文摘
许多抗菌药物的有效性正在减少;因此,重要的是要寻找替代疗法。我们的研究进行了评估在体外antibiofilm活动使用微量滴定板试验,使用超描述生物活性化合物液相Chromatography-Diode阵列检测和液相色谱-光谱法和口服急性毒性测试的雄性sd大鼠中提取来自一种新颖的细菌Paenibacillus菌株139 si。我们的研究结果表明,粗提物及其三个确定化合物具有活性强antibiofilm对广泛的临床重要的病原体。确定了三个潜在的化合物包括抗生素的一种氨基酸8H20.N3O4253.237 P (MW),磷脂酶A2抑制剂C21H36O5(368.512 MW),和一个抗菌剂C14H11N3O2(253.260 MW)。急性毒性试验表明,所有大鼠死亡率很低,生化参数,血液,肝脏和肾脏组织病理学检查显示实验组之间没有显著差异。总的来说,我们的研究结果表明,提取和纯化化合物来自小说Paenibacillussp.无毒表现出强烈antibiofilm活动对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌,可以是有用的对新的治疗管理biofilm-associated感染。
1。介绍
目前许多抗菌药物的有效性,减少由于耐多药病原体的流行1]。这些病原体的新兴医学和医疗(仍然是一个严重的挑战2]。抗药机制之一是微生物细胞的形成的生物膜层附着在表面和胞外多糖的嵌入在一个矩阵3]。因此,重要的是要寻找替代疗法来控制biofilm-associated感染。虽然收到关注的几种植物性化合物治疗属性(4),只有少数据报道展览antibiofilm活动(5]。自然生态系统是微生物产生的丰富来源广泛的化合物表现出多样化和多才多艺的生物效应(6,7]。许多海洋和土壤微生物最近记录的有效antibiofilm属性对病原体(8- - - - - -10]。属Paenibacillus代表一个重要的土壤细菌组成的医疗、工业和农业的重要性(11]。兴趣Paenibacillus物种的新抗菌素的概率增加,发现小说antibiofilm化合物从这些菌株是有前途的2]。值得一提的是,奥巴马政府的抗菌药物和抗微生物剂的化合物在当地网站的一些感染一直是一个有用的方法来对抗微生物生物膜(12]。然而,长期坚持这些化合物在环境中可能引起对不属预定目标的生物毒性和耐药性微生物在生物膜(13]。此外,这些化合物可能表现出毒性作用即使在治疗剂量,使我们有必要测试他们在实验动物的毒性(14]。这方面的发展导致了更多的环境友好的化合物与问题。急性毒性是复合时产生的毒性管理在一个或多个剂量(24小时期间15]。这些研究通常是必要的任何化合物供人类使用和获得的信息从他们是有用的在确定器官毒性和选择安全的剂量(15]。急性研究的目标通常可以实现在啮齿动物使用小组的实验动物15]。因此,我们的研究进行了评估在体外antibiofilm活动,描述生物活性化合物和测试的急性毒性的雄性sd大鼠中提取来自小说的细菌种类的Paenibacillus菌株139 si。
2。材料和方法
2.1。细菌的分离
从接受扁桃腺切除术的患者临床细菌分离收集慢性和复发性扁桃体炎马来亚大学医疗中心(UMMC)医学伦理委员会批准(PPUM / UPP / 300/02/02参考号744.11)。参考菌株被使用金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923),铜绿假单胞菌(写明ATCC 27853)大肠杆菌(写明ATCC 25922) (16]。菌株139 si最初从当地的农业土壤被确认为孤立Paenibacillus通过16 s rRNA基因测序和沉积在美国文化集合类型(写明ATCC)编目号码(写明ATCC - baa - 2268) [17]。
2.2。实验动物
