文摘

黄曲霉毒素(房颤)是一种致癌代谢物由确定曲霉属真菌农产品种类。房颤茉莉酸生物合成的影响,也由其methylester(惩罚),植物生长调节剂来自亚油酸。这项研究报告的法案的成长的影响答:寄生和房颤输出在酵母蔗糖(是的)中添加三种不同浓度时;也就是说,米,M,M。房颤决心是由immunoaffinity和高效液相色谱法。法案在和M浓度对菌丝的生长没有显著影响但影响房颤生产后的第七天孵化;在第12天,房颤产量增加了212.7%和141.6%相比,控制样品(添加M和M的法案,职责)。治疗答:寄生文化与M惩罚抑制菌丝的生长和房颤生产。这些结果表明,惩罚在房颤的影响生物合成的答:寄生取决于使用的法案的浓度。

1。介绍

黄曲霉毒素产毒素的菌株产生的真菌代谢产物酮化合物是次要的黄曲霉,曲霉属真菌寄生和曲霉属真菌nomius(1- - - - - -4),他们被称为强有力的致癌、致畸和基因毒性真菌毒素。最有力的四个自然产生的黄曲霉毒素是黄曲霉毒素B₁(空军基地₁)[5]。

进行了各种研究为了了解作物受黄曲霉毒素污染的过程。他们都认为Aspergilli通常获得植物种子通过裂缝产生的环境压力(热或汇票)或通过昆虫损坏(6,7]。此外,油性种子优先殖民相比,淀粉类的(8]。一旦真菌入侵的种子,它首先破坏脂质体,主要由棕榈,油酸和亚麻酸(9,10]。因为有很多体外研究表明,脂质氧化影响黄曲霉毒素生物合成(11- - - - - -14),这是极大的兴趣确定相互作用的模式生产不饱和脂肪酸及其代谢产物黄曲霉毒素。亚麻油酸和亚麻酸可以接受区和立体定向氧化15)广泛分布的植物应激反应酶催化的脂氧合酶(LOX) [16)取得13 s-hydroperoxy-cis-9-trans-11-octadecadienoic酸(13 s-hpode)和13 s-hydroperoxy-cis-9 trans-11, cis-15-octadecatrienoic酸(13 s-hpote),分别17]。这些脂肪酸氢过氧化物进一步通过octadecanoid途径转化成酸盐(18),一群生物活性化合物参与信号不同的(多个)方面的植物应对生物和非生物环境(19,20.]。

在植物中,酸盐合成低聚糖等应对系统性或局部信号释放真菌或植物细胞壁在植物相互作用[21]。根据puhl et al。22植物病原细菌物种),已经开发出特定的方法攻击植物细胞和使用植物分子为自己的增长;细菌基因组研究了细菌分泌系统的分布信息,发挥了作用在植物细胞的相互作用。维勒et al。23)报道,茉莉酸含量迅速增加,以应对生物和非生物压力如机械应力。此外,据报道,黄曲霉毒素影响氨基酸吸收,酶的活动,萌发以及蛋白质和核酸合成系统在几个工厂。最近,Ağar et al。24)报道,内源激素的水平(Gibberelic酸当量)减少玉米种子处理空军基地₁。此外,自然等结合甲基jasmonate (MeJA)来评估其影响植物抗毒素和空军基地₁在棉花生产工厂(25]。

在的情况下Aspergilli酸盐之间的相互作用,已报告菌丝体生长和黄曲霉毒素的产生由几个作者。这些交互是极大的兴趣,因为他们认为有一个涉及植物LOX途径影响黄曲霉毒素的生物合成机制。有趣的是,和抑制黄曲霉毒素的刺激生产的各种液态氧代谢物的报告。一些hydroperoxy脂肪酸可能会产生更强的信号影响黄曲霉素/杂色曲霉素(AF / ST)生物合成而不是别人。例如,黄曲霉毒素生物合成答:寄生在合成培养基含有30%的混合刺激13 s-hpode吗70% 13-HPODE虽然13-HPODE单独测试时具有抑制作用。法案治疗浓度MM减少空军基地₁生产答:flavus生长在Czapek酵母提取物琼脂(自保”)中量和开心果在存储26]。相反,Vergopoulou et al。27)报道,治疗浓度的法案M刺激空军基地₁生产答:寄生生长在酵母蔗糖培养基(是)。在最近的一次审查,福尔摩斯et al。28)强调lipoxygenase-generated信号,如酸盐,都抑制和促进对空军基地的影响₁即使把生产的Aspergilli。

