文摘

血液是一种珍贵的生物液体通常是无菌的。因此,细菌在血液中先天异常显示。一个血培养系统执行诊断菌血症的原因。的确,一个病人在我们的服务有一个重型地中海贫血和接受genoidentical移植。然后,进行血液测试来诊断为期四天的发热。在这种背景下,我们有孤立的应变Marseille-Q2617从血液样本。它揭示了一个新的属于属的菌株链球菌。它是一种革兰氏阳性球菌、不动的、nonspore形成。主要的脂肪酸发现棕榈酸,49.5%。分类方法被用来描述应变通过研究他们的表型,系统发育和基因特征。此外,16 s rRNA基因的序列分析表明,应变Marseille-Q2617有99.94%相似序列链球菌。平均核苷酸为应变Marseille-Q2617身份(ANI)分析T显示相似度最高的92.9%美国缓和的。dna dna杂交获得的价值(50.2%)和应变Marseille-Q2607之间美国缓和的最亲密相关的物种,低于推荐的阈值(< 70%)。应变Marseille-Q2617T基因组大小2.02 Mbp 40.5摩尔% G + C含量。基于这些结果,我们提出一种新的属链球菌,这个名字链球菌thalassemiaeMarseille-Q2617 sp. 11月T(= CSUR Q2617 =摄影30109)。

1。介绍

共生的菌群链球菌最常见的皮肤和上呼吸道(1]。然而,许多链球菌最为入侵细菌组和显示为机会致病菌在某些感染(1]。这些高致病性物种等链球菌agalactiae,美国gallolyticus,肺炎链球菌参与脑膜炎、心内膜炎和肺炎病理(2]。

链球菌是一个重要的细菌属目前包括110儿童类群与发表的有效和正确的名称(https://lpsn.dsmz.de/genus/streptococcus)。以前根据溶血模式分为三类(溶血性、beta-hemolytic nonhemolytic或gamma-hemolytic),链球菌目前分为六组的物种基于16 s rRNA基因序列的系统研究:化脓性,anginosus,轻的,唾液链球菌,宝,变形链球菌(3,4]。

如今,一般使用matrix-assisted解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在临床和研究环境,再加上新一代测序技术的快速发展,给了我们一个新的和更全面的了解分类法。因此,我们使用一个分类方法描述(5)提供的完整描述这种新细菌物种。因此,基于形态、表型、生化、系统,和基因功能,链球菌thalassemiaesp. 11月,提出了应变Marseille-Q2617属的新成员链球菌。

2。材料和方法

2.1。生物分离和收集

的上下文中传染病的病原学调查,血培养结果的样本取自地中海IHU感染病人住院。应变Marseille-Q2617是唯一一个孤立的菌株从病人主要的地中海贫血。他在发烧(38.5°C)的第四天genoidentical移植时血液了。

2.2。识别的应变MALDI-TOF女士和16 s rRNA基因测序

殖民地被首次发现使用MALDI-TOF女士在LT Microflex光谱仪(力量Daltonics,不来梅,德国)所描述的(6]。获得的光谱被导入到MALDI生物型3.0软件(力量Daltonics)和匹配数据库中的引用(力量数据库增加引用(在实验室https://www.mediterranee-infection.com/acces-ressources/base-de-donnees/urms-data-base/2021年2月,访问)。结果分数启用(或未启用)的识别测试物种:殖民地贴上正确识别在物种水平得分≥2,在属级得分≥1.7。身份不明的物种(得分< 1.7)使用MALDI-TOF女士被确定使用16 s rRNA的桑格测序基因。16 s rRNA基因是使用通用引物对细菌放大fD1和rP27)(Eurogentec、激怒、法国),以及由此产生的扩增子测序使用大染料®终结者v1.1循环测序工具和3500 xl基因分析仪毛细管测序仪(ThermoFisher、Saint-Aubin、法国),所述[8]。序列对齐使用缺省参数的肌肉,和系统发育推断得到使用最大似然法和大型X软件(9]。引导重复分析获得的值来生成一个1000倍多数共识树的节点表示。巴尔通氏体属昆塔纳作为外群。