共有36个成年雄性和雌性的雄性SD (SD)中老鼠从动物护理单元获得中心(ACUC)医学院,马来亚大学。动物体重150 - 200通用和wire-bottomed都被关在笼子里温度在25°C,湿度50%,12小时光暗周期至少3天前的实验让他们适应环境的条件实验。动物是维持在标准的住房条件和自由获取标准饮食和水随意在实验。实验动物伦理委员会批准的协议(PM / 27/07/2010 / MAA (R))和所有的动物收到根据指南人道关怀的护理和使用实验动物(18)和控制动物实验的指导(CPCSEA) [19]。
2.3。的制备Paenibacillussp。浮在表面的游离
一个殖民地的文化Paenibacillus物种株139年如果是转入无菌脑心浸液肉汤(BHI) (BD Difco)其次是孵化37°C。我们有准备的生长曲线Paenibacillus139如果上层清液(提取)在三个不同的潜伏期后,24日,48和72小时。然而,只有72小时提取显示最高的活动比24和48小时。这是由于潜伏期越长,允许的最大生物活性代谢产物的分泌Paenibacillus139如果殖民地文化媒体。因此,只有72小时孵化提取用于我们的研究。的Paenibacillus然后提取无菌转移到50毫升锥形离心管底部(喷气Biofil)其次是离心8000 rpm在4°C 20分钟从上层清液分离细胞。当时获得的上层清液经过无菌过滤去除所有不必要的粒子使用注射器过滤器孔径为0.22μ米(Minisart缝匠肌)[20.]。获得浮在表面的游离然后冻干,溶解在超纯水(MilliQ,微孔)和存储在−20°C作为股票用于实验。为每个1毫克冻干浮在表面的粉,超纯水用于resuspend粉的数量是1毫升。
2.4。在体外Antibiofilm活动
评估的antibiofilm活动Paenibacillussp.菌株139 si提取和纯化化合物对临床重要的病原体,微量滴定板(MTP)测定进行了使用96 -平底聚苯乙烯浓度测定板如前所述[21,22]。每一个充满了100年μL无菌BHI肉汤和50μL在一夜之间文化对于每个临床病原分离增加150紧随其后μlPaenibacillussp.粗提取液和150年μL分别纯化化合物浓度为1000,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500μ在37°C g / mL孵化前24小时。孵化后,盘子被轻轻洗了三次磷酸盐和浮游细胞被丢弃,而弱附着细胞通过两轮彻底洗去离子水和允许在染色之前风干。200年附着生物膜被染色μL 0.4%的结晶紫的解决方案(w / v)10分钟。生物膜的光学密度(OD)为570 nm (OD570年)和微量滴定吸光度阅读器(iMark Bio-Rad) (23]。以弥补可能的增长率的差异在不同的培养条件下和/或菌株具有不同特点,遵循指数调整作为生物膜的密度的估计将与OD所产生的一种文化600年0.5 (24]。依从性指数的计算是根据以下公式:依从性指数=平均密度的生物膜(OD570年)0.5 / (OD意味着增长600年)。
2.5。生物膜的抑制浓度
为了确定菌株的最低浓度139 si提取能够导致生物膜的形成,明显抑制生物膜的抑制浓度(BIC)进行了测试使用6-well平底聚苯乙烯浓度测定板与一些修改(如前所述25]。一块玻璃盖片是放置在每个表面允许细菌分离株的生长和抑制形象化139 si提取生物膜形成的影响。每一个充满了300年μL无菌BHI肉汤接种150紧随其后μL在一夜之间文化的每个临床病原分离之后的150年μlPaenibacillussp.提取和150μL分别纯化化合物的浓度从1000年到4500年不等μ在37°C g / mL孵化前24小时。孵化后,生物膜抑制决心spectrophotometrically使用微量滴定吸光度读者(iMark Bio-Rad)和可视化显微镜下使用一个直立的光学显微镜(Eclipse LV150L,尼康)。
2.6。生物活性化合物的表征