本研究的目的是建立的意义和后果的使用不同浓度的法案对霉菌生长和空军基地₁在定义条件下输出。

2。材料和方法

2.1。装置

层流(通讯卫星的生物活动花絮,马德里,西班牙),一个高压蒸汽(Selecta Autester-E干燥、PBI米兰,意大利),孵化器(方面粘合剂、Tuttingen、德国),和一个离心机(Sorvall RC-5B,诺沃克,美国)是用在这个研究。高效液相色谱进行了使用惠普1050 (Waldborn,德国)液相色谱仪配备JASCO fp - 920(日本)荧光检测器和一个惠普3395年积分器。高效液相色谱柱使用C18 Nova-Pak (604,毫米)。空军基地的流动相₁决心(水+乙腈+甲醇(20 + 4 + 3)]是透过Milipore HVLP过滤器(0.45在使用前m)。检测的空军基地₁半缩醛衍生物()在进行纳米和nm。流率为1毫升的保留时间是8分钟。

2.2。试剂

的空军基地₁标准从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。过滤器和C18 Nova-Pak高效液相色谱柱从水(美国微孔,米尔福德,MA)。的Aflaprep immunoaffinity列来自罗纳诊断(英国格拉斯哥)。所有其他试剂与高效液相色谱法和高效液相色谱法溶剂级(LABSCAN,都柏林,爱尔兰)。三氟乙酸是购自默克(达姆施塔特,德国)。法案的纯度测试使用GC分析使用惠普(hewlett - packard)气相色谱仪(配有火焰离子化检测器)BPX70-coated熔融石英毛细管柱(29日]。

2.3。媒体

黄曲霉寄生琼脂(顶峰)是由溶解4 g的酵母提取物(Oxoid贝辛斯托克,汉普郡,英格兰),2 g的细菌学的蛋白胨(Oxoid), 0.1 g的枸橼酸铁铵,0.2毫升Dichloran(0.2%乙醇、丙烯酰胺、Neu-Ulm、瑞士),0.02 g的氯霉素(Oxoid)和3 g的琼脂(Oxoid)在200毫升蒸馏水,最后pH值6.0 - -6.5 (30.]。Czapek阿霉素琼脂(CZA)是由溶解亚硝酸钠的0.4克,0.1 g的氯化钾,0.1 g的硫酸镁,硫酸铁的0.002克,0.2 g的磷酸钾,蔗糖6克,3 g的琼脂,硫酸锌的0.002 g和0.001 g的硫酸铜200毫升蒸馏水,最后的pH值6.0 - -6.5。酵母蔗糖(YES)汤是由溶解2 g的酵母提取物和15 g 100毫升蒸馏水的蔗糖,最后pH值6.0 - -6.5 (30.]。

2.4。制备孢子接种体

即使把应变答:寄生Speare (IMI 283883)利用在本研究获得国际真菌学的研究所(Engham、萨里、英国)。剂是通过增加模具CZA倾斜的股票文化,这是维持在5°C (31日]。孢子接种体是由增长答:寄生在CZA 7天30°C,和孢子收获无菌使用10毫升无菌0.01% (v / v)二层80解决方案32]。空军基地₁从最初的增长是最小化的孢子悬浮液通过离心法1分钟(1000克)和resuspending生物量在10毫升无菌渐变80解决方案两次。稀释从最初的孢子在无菌准备管包含渐变80年10毫升的0.05% (v / v)。孢子的浓度是由扩散板表面计数技术,使用0.1毫升的稀释在四个顶峰板(30.,33]在30°C孵化后2天。人口规模估计通过计算一个殖民地的反向强烈的黄色/橙色颜色。为了获得一剂包含分生孢子盘,10 - 100集落形成单位(cfu)选择和期望的孢子数量用于这项研究估计。

的数量孢子瓶¹被选为这是文学生产中的最低浓度检测大量的空军基地吗₁通过曲霉属真菌(34]。

2.5。接种

十二个烧瓶每天的观察包含10毫升的是的介质注射孢子瓶¹的答:寄生在适当的体积从选中的稀释。法案最终浓度的乙醇米,M,M瓶¹添加到每个每天三个烧瓶的观察。所有的烧瓶,控制(乙醇)和接受的法案,在静止的条件下孵化30°C。高压灭菌30分钟后立即在115°C作为安全原因(建议35),菌丝体生长决心和空军基地₁化验在天0、3、7、9、12、15的孵化。实验重复了一式三份。

2.6。空军基地₁的决心

每个瓶的内容(包含是的介质中的真菌)和30毫升的甲醇和wellshaken 10分钟。过滤后,1毫升的整除每个瓶用于空军基地₁分析。1毫升整除的滤液混合10毫升蒸馏水。混合物转移到一个Aflaprep immunoaffinity列和洗两次10毫升蒸馏水(流量:6毫升分钟¹)。列被允许再次干燥空气通过。空军基地₁筛选了与2毫升的乙腈(流量:0.3毫升最小¹)。衍生化之前,洗出液被蒸发干燥的水沐浴在温柔的蒸汽氮(36]。

