文摘

原油样品的高和低含量两个海上平台(PA、PB)坎波斯盆地,巴西,被评估为细菌社区16 s rRNA基于基因的克隆库。RDP分类器是用于分析共有156个克隆在四库来自两个平台。克隆序列主要是隶属于Gammaproteobacteria(克隆总数的78.2%);然而,克隆相关Betaproteobacteria(10.9%),Alphaproteobacteria(9%)和厚壁菌门(1.9%)也确定了。假单胞菌科是最常见的家庭隶属于这些克隆序列。MOTHUR序列进行了进一步分析,产生81个操作分类单位(辣子鸡)分组紧缩97%。丰富估计也计算了MOTHUR表示,石油和样品的内容是最多样化。比较细菌社区出现在这四个样品使用LIBSHUFF和主成分分析(PCA)表明,含水量显著影响群落结构的原油来自PA。PA、PB库之间的差异,这表明油田的重要性作为一个司机的社区组成的栖息地。

1。介绍

生物降解油造成微生物的作用,破坏石油碳氢化合物和其他组件石油工业面临的一个难题。生物降解负责粘度的增加和酸度的石油和减少的API(美国石油学会)年级1]。不同的研究已经证明了大量而多样的人口的存在与不同的代谢活动在石油系统的微生物(2- - - - - -5),但由于困难在抽样和效率从油中提取DNA样本,对原油的细菌多样性(6- - - - - -8]。也是具有挑战性的工作与较低的样品土著生物量以及高,油性,粘稠乳液。

油田老化过程中,利用二次采油行业(SOR),由水库内注水保持地层压力,导致原油含水量的增加生产液体(油,水比)。琼和石油储集层的内容可能会降低内部温度,让原油的生物降解autochtone或allochtone细菌数量9]。控制细菌污染的水库中,随后在生产线,石油行业使用物理和化学治疗期间水注入到油藏的水(10]。在巴西,海水中使用SOR在海上平台。海水被过滤,氯化,脱氧和/或抗微生物剂除了注水前减少细菌污染。然而,这些治疗方法并不能完全消除注入水的细菌污染(8]。除了在琼注水,其他系统的污染来源是钻井作业,设备,损坏的油管或外壳。因此,外源性细菌可以进入储层,形成生物膜内的岩石和在生产井产油线和恢复(2,11]。因此,在原油样品中微生物可能反映出各自的土著生物石油的形成,也在很大程度上,外来的细菌种群。

尽管最近使用的分子技术在油田广泛的微生物群落的调查,我们了解这些生态系统的性质和细菌的多样性仍然稀缺,特别是注水开发油藏。因此,在这项研究中,细菌社区从原油样品含有高和低两个平台的内容在坎波斯盆地进行了分析使用16 s rRNA基因测序的方法来确定不同的水分含量可以影响细菌从原油和社区,因此,构成的风险减少油质量。

2。材料和方法

2.1。样品

Caratinga和梭鱼油田位于坎波斯盆地中南部的部分约90公里离岸的里约热内卢,巴西,在水深600至1200不等。Caratinga和梭鱼油田被指示为平台(PA)和B平台(PB),分别。这两个油田覆盖总面积大约234公里2。石油密度从这些字段API从20到26度。Caratinga和梭鱼字段的温度低于海平面2800米是78和79.5°C,分别。2005年海水注入这些平台对法师。两个井口被选在每一个平台、一个与另一个与低水位的内容和内容。井口被表示为PAH,伙计,PBH,或出版广播公司,相应的平台PA、PB和高(H)或低- (L)含水量(PAH,含水量60%;朋友,5%;PBH, 40%;和培养,1%)。原油在无菌收集的样本1 L烧瓶足够后直接从每个平台井口原油清理井口被耗尽了。 Samples were stored at 4°C until their arrival at the laboratory.

2.2。DNA提取

原油样品(10毫升)与同等体积的混合Winogradsky缓冲区(7为10分钟)和孵化80°C。水相的恢复与无菌吸管。这个过程重复了五次,收集50毫升的水相的总容积为每个样本。每个样本的总体积的水相颗粒状,在12000×g离心20分钟在4°C。一个整除(2毫升)的TE缓冲(10毫米三;1毫米EDTA)被添加到小球,和DNA提取进一步执行如前所述[12]。为了排除细菌污染的可能性从试剂,缓冲和/或酶使用DNA提取没有样本进行另外一个空白管。