的Paenibacillussp.浮在表面的游离受到了高效液相色谱法(HPLC)。简单,提取0.45解决方案是使用一个SRP-4过滤膜μm和注入高效液相色谱柱(安捷伦Zorbax XDB-C18, 4.6×250毫米,5.0μ在100米)μL注入体积流率为1.2毫升/分钟。标准的溶剂系统是乙腈和水的pH值3.55。此外,光谱范围是200 - 500纳米的紫外线吸收200,230,254,320海里。数据采集时间收益率介于0和32分钟共有32个分数(化合物)。进一步分析确定的化学结构的每个净化分数进行了使用超液相Chromatography-Diode阵列检测(UPLC-DAD)和液相色谱-光谱法(质)。一个Acquity UPLC系统(水公司)配备一个光敏二极管阵列检测器检测是用于分析和量化。UPLC-ESI-MS峰值识别记录使用UPLC系统加上LCQ十+质谱仪配备一个电喷射接口(Thermo-Finnigan公司)。的量化UPLC-DAD进行反相列Acquity UPLC本·C-18与1.7(2.1×50毫米)μ米的球形多孔颗粒。UPLC-ESI-MS分析是在积极的应急服务国际公司的经营模式和化合物被确定的基础上他们的紫外光谱和女士分裂模式通过搜索天然产品DVD的字典,版本20:2 (CRC出版社,泰勒和弗朗西斯集团)。
2.7。急性毒性过程
小说的毒性细菌种类的Paenibacillus菌株139 si测试使用LD在实验老鼠50如前所述(测试26]。急性毒性试验,选定的实验大鼠随机分为6组,每组六个老鼠如下:组1:生理盐水(5毫升/公斤,口服)每天14天对照组(男),组2:生理盐水(5毫升/公斤,口服)每天14天对照组(女),组3:139 si提取(5毫升/公斤,口服)的浓度(2通用/公斤)每天14天(男性低剂量组),组4:139 si提取(5毫升/公斤,口服)的浓度(2通用/公斤)每天14天(女低剂量组),集团5:139 si提取(5毫升/公斤,口服)的浓度(4通用/公斤)每天14天(男性高剂量组),集团6:139 si提取(5毫升/公斤,口服)的浓度(4通用/公斤)每天14天(男性高剂量组)。
所有动物的体重每天测量。死亡率、临床症状和发病的时间被记录下来。此外,总值一般观察观察的基础上行为迹象如食物摄入量、唾液分泌,肌肉无力,反应,立毛,呼吸(呼吸困难),痉挛,和运动的变化27]。所有的老鼠都牺牲了24小时后口服和隔夜空腹麻醉前肌内氯胺酮和甲苯噻嗪(1毫升100毫克/毫升甲苯噻嗪和9毫升100毫克/毫升氯胺酮)在剂量为0.1毫升/ 100通用的体重验尸紧随其后。收集血液样本,肝脏和肾脏是收获,在生理盐水洗,沾上污渍的滤纸,重。总检查是在盲目的方式进行检查的宏观异常器官相比,控制。此外,肝脏和肾脏是随后进行组织病理学评价研究微观异常器官相比,控制。
2.8。生化参数和血液学的概要文件
牺牲后,血液从颈静脉麻醉和样本收集,然后立即被称为大学的临床诊断实验室(CDL)马来医疗中心(UMMC)的评估和血液生化参数。收集血液生化参数,为黄色挥舞VACUETTE血栓活化剂。肝功能测试评估包括血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、共轭胆红素、碱性磷酸酶,丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶,g-glutamyltransferase。此外,肾脏功能测试评估包括钠、钾、氯、二氧化碳、阴离子间隙,尿素和肌酐。的血液,血液被收集到紫披斗篷的VACUETTE EDTA管和完整的血细胞计数(CDC)测试评估包括血红蛋白(HGB)、红细胞比容(HCT),红细胞(RBC),意思是血细胞比容(MCV),意思是微粒血红蛋白(妇幼保健),意思是微粒血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、白细胞(WBC)和血小板。此外,微分血细胞计数测试评估包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞。
2.9。组织病理学检查