2.3。生理和生化分类特征
2.3.1。生长条件

确定最优条件应变Marseille-Q2617,几个测试执行:pH值、温度、盐度和大气。他们种植在哥伦比亚琼脂5%绵羊血液(bioMerieux、马西l 'Etoile、法国),在不同的温度下孵化(28°C, 37°C, 42°C, 56°C)和不同大气压(有氧、无氧和微量需氧的)如前所述[10]。七个小灵通测试:5.0;5.5;6.0;6.5;7.0;7.5,8。此外,应变Marseille-P2915T测试其耐盐碱的哥伦比亚使用一系列盐琼脂浓度:10%,15%,20%,25%。

2.3.2。生化、孢子形成和活性测试

使用API ZYM生化基质进行测试(酶的活动),50 API CH(碳水化合物发酵),和API 20喉炎的症状(具体标准)画廊。我们还进行了使用热冲击形成孢子的能力。运动试验是由直接使用DM 1000光学显微镜检查新的殖民地(徕卡、南特、法国)×400放大。检测过氧化氢酶(bioMerieux)和氧化酶活动(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)也进行测试。

2.3.3。抗生素敏感性

对抗生素的敏感性测试用哥伦比亚琼脂5%绵羊血液(bioMerieux、马西l 'Etoile、法国),根据2015年EUCAST推荐(https://www.eucast.org)作为描述Elsawi et al。11]。以下抗生素进行了测试:青霉素G,阿莫西林,daptomycin、环丙沙星、头孢他啶、头孢曲松钠、克林霉素、强力霉素、磷霉素、imipenem, linezolid,新青二、利福平、teicoplanin、妥布霉素、甲氧苄氨嘧啶高磺胺甲恶唑和万古霉素使用基线测试®(bioMerieux、马西l 'Etoile、法国)。

2.3.4。电子显微镜

菌株的形态学与日立可视化SU5000扫描电子显微镜(Krefeld日立集团、德国)。殖民地从琼脂和悬浮在检索2.5%戊二醛固定剂的解决方案。一滴暂停然后直接沉积在poly-L-lysine涂布滑了五分钟,接受1%磷钨酸溶液(pH值2.0)两分钟增加扫描电子显微摄影(SEM)图像对比。的下滑是洗水,风干,检查使用桌面SU5000显微镜(日本日立高科技、遗传性出血性毛细血管扩张症)。酒吧和收购规模设置在显微照片所示。

2.3.5。细胞脂肪酸组成

细胞脂肪酸甲酯(名声)分析了使用气相色谱/质谱(GC / MS)。几个文化板块刮获得大约50毫克每管的细菌生物量。饥饿是准备根据震荡波的协议(12),之后进行了GC / MS分析如前所述[13]。样品准备好了大约15毫克每管的细菌生物量收获从几个文化板块。短暂,脂肪酸甲基酯分离使用精英5 ms列和监控由质谱(500 - 8平方年代来说,珀金埃尔默,Courtaboeuf,法国)。光谱数据库搜索使用搜索女士2.0执行操作与标准参考数据库1(美国马里兰州盖瑟斯堡NIST)和饥饿质量光谱数据库(威利,奇切斯特,英国)。

2.4。基因组装配和分析

提取的总DNA基因组应变Marseille-Q2617和测序如前所述14]。3.10.1黑桃版本软件(15)是用于组装基因组读取。映射从MiSeq读取恢复和奴才技术进行了应变Marseille-Q2617使用CLC genomics7 (https://www.qiagenbioinformatics.com/products/)。基因组1.13.3应变与Prokka带注释的版本,可在银河澳大利亚在线服务器(https://usegalaxy-au.github.io/)。GCview软件(16)是用于基因组可视化。数字比较基因组dna dna杂交(dDDH)是genome-to-genome距离计算器在线计算工具,版本3.0 (17]。此外,平均核苷酸身份估计使用平均核苷酸同源身份工具(OAT) [18]。

3所示。结果与讨论

3.1。系统发育分析

光谱被添加到本地Microflex数据库允许未来识别使用MALDI-TOF女士基于16 s rRNA基因的系统发育树强调Marseille-Q2617应变的位置与所有相关的链球菌物种的名字已经正当地发表在《LPSN呈现在图1。


图1
种系发生树突出的位置链球菌thalassemiaesp. 11月,应变Marseille-Q2617关于其他物种密切相关。加入基因库的16 s rRNA基因序列在括号表示。使用肌肉使用默认参数序列是一致的。系统发育推断得到使用最大似然法和大型X软件(9]。引导重复分析获得的值来生成一个1000倍多数共识树的节点表示。巴尔通氏体属昆塔纳作为外群。酒吧规模代表了2%的核苷酸序列差异。