2.3。聚合酶链反应条件细菌16 s rRNA基因扩增

16 s rRNA基因序列被聚合酶链反应(PCR)扩增使用先前描述的引物PCR条件(13]。引物U968和L1401放大V6-V8变量地区大肠杆菌小亚基核糖体rna基因。50μL PCR反应包含50 mM氯化钾,2.5毫米MgCl2核苷酸,2毫米,0.2μ每个引物(U968: 5′AACGCGAAGAACCTTAC3′和L1401: 5′GCGTGTGTACAAGACCC3′), 2.5 UTaqDNA聚合酶(Promega,麦迪逊,WI),和1μL (20 - 50 ng)的DNA提取。放大条件包括变性步骤在94°C 2分钟后跟35周期在94°C 1分钟,1分钟的退火步骤在48°C和30年代,在72°C和一个扩展步骤1分钟和30年代;最后在72°C扩展步骤进行了10分钟。消极的控制(没有DNA)也包括在所有的PCR反应。PCR产品使用向导被纯化PCR清理系统(Promega)和筛选了50μL的蒸馏水。存在的PCR产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳。

2.4。分子分析

部分433 - bp 16 s rRNA PCR是获得的基因序列克隆使用pGEM T-easy矢量根据制造商的指示(Promega)。结果结扎混合物变成了大肠杆菌JM109主管细胞,克隆包含插入排序。测序反应都是由Macrogen Inc .(韩国)。序列数据集被使用柏勒罗丰[筛查潜在的嵌合结构14)(可以在绿色煤电网站(版本3,http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-bel3_interface.cgi))。共有156个有效16 s rRNA基因序列分析的分类归属RDP分类器(15),最接近的匹配序列通过BLASTN基因库的数据库(16]。16 s rRNA基因序列被提交给基因库的加入数字:HQ341990-HQ3411999, HQ342010, HQ342021, HQ342032, HQ342043, HQ342054, HQ342064-HQ342083, HQ342084-HQ342121, HQ342122-HQ342146, HQ342000-HQ342009, HQ342011-HQ342017, HQ342018-HQ342031, HQ342033-HQ342039 HQ342041-HQ342053, HQ342055-HQ342063。

16 s rRNA基因序列被聚集在一个辣子鸡重叠身份截止97% MOTHUR软件(17]。丰富性和多样性统计功能,包括丰富的非参数估计的王牌Chao1,香农多样性指数计算使用MOTHUR也。辣子鸡的多样性和社区重叠检查使用稀疏分析和维恩图。系统发育树构建了四个库中的每个OTU发现代表(在3%的水平距离)和序列密切相关,从基因库中恢复数据库。序列比对是由Clustal-X软件(18],对齐序列被用来构建系统发育树neighbor-joining方法通过使用MEGA5软件(19]。引导分析与1000重复,只有值高于50%在系统发育树中所示。

2.5。统计分析

基于序列比对上面提到的,一个距离矩阵建立了利用PHYLIP DNAdist(3.6版)(20.),和两两比较每个克隆的图书馆进行了使用LIBSHUFF(版本0.96;http://www.mothur.org/wiki/Libshuff)[21]。此外,细菌群落结构之间的关系是评估使用主成分分析(PCA)。矩阵用于PCA是一个量化矩阵丰富的辣子鸡发现从每个克隆库。

3所示。结果

3.1。16 s rRNA基因序列分析

恢复微生物分数后,成功从原油中提取DNA样本。然而,较低的扩增子收益率与细菌获得16 s rRNA基因引物使用,可能由于低效率从油中提取DNA样本。正如所料,没有从空白管获得扩增子。PCR克隆产品,共有156个有效16 s rRNA基因序列分析的分类归属RDP分类器。图1显示了细菌克隆获得的频率多环芳烃(35克隆),PAL(38克隆)PBH克隆(42),PBL(41克隆)样本和克隆归属。辣子鸡的数量对应于每个家庭表示接近图(图上的酒吧1)。


图1
克隆隶属于不同的频率细菌家庭中每一个石油样本平台较低的A和B - (L)和高(H)水的内容。总共有156 16 s rRNA基因克隆被RDP分类器分类工具。辣子鸡的数量对应于每个家庭表示接近图的酒吧。辣子鸡定义使用距离的3%使用MOTHUR最远的邻居算法。PAL-crude石油平台与低水位内容(5%);PAH-crude石油从平台的内容(60%);PBL-crude石油平台B含水量较低(1%);PBH-crude石油平台B高含水量(40%)。