牺牲后,胸腔打开通过腹膜,贯穿一个切除胸骨和肋骨是完全开放之后,肝脏和肾脏的集合。收集到的器官与10%中性缓冲福尔马林固定(NBF) 24小时,然后切成小块再固定NBF与另一个24小时。如前所述(执行组织病理学检查28]。短暂、固定组织嵌入石蜡使用嵌入中心(徕卡EG1160,徕卡生物系统),使用切片机切片(徕卡RM2135,徕卡生物系统)和固定在玻片使用水浴(徕卡HI1210,徕卡生物系统)。石蜡部分被苏木精和伊红染色(圆))染色安装与二苯基二甲苯(DPX)和可视化使用立式光学显微镜(Eclipse LV150L,尼康)。
2.10。统计分析
进行了统计分析使用统计产品与服务解决方案软件(IBM SPSS统计21)。分类数据的比较χ2在连续测试,未配对差异Mann-Whitney比较的数据测试和方差分析(方差分析)测试。所有的值被报告为标准误差(S.E.意思M±)和概率值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。在体外Antibiofilm活动
MTP粗提取液的化验结果Paenibacillussp.菌株139 si表明评估spectrophotometrically时能显著抑制生物膜的形成。最低和最有效的浓度,减少生物膜引起的依从性指数是4500年μ克/毫升。在所有32支粗提取液的纯化分数(化合物),只有3化合物显示最高antibiofilm活动选择对革兰氏阴性和革兰氏阳性临床分离株(表1和2),分别。此外,化合物5号(FR5)是最活跃的依从性显著降低指数相比其他化合物和控制。MTP化验的结果符合的BIC测试有一个80%的抑制生物膜在光学显微镜下可视化显示分散细菌细胞无细胞外基质。
3.2。表征潜在的化合物
描述的化合物的结果Paenibacillussp.提取使用高效液相色谱法显示共有32个纯化分数只有3分数antibiofilm展出活动在体外当评估spectrophotometrically (29日]。从这三个分数,总共3潜在化合物被确定的第一个化合物是亮氨酸2 - (hydroxymethoxyphosphinyl) 2-methylhydrazide分子量为253.237,分子式C8H20.N3O4P描述为一种氨基酸对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌抗生素的活动。第二个化合物是4-Hydroxy-5 -(羟甲基)3 (14-methylpentadecanoyl) tetronicacid-2 (5 h) -furanone分子量为368.512,分子式C21H36O5称为磷脂酶A2抑制剂。第三个化合物6 -(羟甲基)1-phenazinecarboxyamide分子量为253.260,分子式C14H11N3O2描述作为抗菌剂。
3.3。总值一般的观察实验大鼠
总值一般观测表明,实验老鼠增长相对稳定的利率。后14天口服摄入Paenibacillussp.提取、没有显著差异()之间的整体增长组除了高剂量组降低增长在过去两天的观察实验。这些结果表明,提取的14天急性口服摄入并不影响老鼠的重量。此外,有一个不规则的死亡率在两性存在剂量依赖的相关性,只有一个老鼠从每个性去世后72小时摄入高剂量(1 1 6 6雄性和雌性)。此外,观察到毒性症状包括轻微活动减退,食欲不振,换气过度,痉挛,头晕、流涎症;然而,他们无足轻重相比,控制。
3.4。血液生化参数和血液的状况
尽管小两性差异,生化参数显示的结果没有显著差异(在男性和女性之间的肝脏和肾脏功能测试(表3和4),分别。然而,球蛋白有水平升高,碱性磷酸酶,丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶,g-glutamyltransferase,钾、尿素和肌酐。此外,有水平的提高阴离子间隙中只雌性老鼠。总的来说,我们的结果表明,139 si提取没有可检测差异对肝脏和肾脏功能。此外,血液概要文件(表的结果5和6)没有显著差异()在完成和微分血细胞计数除了在红细胞(RBC)水平升高,白细胞(WBC),血小板,嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞尤其是高剂量组(4通用/公斤)。