Nonidentification MALDI-TOF菌株的质谱带我们进行额外的分析。目前,16 s rRNA基因无法区分链球菌菌株和多相方法应采用(19,20.]。BLASTn NCBI上进行了DNA数据库的序列16 s rRNA基因,和应变Marseille-Q2617显示99.84%的序列相似性链球菌写明ATCC 49456 (NR_116207.1)。事实上,序列相似性值16 s rRNA基因的获得非常高阈值相比建议划定物种屏障(21]。相比之下,系统树构建大型X软件(9)基于五个连接基因(rpoB gyrA ddl,国民幸福指数,和苏打水)序列显示不同位置的压力。比较的系统发育分析推导出连接基因位置应变在链球菌中属于轻的进化枝(4]和清楚的表明,它是有别于其他人(图2)。基于这些系统发育分析,我们建议Marseille-Q2617属的新成员链球菌。


图2
基于五种系发生树连接基因等GyrA,ddl,国民幸福指数,rpoB,苏打水和建造大型X软件。使用肌肉然后序列对齐。引导重复分析获得的值来生成一个1000倍多数共识所示在节点树。只有引导显示值在75%以上。不同物种的全基因组序列研究从NCBI数据库中检索。然后加注Prokka软件。目标基因从基因组中提取和与浮雕联盟服务器连接(https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/union)。这棵树是按照分类的帕特尔和古普塔(4)和显示分离的物种演化支。
3.2。表型的描述

应变Marseille-Q2617是兼性厌氧菌生长在有氧和厌氧条件下在28日至42°C,但没有增长56°C。这个菌株的最佳生长观察到37°C 24小时后在有氧条件下孵化。革兰氏阳性细菌细胞,分果爿的,不动的,nonspore形成。细菌细胞的形态与扫描电镜显示。它显示连锁结构典型的链球菌(图3)。增长了pH值测试(5.0;5.5;6.0;6.5和7.0;和7.5和8)。盐度测试,没有增长记录。


图3
透射电子显微镜法链球菌thalassemiaesp. 11月在日立SU5000透射电子显微镜观察细胞。尺度和放大显示在图中。

API画廊的结果揭示了应变Marseille-Q2617的生化特征。因此,对于API ZYM,获得的积极反应是酯酶(C4) naphthol-AS-BI-phosphohydrolase和亮氨酸arylamidase,酯酶和脂肪酶(C8)。50一个API CH地带显示应变Marseille-Q2617 N-acetyl-glucosamine阳性,七叶灵枸橼酸铁,D-galactose, D-sucrose D-tagatose, 5-ketogluconate钾。使用API喉炎带产生了积极的反应以下测试:丙酮酸钠、马尿酸、七叶灵枸橼酸铁,pyroglutamicß-naphthylamide酸,L-leucine -ß-naphthylamide、精氨酸和D-lactose起源(牛)和淀粉。的主要表型特征应变Marseille-Q2617比较密切相关的物种(表1)。基线测试®(bioMerieux、马西l 'Etoile、法国)用于确定抗生素的最低抑制浓度(MIC),表明应变Marseille-Q2617容易青霉素G,阿莫西林,daptomycin、环丙沙星、头孢曲松钠、克林霉素、强力霉素、磷霉素、imipenem, linezolid,新青二、利福平、和teicoplanin但耐头孢他啶和甲氧苄氨嘧啶的磺胺甲恶唑。棕榈酸(49.5%)是主要的脂肪酸检测Marseille-Q2617(表2)。

表1
微分表型主要标准。
表2
细胞脂肪酸(%)。
3.3。基因组功能

基因组大小应变Marseille-Q2617 2.02草案Mbp长,40.5 mol % G + C含量。菌株的基因组Marseille-Q2617由5叠连群,拥有1 949个预测基因74 1 779个蛋白编码基因和类似RNA基因(12 rrna, 59转运RNA和3其他RNA)。总共96假基因被检测到。图形的圆形图草案的基因组Marseille-Q2617呈现在图4。


