文摘
本研究的目的是孤立并选择本土土壤假单胞菌和芽孢杆菌细菌的能力开发多个机制相关的行动影响植物病原真菌的生物防除大豆作物。筛选过程包括对植物病原真菌的面板,对抗测试分类鉴定、PCR检测的几个基因与抗真菌活性,体外抗真菌的检测产品,根殖民化验。两个隔离,标识和指定为荧光假单胞菌BNM296和芽孢杆菌amyloliquefaciensBNM340,被选作进一步研究。这些隔离保护植物的腐烂所致腐霉属最后和能够增加大豆种子的幼苗接种后出现率与每个细菌。此外,拍摄植物中含氮量较高与BNM296种子接种时。这个工作的多相方法允许我们选择两个土著菌株促进了大豆植物的早期发展。
1。介绍
增加作物产量,需要使用农用化学品,有一些负面影响1]。自病原体损伤可能导致产量损失大,使用促进植物生长的细菌(PGPB)和抗真菌特性是一个有吸引力的替代使用此类异型生物质化合物(2]。物种属于芽孢杆菌和假单胞菌经常被用作生物防治剂,因为它们分泌水解酶能降解细胞壁(3),iron-chelating含铁细胞,和几个循环lipodepsipeptides (LDP) (4]。
假单胞菌能分泌出大量的抗生素,如2,4-diacetylphloroglucinol (2, 4-DAPG), pyoluteorin, pyrrolnitrin,氰化氢5,6]。芽孢杆菌压力也产生重要的抗生素是有用的植物病害控制(7,8]。一些证据确凿的PGPB特征与土壤肥力和植物营养优化细菌激素的生产和/或无机磷酸盐的溶解9,10]。
在阿根廷,大豆(大豆(L。]Merr.) is the main grain crop, this country being the third soybean world’s largest producer and the soybean flour and oil world’s largest exporter. Diseases, pests, and weeds are the most important biotic factors that limit soybean yields in Argentina [11],相关疾病的主要损失种质均匀性和缺乏轮作(12]。
在营养的发展阶段的影响可以影响期间的健康状况将决定作物生殖阶段(13]。腐烂时播种成了有关发生在寒冷季节的特征,潮湿的天气,因为它导致站减少,有助于增加杂草控制问题(14]。西班牙的策略建议作物生产者de Tecnologia Agropecuaria (INTA)阿根廷要避免早播种,引入旋转练习与禾本科作物,并使用fungicide-impregnated种子。两个主要的担忧与最后一个练习是病原体耐药性的发展和产生的次生环境影响异型生物质化学化合物的存在。
这项研究描述了土著菌株的分离和选育抗真菌活性的大豆根际。细菌特征识别和基于他们生产含铁细胞、生物表面活性剂,挥发性化合物,植物生长激素,磷酸水解酶、抗生素、和增溶的活动。我们测试了两个菌株对大豆植物提供的保护作用与挑战p .最后当接种于种子。大豆作物正在大规模生产以来,这项研究可能的发展积极贡献替代和可持续的大豆生产实践。
2。材料和方法
2.1。抽样、隔离和选择的细菌
根际土壤样本来自大豆作物在布宜诺斯艾利斯,阿根廷。细菌的主要筛选抗真菌活性进行如下:1 g的根际的土壤样本悬浮在5毫升的0.9% (w / v)氯化钠。倾析1分钟后,上层的铂环量的分数都是在一个边缘potato-dextrose-agar默克(PDA)板块和孵化30°C。9毫米插入从前缘尖孢镰刀菌BNM403菌丝体生长在PDA板块在30°C是放置在板的中心24小时后。盘子在30°C孵化了六个额外的天。然后,细菌纯化从盘子,菌丝的生长抑制15]。这个过程后,得到了细菌分离和单独测试的菌丝的生长抑制。菌丝的抑制40%的截止了,选择的隔离然后检查克反应,内生孢子的形成,细胞内的和位置(g +),或生产的荧光色素(克在国王的B (KB)琼脂板(16]。
2.2。培养条件
除非指定,所有菌株都生长在营养肉汤(NB 3 g肉汁和5克每公升蛋白胨)30°C 24小时,并在150 rpm摇晃。在使用之前,文化适应2108CFU /毫升。细菌保持长期储存°C NB甘油(v / v)为15%。真菌菌株在无菌土壤被储存在4°C。他们经常生长在PDA在24°C。表1显示所有在这篇文章中使用的菌株。
2.3。对抗对致病性真菌
细菌分离株进行了测试Macrophomina phaseolina,菌核病小,尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和腐霉属最后。
2.4。分子类型