3.5。组织病理学检查的器官
在肝脏和肾脏的组织学检查,器官显示正常的架构,没有颜色的变化,也没有形态的干扰。肝组织部分显示经常与不同的肝细胞,细胞结构正弦空间,和一个中央静脉。普通模式与普通薄壁组织和减少纤维隔膜和淋巴细胞浸润(图1)。总而言之,考试没有可检测不同组织的完整性在所有团体和139 si提取物对细胞结构没有影响,因此不会引起变性的细胞在这些特定的器官。
4所示。讨论
细菌在土壤是小说的潜在来源隔离antibiofilm化合物(30.]。据估计,在所有从土壤微生物分离,芽孢杆菌和Paenibacillus物种最常发现成员与抗菌素和antibiofilm活动(31日,32]。因此,该报告的种类的分类学的小说Paenibacillus菌株139 si antibiofilm活动并不奇怪。我们的研究表明广泛antibiofilm活动的发生在粗提物和三个确定化合物的提取从一本小说Paenibacillus139如果sp.应变。这些确定化合物包括抗生素的一种氨基酸,磷脂酶A2抑制剂、抗菌剂。据我们所知,还没有文献报道此类化合物的发现的此类活动Paenibacillus物种。具有生物活性化合物的影响结果的抑制生物膜的形成中所选的革兰氏阳性和革兰氏阴性隔离。这种广泛活动可能会有所帮助Paenibacillussp.在土壤环境中建立本身表面的植物根系和严重影响独特的细菌社区的发展。
之前报道,一些细菌的化合物如胞外多糖(EPS)可以参与antibiofilm活动。例如,海洋细菌的系统弧菌sp。QY101显示选择性或广谱antibiofilm活动(33]。然而,这项研究中描述的化合物的潜力与广泛的致病性和不致病的微生物表明这些化合物可能是强大的替代先前确定的化合物之一。基于这些发现,第一个化合物报道是一种氨基酸抗生素与亮氨酸2 - (hydroxymethoxyphosphinyl) 2-methylhydrazide有一个磷酸基,因此,它可以建议其电负性财产可能调节测试生物体的表面,这样有一个抑制细胞表面的附件。这是类似于之前的研究,据报道,确定多糖化合物可能会干扰细胞表面影响和信息交互的广泛的细菌分离株(13]。第二个化合物报道作为磷脂酶A2抑制剂与名字4-Hydroxy-5 -(羟甲基)3 (14-methylpentadecanoyl) tetronicacid-2 (5 h) -furanone也有类似的化学结构前面确定的群体感应拮抗剂(5 z) 4-bromo-5 - (bromomethylene) 3-butyl-2 (5 h) -furanone从海洋藻类Delisea pulchra据报道,抑制生物膜的形成在吗大肠杆菌没有抑制其增长(34]。第三个化合物报道这里作为抗菌剂的名字6 -(羟甲基)1-phenazinecarboxyamide可能修改的理化特征和外膜的架构biofilm-forming生物现象的观察一些抗生素之前报道(35]。在BIC测试,包括盖玻片的使用,逐渐减少的生物膜发展可视化的粗提取液的浓度增加Paenibacillus139如果sp.应变。
近年来,许多研究把重点放在了抗菌药物的急性毒性代谢物从不同的土壤微生物分离鉴定的目的的新来源生物活性化合物(36,37]。实验动物急性毒性研究是有用的提供主要数据支持单剂量安全和人类动力学(15]。在我们的研究中,antibiofilm口服急性毒性和复合特征的提取从一个新颖的细菌物种Paenibacillus菌株139 si在雄性SD大鼠(SD)中进行评估。在目前的研究中,总共36个老鼠被选12老鼠的男女在接受低剂量(2通用/公斤)和通过gastrogavage 12大鼠治疗高剂量(4通用/公斤)antibiofilm提取的细菌种类的小说Paenibacillus菌株139 si 4500的浓度μg / mL的持续时间14天。在啮齿动物,食物和水减少消费是一个重要的健康恶化的迹象通常导致体重的损失(38]。体重的变化也被用作药物和化学物质的影响的指标(39]。