2.7。衍生化和高效液相色谱分析

空军基地的衍生物₁(半缩醛的空军基地₁)准备通过增加200L己烷和200L三氟乙酸的蒸发溶液的空军基地₁洗出液、加热10分钟40°C水浴蒸发干燥下氮,再溶解在一个适当的体积water-acetonitrile ()给一个空军基地₁的浓度10 ng毫升¹和分析的高效液相色谱(体积注射:20L)。显示增强的荧光相比空军基地₁(36]。

2.8。测定菌丝体的质量

提取后,菌丝通过过滤器过滤,以前干(24小时在80°C)和衡量。菌丝蒸馏水清洗和被允许干24小时在80°C。菌丝体干重的被确定(37]。

2.9。统计分析

数据分析了单向和双向方差分析。平均值差异的显著不同的使用图基进行测试(38]。

3所示。结果与讨论

分析空军基地的协议₁确定是的中以前内部特征的细节Leontopoulos et al。39]。经济复苏的方法被发现90.9%,检出限,基于信噪比的在保留时间(8分钟)derivatized空军基地₁(),0.2 ng烧瓶¹对应0.02 ng毫升¹是的介质。

之间建立了一个令人满意的线性关系不同的数量(1,2.5,5g)的空军基地₁上升在10毫升的是的介质和数量恢复(,)。

3.1。惩罚的作用答:寄生增长

是的媒介是一个最佳的媒介答:寄生增长和空军基地₁生物合成(40]。在目前的研究中,答:寄生因为使用空军基地₁生产是一个更加稳定的特征在这种真菌答:flavus(41]。此外,空军基地₁研究了在这项研究中,因为它是最有效的真菌毒素,它通常是在最高级别由产毒素的菌株(42]。

我们研究的法案在最终浓度的影响米,M,M的菌丝体生长答:寄生是的介质和空军基地₁生产。它必须提到M是惩罚的浓度已经发现有效治疗抑制采后腐烂所致葡萄孢菌在草莓上,减少衰减青霉菌digitarum在葡萄柚以及减少微生物污染的芹菜,辣椒43]。Gogala [44)也报道,jasmonate高度活跃在中等浓度(M米),但抑制菌根的增长一直观察到低浓度(10⁷米)。据我们所知,米的浓度的法案尚未测试。

参与和MeJA-treated的菌丝体生长答:寄生是的中如表所示1。观察模具的最大增长控制在接种后7天样品瓶(352.5毫克¹)以及样品处理浓度的法案米(374.8毫克烧瓶¹),米(359.5毫克烧瓶¹)。相反,没有可见菌丝的生长答:寄生观察或测量的真菌在样品处理米在整个孵化期(15天)。

统计分析采用单向方差分析应用于所有组织,有或没有MeJA治疗,显示是高于df - 3, 20。因此,菌丝体生长四组之间的变化是统计学意义()。但它必须被添加,四组样本之间的显著差异可能是由于四组只有一个,可能样品处理M的法案。其他三组的差异的比较(控制、惩罚米,惩罚米)表明,在0.05水平,菌丝体生长的三组之间的差异并不显著,M和M的法案浓度没有明显的影响答:寄生增长。

这些结果符合Vergopoulou et al。27只研究了M的法案浓度和显示,没有对菌丝体生长的影响答:寄生被观察到。Goodrich-Tanrikulu et al。26)也报告说,从法案浓度M米的菌丝体生长没有明显的影响答:flavus。

3.2。法案影响空军基地₁生产是的介质

在这项研究中,空军基地₁生产可衡量的第0天的孵化(0.002克空军基地₁瓶¹、表2)

这个空军基地₁发生是由于样品的接种10²分生孢子的答:寄生/瓶。的文化接受米的法案,空军基地₁空军基地数量相比可以忽略不计₁生产样品处理浓度的法案M和M以及整个孵化期间控制样品。这些空军基地的痕迹₁可能是由于分生孢子的答:寄生,幸存下来尽管抑制真菌生长的法案在这个浓度。治疗的法案在最高浓度(米)减少空军基地₁生产与控制孵化期间以99.6%对99.9%,在八月十五这一天观察,空军基地₁没有检测到(是的)。这是由于抑制答:寄生增长的法案。

