分布和遗传的多样性沙门氏菌血清萨旺尼河上游

文摘

萨旺尼河河跨越佛罗里达/格鲁吉亚边境到墨西哥海湾,并有助于地区灌溉和娱乐活动。协会沙门氏菌血清与这些资源可能导致产生的污染和疾病暴发。因此,地表水的分布研究美国血清在多个时间点从4网站萨旺尼河上游。隔离被检测的证实再次基因,96%的样本阳性细菌。最可能的枚举数< 18岁到5400岁不等或然数/ 100毫升。遗传多样性的隔离()与其他环境()或临床()菌株和在线图书馆()使用DiversiLab rep-PCR。所有菌株显示> 60%相似,分成16 rep-PCR genogroups。大多数(74%)的萨旺尼河河隔离被聚集到两个由genogroups几乎只(97%)的这些隔离。相反,85%的菌株聚集到其他genogroups临床参考。然而,一些萨旺尼河河隔离(12%)与这些主要聚集clinically-associated genogroups,支持假设河水库水可以作为一种疾病,致病菌株可能存在或可能来自环境的来源。

1。介绍

Nontyphoidal沙门氏菌病的主要原因是细菌性食源性疾病在美国和所有foodborne-related死亡导致大约33%的2009年(1]。相关联的疾病特点是肠胃炎的广泛(> 2500)沙门氏菌血清血清型(2]。从历史上看,疾病水库沙门氏菌主要是由于受污染的禽肉和禽蛋,但其他来源包括土壤、工厂表面,动物粪便,和生肉类(3,4]。最近,橙汁(5- - - - - -8)和其他生产产品(9- - - - - -12)已经越来越牵连沙门氏菌病暴发的源头。此外,病例数每爆发更大的蔬菜比任何其他产品(13]。

灌溉用水污染土壤中可能发挥重要作用和生产沙门氏菌(14,15]。雨水径流和化粪池贡献者的病原体地表水(16,17),但雨事件也可能帮助运输环境来源的病原体在森林和草缓冲区到农场池塘(18]。实验室化验证明病原体通过根部吸收的潜力19)可食用植物和鲜花20.),而沙门氏菌灌溉来源已被证明坚持植物和生存很长一段时间21]。

萨旺尼河河萨旺尼河河的分水岭,是自由流动的最大来源淡水墨西哥湾(22]。该地区的特点是相对最小的人类影响和横跨格鲁吉亚和南部的沿海平原北佛罗里达中部。最近的一项调查中收集的地表水西南格鲁吉亚部分流域存在的报道美国血清(17]。这一地区被认为是一个“热点”环境沙门氏菌病的来源,随着情况下利率在这个地区高于全国平均水平的1.5倍(14,23),并在本地收集的河水在12个月期间呈阳性美国血清在79.2%的样品(17]。美国血清密度与水温度直接相关( )和降水量( ),在夏天比春天个月也增加了62%。这个调查还发现了型与环境相关疾病在这个地区的来源。然而,从临床和环境来源菌株的遗传关系还没有经过验证。

美国血清水生环境的隔离显示更大的多样性比恢复动物来源的血清型(24- - - - - -26),但的遗传多样性和分布美国血清从环境仍然是相对未知的来源。因此,本研究调查的遗传资料美国血清从萨旺尼河河中恢复的临床和其他环境来源的菌株。DiversiLab重复基因外回文PCR (rep-PCR)分析被用来评估的遗传相似性沙门氏菌压力,因为它显示了增强的歧视比其他方法,如脉冲场凝胶电泳(27- - - - - -29日]。结果表明,美国血清从萨旺尼河河地表水样品组成一个多元化的人口遗传学上截然不同的其他环境来源的菌株和大多数的临床菌株来源。本研究建立了美国血清数据库应作为常规监测和参考源跟踪在未来爆发。

2。材料和方法

2.1。美国血清菌株和文化条件

美国血清隔离从地表水样品萨旺尼河河(),如下所述。参考菌株包括总计186美国血清从临床分离株()和环境()和菌株来源请提供由美国广播公司研究,Inc . Mickie教区博士和玛格丽特·理查兹,如表1中所描述的补充(可在网上http://dx.doi.org/10.1155/2011/461321)。所有菌株都存储在Luria−80°C Bertani生理盐水(1%)肉汤(LBN)和50%甘油和亚文化LBN琼脂(LA)的遗传特性。

