文摘
Rhizobial固氮细菌的主要居民是豆科植物的根瘤。研究豆科植物根瘤细菌社区的最重要的是了解植物生长和营养需求。培养技术被用来研究这些地下器官的细菌群落豇豆属subterraneal . Verdc(班巴拉族螺母),充分利用豆类在非洲,对促进植物生长特征。在这项研究中,班巴拉族坚果种植陷阱根瘤细菌,细菌形态,生化反应和分子特征。五个选择分离筛选在体外促进植物生长特征和表现出他们的表型性状的差异。聚合酶链反应(PCR)产品受到部分16 s rRNA基因测序进行系统发育分析。基于16 s rRNA基因序列,隔离标识为BA1 (Stenotrophomonas maltophilia)、媒体(Chryseobacteriumsp),把(假单胞菌产碱杆菌属),BA4 (假单胞菌plecoglossicida)和BA5 (假单胞菌hibiscicola)。结果表明,四种菌可产生IAA。能力在Pikovskaya磷酸溶解琼脂板正显示四个隔离(BA4 BA2, BA3, BA5)。三个分离株能产生氰化氢隔离BA1, BA3, BA4, BA5发现合成氨生产特征。结果表明这些植物刺激隔离可以用作植物生长菌剂和生产力。
1。介绍
班巴拉族坚果仍被忽视和未被充分利用的作物之一,在非洲,在小农主要种植它们。文化和传统实践维护这些作物,但研究和保护仍然存在不足和被忽视的特点。他们的潜在价值被低估,充分利用由于缺乏关注(1]。充分利用和被忽视的作物物种是营养丰富;因此,他们的流失会影响穷人的营养状况和粮食安全。增强的使用可以帮助对抗隐性饥饿和改善营养1]。
农村穷人依靠班巴拉族螺母为食品安全、营养和创收。与非洲人口在增加,有必要确保廉价的食物。豇豆属subterraneal . Verdc。(班巴拉族花生)是第三个最重要的食品豆类落花生hypogea(花生),豇豆属unguiculata(豇豆)在非洲2]。班巴拉族等豆类,坚果,扮演了重要的角色在对抗营养不良(3]。班巴拉族坚果拥有粗蛋白含量高(22和37%之间4,5]。由于其高赖氨酸和蛋氨酸含量,它提供了一个重要蛋白质的供应,特别是对于农村和城市居民无法负担昂贵的动物蛋白。潜在的被忽视和未被充分利用的作物如班巴拉族坚果可以用来解决非洲大陆的粮食短缺6]。因此,有必要增加班巴拉族螺母消费和知识水平,在许多发展中国家目前过低。
植物和微生物进化利用他们的亲密关系。植物微生物决定植物健康和生产力。phytomicrobiome含有各种各样的细菌和真菌微生物在植物的所有部分,特别是根(7]。这些生物体必需的营养转变成可用的形式由植物,植物可以吸收各种各样的化学物质释放到根际,叫做渗出液,调解植物和微生物之间的相互作用(8,9]。病原体耐药性,保水性,这种激素的分泌是好处phytomicrobiome赋予植物有益。植物的微生物群落植物基因型,不同植物器官、植物生长阶段,和位置(9]。
最近的进步undersatanding phytomicrobiome emplyoyed的刺激植物生长的机制和发展预计将继续增长10]。原生动物内的细菌称为根瘤菌属植物组织转换大气氮氨的高度专业化的微生物群落中发现的豆科植物的根瘤7]。根瘤菌不同方法有节。虽然有些人只能结瘤某些植物物种,包括nonlegume植物,其他人可以结瘤各种植物物种。根瘤菌是一组基因不同的微生物。他们合作解决大气氮过程称为共生固氮作用[11]。除了根瘤菌固氮,有不同类型的nonrhizobial细菌中发现这个生态位参与多种生物活性,如生物防除和刺激的植物发展(11]。发现菌株与强rhizobium-legume协会提高农业生产率需要根瘤菌的隔离和表征,这是一个丰富的生物资源。Rhizobial细菌增加植物生产力和经济增长产生的各种化合物。因此,一个完整的理解生物学的细菌在豆类结节是至关重要的。