从NB文化总基因组DNA制备使用向导基因组DNA净化设备(WI Promega Inc .,麦迪逊,美国)和50 ng /调整l .隔离被rep-PCR基因组指纹特征与BOXA1R引物(17]。假单胞菌聚合酶链反应通过隔离进行了分析假单胞菌sp。16 s rDNA特定的引物,其次是多个限制性内切酶片段长度多态性(MERFLP) [18]。为芽孢杆菌隔离,16 s-23s rRNA IGS-PCR分析如前所述[8,19]。放大进行一个MJ研究ptc - 100年thermocycler使用标准的条件。道达尔和16 s rRNA基因的部分序列进行测序和基因分型服务的准确和自然科学学院,阿根廷布宜诺斯艾利斯大学。16 s rRNA基因序列比较与基因库使用BLASTN 2.2.16程序(20.],密切相关的菌株都一致使用CLUSTAL W程序(21]。
2.5。水解酶的检测
几丁质酶活性测定根据Chernin et al。22),蛋白酶活动根据伯格et al。23),微晶纤维素分解活动很多纤维素含量丰富的板块如老师et al。所述24]。
2.6。含铁细胞生产的检测
含铁细胞生产测试的增长假单胞菌sp.和伯克不过普遍的含铁细胞检测中CAS琼脂(25]。
2.7。挥发性化合物的检测
简单地说,f .以上BNM 400年是生长在细菌的存在与否与它们之间没有身体接触,和菌丝体生长记录被蒙特et al。15]。的存在hcnB和hcnC基因编码的氰化氢(HCN)合酶被PCR评估。证实了氰化氢生产评估纸盘的方法(26]。
2.8。假单胞菌抗生素的检测
以下的存在基因被PCR评估如下:打印C,相关的合成pyrrolnitrin(打印);phlD,参与的合成2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG);phzC和phzD,参与phenazine-1-carboxylic酸的合成(PCA);和pltC,有关pyoluteorin (PLT)生物合成。薄层色谱法(TLC)分析后执行先前描述的协议来检测pyrrolnitrin和pyoluteorin [27]。
2.9。生物表面活性剂的筛选活动。
的存在都sfp,这对一个编码-phosphopantetheinyl转移酶(PPTase)参与surfactin合酶的激活asn,有关mycosubtilin合成,聚合酶链反应进行评估。浮在表面的游离的溶血活性评价和200年L样本加载到井在血琼脂平板(牛血板,阿根廷Laboratorio, SA)。孵化后48 - 72 h在37°C,溶血性活动被评为清楚晕的大小在威尔斯(7]。薄层色谱进行硅胶板确认生物表面活性剂和其他lipopeptides的存在芽孢杆菌例如隔离,如前所述,Souto et al。8]。
2.10。PCR反应条件
DNA纯化进行如上所述。在25个PCR反应进行L反应混合物包含20 ng DNA, 200每个核苷酸的mol / L(英杰公司有限公司),1.5或2.5更易/ L MgCl2 (Promega, Inc .)根据使用的一对引物,0.2每个引物的mol / L, 1 u Taq DNA聚合酶(英杰公司有限公司)和酶提供的缓冲区。这些实验中使用的引物退火温度如下:prnC-F prnC-R, 67°C (28];phl2-F phl2-R, 61°C;pca-F pca-R, 61°C (5];pltc-F pltc-R, 61°C (27];ACa和ACb, 68°C (6];sfp-F sfp-R, 53°C (29日];ASnI-F ASnI-R, 55°C (30.]。PCR产品1%琼脂糖凝胶上分离Tris-Borate-EDTA缓冲区(89更易/ L三、89更易与L硼酸,2更易与L EDTA和pH值8.0)在5 V /厘米2 h。
2.11。测量生长素的生产
生长素生产由Kamilova描述的比色法等。31日)做了一些调整。隔离是生长在M9 /甘油培养基在30°C,要么有或没有色氨酸(100g / mL)。后1、5、8天,在细菌培养茁长素的数量是决定使用Salkowski试剂(32)和indole-3-acetic酸(IAA, Sigma-Aldrich公司)作为标准。
2.12。检测的磷酸盐增溶的活动
磷酸盐增溶的酵母提取物dextrose-CaHPO4平皿上活动评估通过测量周围明确区发达菌落,经过7天的孵化30°C (9]。
2.13。殖民化验
这个实验是在无菌条件下进行。大豆种子表面消毒,被展出et al。33)和左1 h在去年的水清洗或接触细菌悬液。处理过的种子被引入无菌管霍格兰营养液。幼苗被保存在一个生长箱25°C的光周期16 h / 8 h(光/暗)。六个复制管用于每个治疗。七天之后,植物的根与芽分离,用5毫升无菌水,洗净浸泡5毫升无菌水,大力动摇了30秒钟,和用超声波浴(格兰特仪器有限公司,剑桥,英国)3分钟,为了量化松散附着细菌,在琼脂平板菌落计数。根再次洗和悬浮在3毫升无菌水,分散附带一只手砂浆量化强烈细菌,然后,根干重。
2.14。化验缩影