2.2。采样协议

萨旺尼河河地表水样品收集每月从1月到2003年6月。抽样地点包括公共访问网站的大浅滩州立公园,FL (BP),斯蒂芬。福斯特国家民俗文化中心在白色的弹簧,FL (WS),精神萨旺尼河营地船坡道(SP)和佛罗里达州州长男孩牧场船坡道(BR)。样本收集在无菌、玻璃容器通过略读地表水和运输在冰冷却器实验室,储存不超过24小时在4°C,和处理如下所述。所有媒体都从Difco科学公司除非另有说明。

2.3。隔离和枚举的沙门氏菌

沙门氏菌水样(500、100、50、10和1毫升)被用来确定最可能的数量(或然数),除了相同体积的无菌1%缓冲蛋白胨水(BPW) 2或1 x(1毫升)样品浓度在一式三份(30.]。肉汤文化孕育在37°C一夜之间用颤抖的(新布伦瑞克科技孵化器)。这些文化(1毫升)随后被转移到9毫升连四硫酸盐肉汤(TT)选择性浓缩在一夜之间37°C。TT肉汤文化那么有隔离到XLD (Oxoid)琼脂板、拉板上发现,孵化37°C一夜之间摇晃(费舍尔科学孵化器)。沙门氏菌,积极的样品经种特异的PCR和DNA探针识别假定积极殖民地XLD和洛杉矶,如下所述。证实隔离都冻如上所述,储存在-80°C。每个样本的或然数/ 100毫升萨旺尼河河是由复制的数量为每个稀释浓缩文化,证实了种专一性识别假定积极的殖民地,如下所述。

2.4。物种确认

所有样品的典型菌落形态沙门氏菌在XLD琼脂板经DNA探针菌落杂交和PCR。DNA探针测定,殖民地种植在洛杉矶在37°C和转让滤纸(绘画纸没有覆盖。541),如前所述31日]。短暂,殖民地在过滤器在0.5细胞溶解氢氧化钠和氯化钠1.5解决方案,中和在2 M醋酸铵(费舍尔,匹兹堡,Pa),和洗1 x SSC缓冲区(0.003 M柠檬酸钠和0.03 M氯化钠)。过滤器被蛋白酶K (20μg / mL)在SSC SSC和清洗。过滤器是杂化在缓冲与alkaline-phosphatase-labeled 56°C (DNA技术,丹麦)DNA探针(5′> CTGGTTGATTTCCTGATCGC > 3′)派生的美国血清再次基因。过滤器清洗1 x SSC在56°C,其次是在室温下洗去除游离探针,和发达国家的电视台/ BCIP衬底(费舍尔,匹兹堡,Pa)。

PCR证实,肉汤文化(1毫升)被煮沸提取细胞从一个殖民地在400年中止μl PBS和孵化7分钟100°C。样本在13000转3分钟,离心机和上层清液被转移到一个新的微型离心机管。在上层清液中提取DNA (2μl)结合23μl主混合(埃普多夫),向前底漆INVE (5′-TGCCTACAAGCATGAAATGG-3′),和反向引物再次(5′-AAACTGGACCACGGTGACAA-3′)的PCR扩增Mastercycler梯度热循环(埃普多夫)。使用下列条件:初始变性为3分钟。在94°C,紧随其后的是30 1分钟的周期。在94°C, 1分钟。在56°C, 1分钟。在72°C,最终延长15分钟。在72°C。样本结合2μl (6 x加载染料(Promega)和1%琼脂糖凝胶上运行可视化的PCR产物溴化乙锭染色。积极的沙门氏菌乐队有一个457个碱基对的长度。