班巴拉族螺母是完美的对农民的农作物,尤其是在边际土壤,因为它能产生高收益水平几乎没有输入。班巴拉族坚果的生产在南非已经在各种文献报道[8,12,13]。增加研究的促进植物生长的细菌(PGPB)在全球范围内,特别是在可持续农业,因为它们可以减少化肥的使用14]。基础和应用研究正在进行开发高效菌株可能用作植物生长促进剂达到目标作物产量和产量由于其对农业有利的影响。本研究的目的是识别和描述从根瘤细菌种类的班巴拉族坚果和他们在体外促进植物生长特征。
2。材料和方法
2.1。抽样网站和样本收集
根结节的班巴拉族螺母用于本研究从西北大学获得农业领域,Mahikeng,位于纬度年代25°49′35.1559”和经度25°36 E′39.2826”。20个健康的植物,没有任何可行的疾病的表现,被选作研究。在仔细去除根部周围的土壤,以免伤害他们,根自己退出。在无菌有拉链袋,根之后被运送到实验室和保持在−20°C。
2.2。细菌隔离
根结节都摇动了删除附加的土壤,在自来水和结节彻底洗干净。结节被表面消毒浸泡在70%乙醇10年代之前反复用无菌蒸馏水洗净。表面灭菌过程的有效性测试通过滚动surface-sterilized结节在营养琼脂(NA)前破碎分离根瘤菌的结节。同样的,一个100整除μl最后冲洗水的阶段是镀在NA盘子和检测污染物的增长。
借助无菌杵和臼,结节被碾碎成糊状后,去除表面的水滴。根瘤菌分离从根结节,表面消毒。渗出液从碎结节被镀在NA盘子和孵化28°C 48 h。可见殖民地亚文化在新鲜NA和孵化28°C 24 h获得纯粹的文化。
2.3。隔离的形态学和生物化学特征
形态学和生化测试进行的表征隔离使用标准方法和小型multitest识别系统API 20 e和API 20不检测组件(BioMerieux)根据制造商的指示。API 20 e和API 20 ne标准化生化试验鉴定和分化的家族成员肠杆菌科和nonfastidious,革兰氏阴性杆菌nonenteric(例如,不动杆菌,气单胞菌属假单胞菌),分别。
2.4。在体外为促进植物生长特征筛选分离
2.4.1。生产的氨
细菌分离株进行了测试使用蛋白胨水氨生产。新鲜的文化隔离细菌接种到蛋白胨水(10毫升)在管和孵化28°C 48 h。之后,0.5毫升的奈斯勒试剂添加到管中。积极的氨生产测试结果是棕色,黄色的变换(15]。
2.4.2。氰化氢(HCN)生产
新鲜的细菌培养筛选HCN生产如Lorck所述16]。隔离是生长在营养肉汤修订为4.4 g·L−1营养琼脂板的甘氨酸和条纹。板的顶部布满了无菌绘画纸滤纸。1被浸泡在2%的碳酸钠溶液和0.5%苦味酸。封口膜是用于密封板,然后在28°C的环境为4天。HCN代被绘画纸上的黄色滤纸把深棕色。
2.4.3。吲哚乙酸(IAA)生产
“金砖四国”等。17协议是用来测量IAA生产隔离。细菌培养(100μl)添加了营养肉汤(5毫升)补充色氨酸,0.1%的混合是在28°C的环境48 h。孵化后,细胞在10000转离心收获而10分钟。然后,Salkowski试剂(50毫升,35%高氯酸,1毫升0.5 FeCl3解决方案)是结合2毫升的上层清液,2滴10毫米正磷酸,4毫升Salkowski试剂。25分钟,混合物在室温下孵化。粉红色开发建议IAA生产。
2.4.4。磷酸溶解
通过发现10μl Pikovskaya每个细菌隔离的琼脂和孵化在28°C七天据Nautiyal [18),隔离的能力确定磷酸溶解。磷酸溶解分离的能力是存在明显的光环所示区域周围的文化。
2.5。细菌分离株的分子特征
提取的基因组DNA进行了使用锆土壤微生物DNA (Zymo研究)装备工具包中描述协议。16 s rRNA基因核苷酸序列测定PCR使用C1000热循环(BioRad、钙、美国)。fD1 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和rP2 (5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)引物被用于放大(19]。最后一卷25μl用于PCR反应,含有12.5μl 2×大师混合(Taq®热态启动快速加载,生物学实验室,英格兰),0.5μ每个引物l, 1μl DNA。