在克隆中,122 (78.2%)Gammaproteobacteria,和大多数是与家庭有关假单胞菌科(105克隆)。剩下的克隆(17)是隶属于Moraxellaceae,肠杆菌科,Alteromonadaceae,和Xanthomonadaceae。总克隆的同时,17例(10.9%)Betaproteobacteria,和大多数人的家庭Comamonadaceae从样本多环芳烃和PBL克隆(3),Burkholderiaceae从朋友和PBH)(3克隆,Oxalobacteraceae(从样品11个克隆PAH,伙计,PBH,和培养。几个克隆PBH样本(14),相应的克隆分析总量的9%,是隶属于SAR11进化枝,血统的细菌Alphaproteobacteria类,它是常见的海洋22]。在较小程度上,克隆芽胞杆菌科(两个克隆,每个样本多环芳烃和PBL)之一Veillonellaceae(一个克隆从示例PBH),代表了厚壁菌门。

所有16 s rRNA基因序列被集群辣子鸡,使用81产生的辣子鸡,密切相关的序列的系统发育树构建从基因库数据库(图中恢复过来2)。系统发育树显示,大多数从A和B平台属于辣子鸡Gammaproteobacteria。


图2
16 s rRNA基于基因的系统发育树库从平台获得A和b辣子鸡被MOTHUR定义使用最远的邻居算法距离水平的3%。一个代表每个OTU克隆(81辣子鸡)是用于系统发育分析。参考序列从基因库以粗体突出显示。树构造基于neighbor-joining方法。引导分析与1000重复,只显示值高于50%。规模栏显示的距离在每核苷酸替换。克隆与前缀表示多环芳烃和PAL起源于平台高,低水位内容,分别。克隆PBH和PBL从平台获得B高和低水位内容,分别。访问每个序列的名称是由数字对应于以下几点:代表克隆数,其次是OTU和OTU克隆的数量(例如,序列PAH27_18, 3 = clone_OTU名称、数量的克隆分组OTU)。每个访问名称后的符号表明OTU石油样本中发现多环芳烃(⚫)、朋友(○)PBH(■),和/或PBL (□)。
3.2。多样性分析

从不同采样站点获得序列被LIBSHUFF成对分析评估。原油样品含水量高值(PAH和PBH)统计不同( )。朋友和PAH库统计上也不同。然而,LIBSHUFF PB库没有显示统计差异(PBL和PBH)之间也没有样品水分含量较低(PAL和培养。这一发现是类似于主成分分析结果(图3)。PBH分组的PCA和PBL样本,而多环芳烃和PAL样本差异的分析。此外,第一个组件确定总变异的50.5%,显示一个叉状分枝的分离原油样品的多环芳烃和其它三个样品(PAL, PBL和PBH)。


图3
比较细菌社区样本中多环芳烃、PAL PBH和培养。主坐标图(PCA)使用的存在生成每个OTU(在3%的水平距离)发现在每个克隆库。PAL-crude石油平台与低水位内容(5%);PAH-crude石油从平台的内容(60%);PBL-crude油与低水位的内容从平台B (1%);PBH-crude石油从平台B的含量(40%)。

辣子鸡在每个采样点的数量以及丰富性和多样性指数如表所示1。总细菌丰富的报道几乎取得了所有库(数据未显示)。图书馆从石油样品高含水量(多环芳烃和PBH)有丰富基于ACE和Chao1高于PAL和培养。而香农多样性指数显示,细菌社区97%相似,维恩图解显示之间不共享辣子鸡所有四个样本,表明细菌社区是不同的在这两个平台(图4)。

表1
物种丰富度和多样性估计16 s rRNA基因的克隆MOTHUR计算。

图4
维恩图的细菌辣子鸡集群以3%的距离阈值,显示数量的辣子鸡共享的四个原油样品。PAL-crude石油平台与低水位内容(5%);PAH-crude石油从平台的内容(60%);PBL-crude油与低水位的内容从平台B (1%);PBH-crude石油从平台B的含量(40%)。

4所示。讨论

梭鱼和Caratinga巨头从坎波斯盆地深水油田,这是巴西经济最重要的石油盆地之一。原油样本中细菌社区这两个平台在本研究首次评估。此外,石油样品的含水量的差异被认为是在每一个平台。水分含量可能会影响细菌多样性和生物降解石油的水库。后者过程不仅需要水,还营养和碳氢化合物对微生物增长(4]。生物降解油藏通常产生油水乳化液体,这可能使经济复苏的这些样品的微生物存在的全部。石油从Caratinga API和梭鱼字段范围从20到26度,值对应于低/中石油降解。这一研究获得的结果表明,这些字段可能有潜在的生物降解因为油样品中发现的细菌。