2.5。Rep-PCR分析美国血清隔离

DiversiLab Rep-PCR分析美国血清隔离执行根据制造商的规格沙门氏菌(BioMerieux)。短暂,基因组DNA从隔离种植在拉板使用超净微生物DNA提取隔离设备(莫生物实验室,Inc .)。DNA的浓度是由光谱法(光谱max + 384,分子器件、桑尼维尔加州)和存储−20°C。用PCR扩增美国血清rep-PCR DNA指纹分析工具包(BioMerieux) AmpliTaq DNA聚合酶和GeneAmp 10 x PCR缓冲我和Mg Cl₂(应用生物系统公司,Inc .)。每一个PCR反应(25μL)包括2μL的美国血清0.5引物混合,μL AmpliTaq DNA聚合酶,2.5μL的缓冲区,18岁μL的主,约2μ50 ng / L (μL)的模板DNA。放大了在Mastercycler梯度热循环(埃普多夫)表示的条件美国血清rep-PCR指纹识别设备。所有rep-PCR扩增子筛选通过在1.5%琼脂糖凝胶电泳(费舍尔科学)Tris-acetate-EDTA含有溴化乙锭的缓冲区。所有放大产品储存在−20°C。使用扩增子(1样本分析μL)加载到DNA微流体Labchip和毛细管电泳的安捷伦2100。电泳图分析DiversiLab系统软件(BioMeriuex)应变比较DNA相似DiversiLab rep-PCR在线图书馆美国血清()。

2.6。统计分析

卡方检验是用来比较隔离rep-PCR genogroups与菌株来源(临床和环境)和型32]。

3所示。结果

3.1。复苏的美国血清从萨旺尼河河

沙门氏菌隔绝的所有站点的地表水采样萨旺尼河河(图1)。这些网站包括大浅滩州立公园(BS),斯蒂芬。福斯特国家民俗文化中心在白色的弹簧,FL (WS),精神萨旺尼河营地(SP)和佛罗里达州州长男孩的牧场(BR)如图1。大浅滩最接近Okeefenokee沼泽河流的源头,而其他下游网站在更靠近人口密度较高的人类活动。我们发现,96%的样本阳性美国血清的复苏的隔离再次基因。

尽管数据是不可能的因为或然数没有执行从每个站点复制样品,结果表明沙门氏菌水平范围从没有可检测5400或然数/ 100毫升(表1)。上游网站,有趣的是,这两个大浅滩和白色的泉水,始终保持低约10 - 100倍或然数水平1月至4月,下游站点相比,从人口密集地区或位于毗邻农业活动。除了样本收集在白弹簧1月份,至少30隔离从每个时间点恢复从所有网站和存储为冻结的股票进行额外的测试。总异养需氧细菌计数在LA萨旺尼河河水样品在这个时期介于1.0×10之间¹和6.9×10²CFU毫升⁻¹(数据没有显示)。

3.2。遗传多样性的美国血清萨旺尼河河的菌株

隔离的之间的遗传相似度美国血清从萨旺尼河河被DiversiLab评估rep-PCR系统。这些隔离是相对于其他美国血清株临床和环境和DiversiLab来源美国血清图书馆。该方法将美国血清菌株分为两个主要集群隔离亚种三世从亚种株(图2)。复制分析()相同的菌株()通常至少有95%相似(数据没有显示)。因此,隔离> 95%相似度被认为是克隆试验。总共499株被rep-PCR检查,和所有菌株都是> 60%相似的试验。使用标准菌株分离成16 genogroups > 85%的DNA相似度超过两种,而14株未归类(补充图1)。

总的来说,美国血清菌株恢复萨旺尼河河非常多样,分布在10 genogroups,虽然6隔离没有集群与其他菌株(补充图1)。没有一个萨旺尼河隔离集群亚种3 (Arizonae)。重要的()遗传相似度被rep-PCR萨旺尼河河中观察到的隔离,这些菌株被通常不同于菌株来自其他来源。大多数(74%)的萨旺尼河河菌株隔离genogroups只有两个,即10和15。每个组只包含一个孤立non-Suwannee来源,其中包括临床病例,另一个番茄。相反,69%的菌株DiversiLab图书馆,从临床分离株组成的来源,分布到genogroups 5、6、11和13,而只有12%的萨旺尼河河隔离被包含在这些组。有趣的是,萨旺尼河河隔离来自其他环境也不同于菌株来源包括来自佛罗里达州中部,如青蛙、橘子或湖泊(表2)。例如,隔离从佛罗里达州中部湖泊集群genogroups 5和11个主要填充临床菌株来源。