热循环设置初始变性5分钟在94°C,紧随其后的是30周期30年代在94°C,退火为1分钟54°C,和扩展为2分钟72°C。PCR结果排序使用ABI棱镜®3500 xl DNA测序器(应用生物系统公司)Inqaba Biotechnical工业(企业)有限公司在比勒陀利亚,南非。分析了序列和编辑使用生物编辑[20.]。进化距离矩阵生成根据朱克斯和康托尔(21]。系统发育和分子进化分析大型版本5.2.2 [22),一种系发生树构造使用neighbor-joining方法(23]。引导分析使用1000复制neighbor-joining数据集。
3所示。结果与讨论
3.1。隔离和表征细菌隔离
五个细菌隔离孤立结节的班巴拉族坚果和进一步的特征。所有的细菌分离株革兰氏阴性和杆状,如表所示1。隔离不同的色素膏,橙色,黄色,白色。所有的隔离是过氧化氢酶阳性,而只有60%氧化酶是积极的。进一步进行生化测试API 20 e检测组件,它表明,五个分离株阳性柠檬酸利用率,水解明胶,丙酮生产(表2)。所有隔离-吲哚和H2年代生产。所有的隔离可以使用蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨糖醇为碳源。如上所述,Etesami [24),根瘤菌是革兰氏阴性细菌,它可以诱发结节豆类。这些生物体的能力改变大气氮豆科的主机,以换取碳是有据可查的。类的成员alphaproteobacteria属根瘤菌,Ensifer, Phyllobacterium, Allorhizobium, Bradyrhizobium, Devosia, Azorhizobium, Microvirga大气氮转变成可用的结节的豆类植物的形式。
其他细菌物种(nodule-associated细菌)存在于豆类除了rhizobial的结节,参与不同的生物活性。拜耶林克(25)提供了最早的隔离账户芽孢杆菌物种从根结节。后来,研究基于应变隔离各种bacteria-outside透露了rhizobia-associated根结节。不动杆菌、芽孢杆菌、农杆菌属、小单孢菌属、肠杆菌、分枝杆菌,Pantoea,和假单胞菌物种组成的大多数nonrhizobial细菌生态位(26- - - - - -28]。研究结果表明,nonrhizobial细菌广泛分布和丰富的班巴拉族结节的坚果。有人建议,豆科植物的根瘤数可能开发一个利基,将允许nonrhizobial细菌生存和发展(29日]。当rhizobial细菌存在和感染,这些nonrhizobial菌株可以渗透豆科植物的根瘤24),这也许可以解释nonrhizobial细菌隔离在这个研究。在作物生产中,居民根瘤细菌增长至关重要,和生存的豆类及其交互结节内会影响植物的健康。
3.2。促进植物生长特征筛选
促进菌株筛选各种植物生长特征,如氨、HCN, IAA生产,磷酸溶解(表3)。隔离英航3、4和5是积极促进植物生长的测试,而BA1氨和IAA生产均阳性阳性只有磷酸溶解。尽管无法修复大气氮或产生有节,几个nonrhizobial细菌存在于豆科植物的根结节没有门的成员。变形菌门被发现拥有许多促进植物生长特性(24]。氰化氢,IAA、含铁细胞和1-aminocyclopropane-1-carboxylate脱氨酶生产磷酸盐溶解,抑制病原真菌的能力是这些特征的30.,31日]。
由于其显著的毒性和植物病原体、HCN已广泛应用于农业成生物药物。它也可以用于络合金属离子和间接帮助使磷酸可用于植物(32]。这是一个至关重要的生物防除特点为保护庄稼。它是一种植物性毒素的物质,防止关键代谢酶功能(33]。因此,有一个日益增长的兴趣在他们的作为生物防治剂。假单胞菌经常产生HCN [34]。PGPB的能力产生HCN,许多土著致病性真菌的生物控制的关键,是另一个关键特征(35]。创建高效菌剂对作物生产,关键是为PGR根瘤菌的分布特征和屏幕特征。氰化氢生产细菌隔离在这个研究可以增加对植物的营养供应,促进植物生长,减少病原体攻击的发生率。