总的来说,毛将军观察表明,通过提取的影响不受性别和实验大鼠的死亡率很低。这些发现是类似于之前的研究中,一种新的化合物的影响从土壤细菌种类的小说链霉菌属研究了长埃文的老鼠没有不利影响的剂量300μg /鼠/天(27]。众所周知,肝脏和肾脏在各种新陈代谢过程中扮演重要角色。然而,如果需要太多这些器官的能力,他们的功能细胞最终将不利影响(40]。肝脏异型生物质函数中起着重要的作用,而肾脏是主要的器官参与药物消除(41]。此外,酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)通常是用作生物标记来预测可能的毒性在肝脏42]。因此,任何实质肝细胞受损将导致海拔在这两种酶(43]。在我们的研究中,高浓度的ALT和AST特别是在高剂量组(4通用/公斤)似乎表明,Paenibacillus提取了影响肝细胞的线粒体。然而,这似乎是一种急性和持久的反应,没有造成大的死亡率在实验小组。这是类似于以前研究的急性口服水植物提取的身兼艾诱导小鼠相同的男女双方微不足道的症状。此外,它被发现在雌性老鼠只有阴离子间隙水平增加。虽然这个结果的意义尚不清楚,确定阴离子间隙的浓度可能容易受到特定的错误如延迟处理血液样本收集后或发生特定的病理条件时像腹泻,最终会导致脱水,最终将导致一些肾功能的改变。造血系统是最敏感的指标之一有毒化合物(44];因此重要的是调查的效果Paenibacillussp.提取血液概要文件。我们的研究结果显示,没有明显差异(血细胞压积),意味着细胞血红蛋白浓度、血小板、红细胞和白细胞计数在所有实验的老鼠。血红蛋白和红细胞水平并不表明溶血性贫血和红血球增多症的影响,以减少和增加红细胞计数,血细胞压积,和血红蛋白,分别是不可能引发的提取。血小板水平尽管略有升高也不显著,表明提取也不影响血小板的产生或诱导血小板减少,后者通常是第一个药物毒性作用的证据在造血作用[40]。此外,白细胞的含量作为食腐动物,破坏微生物感染地点(45)也没有改变这表明提取也不是有毒leucopoiesis免疫系统并没有影响。总的来说,所有的结果表明,急性摄入的新奇物种的提取Paenibacillus菌株139如果没有改变我们的SD大鼠血液学的参数。在视觉的组织学检查肝脏和肾脏,提取的急性口服对这些器官没有副作用,这是良好的耐受性在研究期间的14天。因此,它被认为是材料应安全使用口服剂型在临床前和临床研究。细菌产生的生物活性化合物在自然环境中可能是几类化合物的混合物,可以是氨基酸、肽、核苷、生物碱、萜类、甾醇类、皂苷、多环(46]。很少有文献中的信息粗提物的毒性或致命水平属于属的细菌Paenibacillus。我们提取没有任何毒性对实验大鼠;更有可能的解释是,粗提物中的有毒物质非常低引起死亡。然而,一些老鼠确实死于摄入高剂量的提取。这可能是由于一个或多个高浓度的三个化合物UPLC-ESI-MS的特征。此外,我们的研究提出了以下问题。首先,虽然急性口服剂量的Paenibacillussp.提取没有产生任何重大不利影响的老鼠,进一步的研究可能需要使用更高剂量的特征化合物。其次,确认无毒提取及其衍生化合物的性质、土壤类型等各种因素的影响,细菌生长阶段,媒体类型的增长,和储存条件可能也需要调查。第三,提取的影响动物的繁殖能力和导致肿瘤需要评估。
总的来说,这项研究提供了初步的数据antibiofilm毒性和潜在的生物活性化合物的提取从土壤细菌种类的小说Paenibacillus可以用于未来的临床前和临床研究的规划对新biofilm-associated感染的治疗管理。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究得到了马来亚大学通过基础研究资助计划(德意志联邦共和国)项目。fp026 - 2010 b和研究生研究基金项目没有。PS184/2009C。作者要感谢动物保健单位中心工作人员(ACUC),马来亚大学医学院,协助处理实验动物。首席研究员已经完全访问所有数据的研究,负责数据的完整性和数据分析的准确性。作者声明没有财务披露。