萨旺尼河河隔离的分布抽样检查网站显示,不同genogroups被发现在不同采样地点,和最常见的genogroups填充萨旺尼河隔离(10和15)被发现在所有网站(表3)。同样,个别genogroups被月(表均匀分布4)。虽然菌株分离浓缩样品,克隆分离(相似度> 95%)并不一定对应于相同的示例站点或时间。然而,由于数量少,从每个站点收集和分配不均的分离或时间点,并没有进行统计分析对样本网站或季节性,以及明确的关系成立。

3.3。的分布沙门氏菌血清型在DiversiLab Genogroups

美国血清隔离()从萨旺尼河的河流恢复之前的一项研究在1998 - 1999年(33血清型),血清型包括因弗内斯(),慕尼黑(),Rubislaw (),Braenderup (),一个应变蒙得维的亚,新港,约翰内斯堡,古。有些菌株untypeable菌株()或粗糙()。特定血清型和菌株的来源如表所示5。Rep-PCR与血清学分析显示协议的美国血清来自萨旺尼河河和其他地方,和紧张(70%)具有相同型经常被克隆(类似> 95%)与一个或多个独立来源的菌株。然而,rep-PCR还透露菌株之间的遗传差异同一型,如血清型经常分隔成多个genogroups(表6)。此外,分离株的遗传相似度被血清学un-typeable被rep-PCR透露。例如,一个un-typeable萨旺尼河河隔离(UF-14)并不确定美国血清血清学分型,而是证明96%的DNA相似其他萨旺尼河河分离血清型为Braenderup genogroup 9 (UF-8和UF-9)(补充图1 (S))。同样,一个粗略的美国血清应变(UF-29)证明> 95%的DNA相似度两个萨旺尼河河分离血清型为genogroup内因弗内斯(UF-28和UF-30) 10。高水平的DNA相似度(> 90%)也指出几个萨旺尼河河流隔离Rubislaw血清型,另一个在genogroup15 un-typeable应变(UF-3)。然而,两个un-typeable (UF-12 UF-15)菌株没有集群与其他隔离85%的DNA相似。一个临床美国血清因弗内斯与39个血清型集群萨旺尼河河隔离在genogroup 10中,包括8萨旺尼河河隔离,也因弗内斯血清型。其余萨旺尼河河genogroup 5中分离血清型为因弗内斯被发现,还包括萨旺尼河河分离血清型为慕尼黑和约翰内斯堡。萨旺尼河河的几株表示非常高(≥90%)的DNA亲缘等重要的临床型沙门氏菌感染,蒙得维的亚,慕尼黑。

4所示。讨论

美国血清广泛分布在萨旺尼河上游,并从多个位置在不同的时间点恢复。血清型和基因分析说明这些菌株的多样性也表明,一些基因型可能比其他人更普遍在萨旺尼河河,> 70%的菌株聚成genogroups只有两个。此外,这些genogroups截然不同的大多数菌株来自临床和其他环境资源被排除在外。有趣的是,压力从佛罗里达州中部湖泊恢复使用类似的方法初步研究更有可能与临床来源菌株集群。虽然这项研究的菌株数量太小,不足以得出结论对这些人群,结果表明,基因型的美国血清可能是不同分布在佛罗里达含水层。

与血清学分型的DiversiLab rep-PCR化验显示一些协议,从不同来源的血清型经常聚在一起。然而,基因打字还表示,有些污渍具有相同血清型基因多样化。例如,与血清型菌株从萨旺尼河河因弗内斯大多是在genogroup 10(8 9),包括临床因弗内斯应变,但萨旺尼河河因弗内斯隔离分化genogroup 5和多基因相关与慕尼黑血清型菌株。之前的描述rep-PCR打字也显示不同的结果。魏盖尔et al。29日)指出,更大的权力歧视rep-PCR相比,但是脉冲场凝胶电泳的出现,但Kerouanton et al。34)发现它不如ribotyping或AP-PCR歧视性。Chmielewski et al。35]发现REP-PCR和ERIC-PCR高度歧视性隔离来自波兰,但重现性是一个问题与乐队数量和定位不同的模型thermocycler [36]。Diversilab系统(bioMerieux)用于本研究的rep-PCR独特于其他rep-PCR化验由于标准化的试剂,在线数据库,对峰值的大小和高度的内部控制,使用毛细管电泳进行PCR产品的特征。我们发现,相同的独立样本沙门氏菌应变高度可再生的和总是聚集着成群的相似度> 95%。明智的et al。27)最近发现这个系统是一个优秀的血清型的预测,和科里奇et al。28)发现这是一个“合理的选择但是脉冲场凝胶电泳的出现。”