促进植物生长的细菌是自然的潜在资源,殖民根源和直接或间接参与促进植物生长(36]。PGPB的使用豆类和nonlegume作物以来一直认为他们有增长潜力的刺激(37]。Bradyrhizobium菌株涂层对花生种子大大提高种子萌发、生物量、根瘤数量和鲜重,平均根瘤重量根据Deshwal et al。38]。
促进植物生长的植物激素IAA被认为改善幼苗生长,细胞分化,和根伸长39,40]。几个根瘤细菌生产IAA(已报告41- - - - - -43]。IAA合成色氨酸的构建块,和它的可用性提高IAA生产(44]。Indole-3-acetic酸是重要的在塑造根架构,如维管组织的分化,调控侧根的起始,向地性,和分生组织维护45,46]。在这项研究中,四个隔离Stenotrophomonas maltophilia,假单胞菌产碱杆菌属,p . plecoglossicida和p . hibiscicola被发现产生IAA。
磷是一个重要的养分在植物的生长47]。一类有益细菌被称为phosphate-solubilizing细菌可以水解有机和无机磷不溶性物质。磷酸盐的溶解是促进植物生长的一个重要机制。生物磷是植物能够通过磷酸酶分泌释放磷绑定在有机物和有机酸和螯合化合物的形成,帮助降低根际土壤pH值(48,49]。几个phosphate-solubilizing细菌从豆科植物的根瘤数记录50- - - - - -52]。四个五个孤立从这个研究可以溶解无机磷细菌物种。本研究表明,孤立的细菌可以磷酸溶解,提出与这些细菌郑伊健(53]制造至关重要的可溶性分数不同的磷酸盐矿物在土壤的植物生长。
单菌株rhizobacteria可以表现出多个PGP特征,基于筛查PGP-associated化合物(39,54]。然而,其影响是独一无二的,没有两个系统不同的土壤、植物基因型或结合rhizobacteria社区将展示相同的植物生长促进(55]。单一菌株不会有相同的有益的影响在两个不同的条件下,和紧张,不表现出任何PGP特征在体外不过可以刺激植物生长,反之亦然(56]。多项品质促进植物生长细菌是生物通过多种机制支持植物生长,而这些特征增加出苗率,活力,和产量(57]。这项研究有多个促进植物生长的细菌分离株的属性可以用于植物生长在边际土壤。
3.3。分子特性的隔离
确认每个细菌分离的菌株鉴定,用聚合酶链反应进行部分16 s rRNA基因测序。加入数字的序列存入基因库。使用爆炸从基因库核苷酸序列分析结果表4。基于不完整的16 s rRNA基因序列,图1显示了典型的neighbor-joining树物种和细菌隔离。根瘤各种属的细菌,如Stenotrophomonas Chryseobacterium,和假单胞菌用班巴拉族坚果,共生共存。这是演示了通过比较我们的16 s rRNA基因核苷酸序列与发表在NCBI基因库数据库(表4)。
4所示。结论
这项研究的结果表明,细菌分离株根瘤的班巴拉族坚果有各种PGPR活动。这些隔离可能适合使用菌剂来促进植物的发展。增长机制,有助于推广需要更好的理解。进一步研究PGPR领域的应用将帮助作用和改善农业生产,从而帮助解决营养不良和实现粮食安全。
数据可用性
每个隔离的序列已经沉积在NCBI数据库中加入数字KM882602(下美国maltophilia),KM882603 (Chryseobacteriumsp), KM882604 (p .产碱杆菌属),KM882605 (p . plecoglossicida)和KM882606 (p . hibiscicola)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
ASA承认西北大学博士后奖学金奖。OOB要感谢国家研究基金会赠款,支持研究南非,在她的实验室。这项研究是由美国国家研究基金会资助,南非,格兰特UID91990号和UID86625。