(一)- - - - - -7 (d),没有明显的毒性观察细胞系提供一个可行性的80%以上,这是符合生物材料的细胞毒性要求应用在药物输送系统(50,51]。虽然生存能力略有降低Cs-Al NDs的暴露浓度增加时,就像观察到的主要人物7(一)和7 (c)PWR-1E细胞的高百分比对应no-cytotoxic效果表明没有损害引起的细胞膜(2),让他们正常生长由于良好的生物相容性的壳聚糖和海藻酸生物聚合物(54]。

之间的差异观察正常细胞和腺癌文化如图6和7可以推断,Cs-Al NDs关于腺癌的细胞提供了更好的生物相容性,考虑他们适合应用于癌症治疗的人们提供药物。然而,细胞生存能力会增加暴露在72 h时,表明最终细胞保持增长由于生物相容性的改善,提升为一种积极的特点而言,长期给药(21),这是细胞腺癌的情况相反。的结果,同样重要的是要考虑到增加Cs-Al NDs浓度可能影响负面细胞生存能力,观察治疗使用50μg / mL导致轻微的居住由于诱导氧化应激在细胞或细胞系细胞膜的变化,以及诱导损伤的DNA (1,55,56]。这些结果与结果定量协议在文献中报道,获得了低增长抑制使用类似的纳米材料合成与壳聚糖和海藻酸细胞毒性评估生物聚合物(13,14,57]。

虽然台盼蓝法的结果表明高细胞生存能力获得的相比使用CellTiter 96®水方法,用台盼蓝报告显示不准确。因此,这些结果从CellTiter 96®水方法更加可靠和观察到的细胞毒性模式似乎与其他报告、协议中更高浓度的纳米粒子产生负面影响的主要原因是细胞生存能力(58]。在这些报告中,使用海藻酸/壳聚糖和其他类型的人们对不同细胞有关,和结果显示一个类似的趋势,细胞生存能力的差异可能是由于选择性没有歧视对正常和癌变细胞(1,36,40,59]。

4所示。结论

我们报告一个灵巧的策略合成chitosan-alginate盘(Cs-Al NDs)使用ionotropic凝胶法和三聚磷酸钠(STPP)作为一个高度紧张的代理。我们观察到胺组的电荷之间的相互作用的壳聚糖和海藻酸的羧基,推广的一些化学结构退化然后磷酸盐的静电相互作用,形成的纳米盘被报道的扫描电镜图像。鉴定结果证实,Cs-Al NDs和定期高结晶取向聚合物之间的强相互作用。我们还发现,水动力大小增加时,纳米盘暴露在酸性环境中,破裂释放的药物由于肿胀行为可能发生在pH值1.2。因此,在一个基本环境,nanodisk礼物小的水动力大小,表明一个更美好、更可控释放阿莫西林。这些Cs-Al NDs显示高细胞生存能力80%以上暴露48和72 h时,考虑到可行性可能增加由于高生物相容性的纳米盘,这代表一个有效的医疗和医药应用,纳米材料,也证明是一个新平台为进一步深入研究涉及不同的药物和细胞系,以及在活的有机体内测试。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢行政部门科学、技术和创新(在西班牙被称为Colciencias)提供的金融支持年轻的研究人员计划。这项工作用的研究、创新和发展的材料中心(在西班牙被称为CIDEMAT),这是支持通过显微镜安蒂奥基亚省大学实验室。作者要感谢的支持的卡塔赫纳大学合格的人力资源和设施发展的实验。作者还要感谢大学的博士学位工程项目de卡塔赫纳的支持大卫Patino-Ruiz博士训练的。

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