2009年十大疾病有关的血清型包括纽波特,沙门氏菌感染,Javiana,海德堡慕尼黑蒙得维的亚,Oranienburg和圣保罗。而真正的多样性沙门氏菌型在佛罗里达含水层仍不明,目前的研究发现8型(Rubislaw慕尼黑因弗内斯,Braenderup蒙得维的亚,新港,约翰内斯堡和古)和10 genogroups来自这一地区。在1989年之前的调查报告14沙门氏菌型来自包括Allandale萨旺尼河河,水,Braenderup,代托纳,Gaminara,哈特福德,因弗内斯,蒙得维的亚,慕尼黑乙型副伤寒,Saintpaul,第四亚种,塔拉哈西,沙门氏菌感染37]。另一项研究在1997年报道7型(Rubislaw,塔拉哈西,Gaminara Javiana,慕尼黑因弗内斯,和哈特福德),在1998年,10型报告(Allandale蒙得维的亚,Gaminara,哈特福德,因弗内斯,Javiana,慕尼黑Rubislaw,塔拉哈西和Arizonae)由佛罗里达农业部的消费者服务(38]。因此,慕尼黑和因弗内斯是常见的所有(包括本研究)的研究,尽管Braenderup,蒙得维的亚,Rubislaw多个研究中被发现。新港、约翰内斯堡、古独特的目前的研究。

目前的研究在北佛罗里达最近开展的一项调查显示出相似的沙门氏菌从乔治亚州南部的小河流萨旺尼河上游流域的一部分(17]。这两份报告确定慕尼黑和Rubislaw主要血清型,但40.6%的菌株在之前的研究中被确定为美国血清无性系种群。Arizonae,恢复从萨旺尼河河通过血清型或rep-PCR基因型。他们得出的结论是,复苏的慕尼黑分水岭是流行病学意义重大,其发病率正在增加在人间病例在乔治亚州(在10年内增加34%)。此外,慕尼黑萨旺尼河河的菌株与主要相关临床(genogroup 5)基因型。最近沙门氏菌爆发在佛罗里达州已经确定Braenderup [39],Javiana [40],圣保罗[41]。没有包括在这项研究中,Javiana Braenderup确认从萨旺尼河河形成了一个独特的rep-PCR集群(genogroup 9)。无论是研究发现最常见serotype-associated沙门氏菌病,即血清型肠炎,从水样1]。此外,rep-PCR Genogroup 6与肠炎临床菌株鉴定不包含任何隔离从萨旺尼河河。然而,应该注意genogroup 7,包括临床培养的菌株做集群与萨旺尼河河4分离。因此,本研究最有趣的发现是识别沙门氏菌菌株在萨旺尼河河基因与临床来源的菌株。

虽然这些调查不是一个系统或详尽萨旺尼河河流域的调查中,他们表现出的多样性沙门氏菌在灌溉来源和建议可能存在潜在的病原体。弗朗兹和Van Bruggen [13)报道,在环境中普遍存在的病原体是成反比的遗传多样性生物群系和富营养的环境促进多样性有所下降。虽然目前的调查没有检查环境参数的分布沙门氏菌在佛罗里达州,有显著的不同人口密度与上游和下游站点相关联。上游网站在距离这条河的源头来自农业和其他人类的影响和更大的距离。例如,最上游站点在大浅滩州立公园和本质上是无人居住的在靠近河边没有农业,而其他网站直接接触人群。这些差异可以解释的10 - 100倍增加或然数毫升⁻²相对于上游下游站点。然而,没有引人注目的差异观察的多样性沙门氏菌萨旺尼河河上从不同的网站。未来的研究需要检查复杂的环境参数,特别是在与营养的关系可用性、农业投入,野生动物分布、流率、降雨和其他因素,可能会影响微生物多样性和生存的沙门氏菌。

确认

由佛罗里达番茄委员会提供了部分资金。作者要感谢教区博士和玛格丽特·理查兹提供沙门氏菌菌株。

补充材料

引用

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