图4
图形化循环的基因组地图链球菌thalassemiaesp. 11月Marseille-Q2617获得通过使用CGView服务器。

DDH和OrthoANI值低于阈值获得推荐分类原核生物(22,23]。DDH值之间基因组分析变化从22.6%(后获得链球菌oralis和链球菌chenjunshii)到58.6%(之间链球菌引起的肺炎和链球菌pseudopneumoniae)。应变Marseille-Q2617共享DDH值最高(55.4%)链球菌pseudopneumoniae(表3)。此外,链球菌物种研究,基因组分析基于平均核苷酸身份(ANI)表明,OrthoANI值范围从69.3% (美国chenjunshii和肺炎链球菌)到94.7% (肺炎链球菌和美国pseudopneumoniae)。事实上,应变Marseille-Q2617T共享OrthoANI最低(69.6%)与应变值美国chenjunshii。此外,应变Marseille-Q2617 OrthoANI值最高为94.1%。

表3
双基因序列比较Marseille-Q2617最密切相关的链球菌物种。

4所示。结论

基于系统发育、基因和表型特异性提供应变Marseille-Q2617已知物种中属于他们独特的标准链球菌属,我们建议,他们被认为是小说的物种,命名链球菌thalassemiaesp. 11月。

5。的描述链球菌thalassemiaesp. 11月

链球菌thalassemiae(tha.las.se 'mi.ae。N.L.将军n . thalassemiae参照菌株的分离从地中海贫血患者)。它是一种革兰氏阳性球菌细菌,不动的,nonspore形成。增长了25°C和42°C之间,与最优增长在37°C。菌株的生长Marseille-Q2617观察在不同pH值(从5.0到8.0)和盐浓度高达2.5%的氯化钠。细胞有一个直径1到4之间的不同µm:没有过氧化氢酶和氧化酶的活动。殖民地很小,点状的,淡灰色,平均直径为0.5毫米在血琼脂。应变Marseille-Q2617T展览积极反应对青霉素G,阿莫西林,daptomycin、环丙沙星、头孢曲松钠、克林霉素、强力霉素、磷霉素、imipenem, linezolid,新青二、利福平teicoplanin和新青二。C16:0(56.1%),C18:0(12.7%)和C18:1n9(11.5%)是主要的脂肪酸的细胞壁中发现链球菌thalassemiaesp. 11月。

草案Marseille-Q2617菌株的基因组T2.02 Mbp 40.5 mol % G + C含量。事实上,16 s rRNA和应变Marseille-Q2617基因组序列T存入基因库数据库下加入数字LR809138 CAHJXN010000000,分别。

的模式菌株链球菌thalassemiae是Marseille-Q2617 sp. 11月T(= CSUR Q2617 =摄影30109)和从一个孤立的主要地中海贫血。

数据可用性

16 s rRNA和基因组序列下的应变Marseille-Q2617T存入基因库数据库加入数字LR809138 CAHJXN010000000,分别

伦理批准

临床样本获得的诊断筛查。病人被告知可能的使用他们的样本为研究目的,在任何时候保留权利拒绝批准。根据法国Jarde法律(法律没有。2012年3月5日2012 - 300和2016 - 1537号法令2016年11月16日发表在《法兰西共和国的官方杂志),作为本研究不涉及具体的样本集合或从患者使用医疗/个人数据,无论是制度伦理批准还是个别病人同意需要非侵入性研究。本研究结果,经伦理委员会批准的IHU号码没有。2022 - 004。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

费托逃往Samba迪乌夫和Ibrahima瞧写了初稿,表现形式分析,获得数据。马马杜•贝耶Mapenda盖伊,Mariema萨尔,Babacar MBAYE, Stephane ALIBAR,格里高利DUBOURG参与数据收集。•LAGIER,逃往苏赫奈泉,逃往Ibrahima LO和Stephane ALIBAR修订初稿。Pierre-Edouard弗尔涅和佛罗伦萨FENOLLAR概念研究和编辑审核。所有作者阅读和批准了最终版本的手稿。

确认

作者感谢蛹卡普托提交基因组序列,Ludivine Brechard基因组测序,和尼古拉斯·阿姆斯特朗的分析脂肪酸。本研究支持的研究所Hospitalo-Universitaire地中海(IHU)感染,计划下的国家研究机构“Investissements d未来,”引用ANR-10-IAHU-03,该地区普罗旺斯阿尔卑斯蔚蓝海岸和欧洲资金费德普米族。