替代微生物分离和细胞计数,一个主要的策略来研究微生物的多样性,是pcr的方法,它也可以提供一个了解无教养的微生物群落。然而,原油生物质含量较低的样品,可能导致DNA产量很低,影响分子方法的效率(23]。这些pcr技术也高度倾向于DNA污染和可能导致假阳性放大。克服这些问题在这项研究中,石油样本洗几次Winogradsky缓冲恢复细菌细胞和DNA提取前获得大量的生物质(7]。低,但足够数量的原油样品中细菌的DNA, PCR扩增。消极的控制还包括在DNA提取、PCR扩增程序,并在这些控件没有获得扩增子。

这一研究获得的数据显示一个空间异质性的细菌群落组成在坎波斯盆地,比较Caratinga (PA)和梭鱼(PB)领域。另外,注水可能会刺激细菌生长提供营养和减少井下温度、高水位的内容样本(PAH, PBH)显示更高的丰富性索引值(表1)。大多数图书馆并没有统计上的不同,除了多环芳烃。不同数量的水在PBL(含水量1%)和PBH(含水量40%)似乎并没有大到足以显著影响群落结构。当多环芳烃(含水量最高- 60%)与朋友(含水量5%),以及PBH PAH匹配时,观察细菌多样性的转变。利用主成分分析法(PCA)这些数据也被观察到,PC1代表辣子鸡空间分布,分离PA、PB、PC2代表含水量时,只有朋友和多环芳烃的影响。PAH的差异可能是由于丰富的观察组,只有在这个图书馆。几乎一半的PAH克隆相关Pelagibacter。这属属于SAR11进化枝,这是一个非常小,海洋异养Alphaproteobacteria发现在整个海洋22]。因此,我们认为,这种细菌可能是介绍了海水在二次采油,不自主的水库。

一个丰富的组织属于家庭假单胞菌科在四个16 s rRNA基因库。这个群体的存在可能是一个潜在的风险对石油生物降解在水库,因为这个家庭的成员也已经被分离出来并被分子技术在深海地壳和在高温油藏24,25]。此外,属假单胞菌已被证明会降低烷烃和其他聚芳碳氢化合物以及乳化和降解树脂从阿拉伯轻质原油26]。纳尔逊et al。27]证明了物种p . putida新陈代谢是一个多才多艺的细菌能降解各种异型生物质化合物。同时,Chayabutra和居28属)显示,另一个成员,铜绿假单胞菌,降低n厌氧反硝化条件下十六烷。

除了假单胞菌科,克隆与序列Moraxellaceae,肠杆菌科,Alteromonadaceae,和Xanthomonadaceae家庭也被发现在石油样品进行了研究。这些家族的一些成员已经被证明参与烃降解[29日- - - - - -32]。Betaproteobacteria有关的克隆属于Burkholderiales梭鱼的顺序观察原油样本和Caratinga字段。一些属集团(洋葱和Comamonas)曾被发现在厌氧条件下生长在石油储层或在受污染的土壤1,33]。因此,这些组织的存在在油藏研究表明海洋细菌污染后对法师使用的注水。Korenblum et al。8)也发现Marinobacter,洋葱,和假单胞菌在琼水使用。

几个克隆与壁厚菌门门在样品中发现多环芳烃,PBH和培养。在这个门,芽孢杆菌株之前孤立从油藏在巴西8,34),不同菌株可以降低石油碳氢化合物(34]。然而,这是第一次出现壁厚菌门的另一个属,一个Pelosinus有关的克隆,在石油的环境。芽孢杆菌和Pelosinus物种可能还存活在一个石油环境由于孢子形成或使用硝酸或铁的呼吸。

总之,我们报告细菌成分存在于原油样品高,低水位内容从两个巴西油田Caratinga和梭鱼。这些信息在原油的细菌多样性增加当前微生物生态学的知识在这个环境中,这可能有助于预测潜在的生物降解在这些领域。基于16 s rRNA序列的克隆获得有关不同细菌家庭的优势假单胞菌科,这是所有原油样品中观察到。此外,一些克隆相关属之前没有被描述在这个环境。然而,我们都知道,数量有限的克隆在本研究评估。细菌隔离仍然需要确定这些不同细菌的工业和生态意义。

承认

本研究作为项目的一部分进行了巴西国家石油公司的支持。