在样品处理M和M的法案,治疗增强的空军基地₁生物合成的答:寄生,而最大空军基地₁生产观察12天。这个生产和倍相比,样品0天,分别如图1。空军基地₁生产也在控制样本,但在这种情况下,最大生产()显示(图15天1)。在同等条件下,治疗米的法案导致了(9天)空军基地₁最高产量相比,天0。

如表所示2在样品处理浓度的法案米,空军基地₁输出是刺激后9天的孵化而最大生产观察12天(109.91g瓶¹),从而达到212.8%的控制。在浓度样品接受惩罚米,空军基地₁生产也刺激后第九天,12日84.91天克空军基地₁瓶¹对应于141.6%的控制。有关MeJA浓度,结果是同意Vergopoulou et al。27)曾报道说,这一法案原刺激了空军基地₁生产答:寄生7天的潜伏期后,尽管Goodrich-Tanrikulu et al。26)表明,黄曲霉素产量答:flavus根本抑制法案浓度测试,范围从哪一个MM。必须补充说,根据De Luca et al。14),Fabbri et al。11)、黄曲霉素生产增加50到200次治疗后10天大的文化答:寄生和答:flavus与亚油酸和大豆LOX1的混合物。此外,根据Greene-McDowelle et al。45),尽管一些液态氧产品有抗真菌活性,其他液态氧产品黄曲霉毒素影响生产时没有对真菌生长的影响。很明显,这项研究的结果支持类似的法案的行动的机制。

我们的结果证实了双向方差分析统计分析。零假设是有黄曲霉素的输出之间没有显著差异在不同浓度的法案。的价值大大超过一个列表在df 3,即约3.8,40岁。零假设因此拒绝了,结果表明,不同浓度的法案影响黄曲霉毒素的输出。第二个零假设是黄曲霉素输出之间没有显著差异在不同天的孵化。的价值超过了列表值4.21 df 9日40。零假设因此拒绝得出孵化天确实影响黄曲霉毒素的输出。第三个零假设是没有相互作用不同的法案浓度和天的孵化,影响黄曲霉毒素的输出。的计算值超过表一次2.039在df 12、40。因此我们再次拒绝零假设,并得出结论,不同的法案之间有一个互动浓度和天的孵化,影响黄曲霉毒素的输出。这些结果显示的可能性的存在不同的机制,通过法案影响空军基地₁当使用不同浓度生物合成。

Burow et al。42)已经报道,治疗9 s-hpode增加或减少黄曲霉毒素生产取决于浓度测试。此外,9 s-hpode诱导长期积累的成绩单黄曲霉素/杂色曲霉素生物合成基因。一些酸盐也可以激活基因编码的抗真菌蛋白如thionin [46],osmotin [47),以及在植物抗毒素基因生物合成(48]。此外,文化答:寄生和答:flavus产生大量的黄曲霉毒素,继续孵化过程中减少文化(49]。在这种情况下,作者报道,模具,能产生黄曲霉素,也可能降低。柯南道尔和马斯50观察到的能力Aspergilli降解黄曲霉毒素是依赖孵化的时间;菌丝老化8到10天最有效地降解空军基地₁。

根据《理发师陶德》和多布森(4),空军基地₁生物合成调控基因的转录水平的黄曲霉毒素生物合成途径。这些基因包括两个脂肪酸合酶基因,以及ord-1-gene polyacetide合成酶基因,编码细胞色素p - 450型单氧酶,推定地负责转换O-methylsterigmatocystin黄曲霉毒素。这个单氧酶还参与的趋向下降的活动答:flavus(51]。因此,当酸盐应用于植物体内组织,它们起到抑制或促进作用在生长和发育过程中(19),这一发现问题Aspergilli生长在植物以及空军基地₁生物合成。

法案提出了一个潜在的有效性在收获后控制黄曲霉毒素的生产中使用敏感商品像开心果26]。风车式的et al。52)也报告说,惩罚可以有效地应用作为采后治疗可以抑制灰霉菌引起的腐烂芽孢杆菌灰质在草莓。Markaki et al。53),然而,表明橄榄接受的法案在不同浓度时,空军基地₁生产浓度(空军基地₁减少或增加)在两个橄榄接种答:寄生而在noninoculated样本。应该提到的,在这种情况下,橄榄不是一个合适的衬底空军基地₁生物合成(39]。

总之,在这项研究中,结果表明,植物生长调节剂浓度10的法案²M抑制答:寄生增长是的介质,因此,空军基地₁生产是无关紧要的。低浓度而言,尽管在这项研究刺激是报道,在文学方面有冲突结果的影响在空军基地的法案₁生产。因此,它似乎是非常重要的识别条件下使用的法案可以有效预防空军基地的生物合成₁主要在产品注定长期存储。

承认

这项工作是支持在雅典大学的部分,特别研究经费占(70/4/8786)。