三个选择的菌株,p .荧光BNM296 BNM297,b . amyloliquefaciensBNM340,作为种子接种体组件进行测试。控制由noninoculated种子。治疗包括种子接种BNM296 BNM297,或BNM340出没或不是p .最后未经消毒的农业土壤中使用0.9公升的罐子。6罐/治疗被用于一个完全随机设计。出没的基质是由接种无菌蛭石的菌丝p .最后(繁殖体/ g)。10个大豆种子接种(CFU /每锅就播下了种子)。然后,10 g的真菌培养液添加一层和一层无菌蛭石是分布在已经添加在每个壶。种子生根培养基左1 h和每个文化接触,在室温下干燥,播种盆。植物收获后20天的增长与光周期16 h / 8 h(光/暗)22°C。所有的植物的根被清洗和根腐病的严重性决定视觉使用评定量表的0 - 4 (34),0 =没有疾病症状,1 = 1% - -25%(生长迟缓),2 = 26% - -50%(温和的腐烂),3 = 51% - -75%(严重腐烂),4 = 76% - -100%(种子催芽衰变)。疾病严重程度指数用来计算根的抑制百分比,使用以下方程:%抑制= (]100年,=疾病严重程度在根区域由于展出p .最后独自一人,=根地区疾病严重程度表现出与病原体和接种后细菌的拮抗剂。射干重和总氮芽被史密斯[确定所述内容35]。
2.15。加入核苷酸序列号码
部分的基因库数据库加入数字16 s rDNA序列确定如下:DQ885200伯克不过BNM345, DQ885199不过BNM353, EF095217不过BNM299, EF095218蜡样芽胞杆菌BNM343, FJ513627荧光假单胞菌BNM296。
2.16。数据分析
数据分析与信息统计专业从科尔多瓦大学,目前1.1版本软件Estadistica y Diseno FCA,阿根廷,在统计分析logit和平方根变换应用于出现率和殖民数据,分别标准化误差方差;在需要时,方差分析保护最小意义差(LSD)测试和具体的对比。差异被认为是重要的时候P< 0。1或P< 0 . 05。
3所示。结果
3.1。分离和鉴定
主要选择了从对抗测试板的支流从大豆根际细菌的生长抑制真菌菌丝的发展。纯细菌培养分离出这些盘子是检测真菌对抗。这个过程导致了150年最初的隔离,抑制腐皮镰孢霉菌BNM400 40%以上对真菌生长。通过额外的选择标准中描述的材料和方法,选择分离株的数量减少到80人。寻找细菌具有广泛的抗真菌作用,六的80分离后重新测试他们对植物病原真菌(表的面板2)。这六个菌株受到分子类型。IGS-PCR指纹分析允许的几个物种的鉴定芽孢杆菌组。BNM340隔离有相同的参考的模式b . amyloliquefaciensDSM1060,,BNM122。IGS-PCR rep-PCR, 16 s rDNA BNM343菌株的序列分析显示相同的模式所示的成员b的仙人掌集团(36]。在的情况下假单胞菌例如细菌,只有BNM296和BNM297菌株放大的预期990 - bp片段16 s rRNA基因,因此可以分为假单胞菌sp。他们MERFLP模式相同的彼此而不是其他假单胞菌用于比较,如前所述18]。生化试验的结果是类似的显示荧光假单胞菌物种(37]。其他隔离,如BNM345和BNM299列为属于伯克不过通过16 s rRNA基因序列相似度(38]。这两个隔离与参考株分享99%的序列相似性伯克不过AMMD和伯克cenocepaciaHI2424。
3.2。分离鉴定
表3总结了六所选菌株的鉴定的结果。假单胞菌和洋葱含铁细胞产生。关于细胞壁降解活动,表3显示chitinolytic活动的广泛分布在不同的菌株。所有隔离低cellullase活动,除了p .荧光没有压力。高蛋白质水解几乎均匀的分布在所有隔离。挥发性化合物的生产中检测出BNM296 BNM297以及不过菌株BNM299 BNM345。的存在hcn公元前证明了基因PCR为BNM296 BNM297但不是。这个结果符合本文磁盘检测氰化物生产(数据未显示),从而表明HCN的合成发生在BNM296 BNM297但不是。对抗生素生产,一个积极的信号打印C中检测出p .荧光BNM296,不过BNM299和BNM345。寻找相关基因的存在的合成DAPG和PCA为任何应变导致没有积极的信号。一个积极的信号,pltC中检测出p .荧光BNM296和不过BNM299。能够生产打印和PLT被薄层色谱分析证实了在每种情况下。抗生素被确定特征颜色和Rf值,相应的标准PLT、射频:0.65厘米,棕色和打印,射频:0.81厘米,粉色(数据未显示)。当生长在血琼脂平板,所有菌株除了BNM345显示溶血性区。PCR筛查序列相关芽孢杆菌lipopeptide合成显示的存在asn和sfp基因在b . amyloliquefaciensBNM340。几个点的两性分子的化合物,其中两个号码对应surfactin iturin,通过薄层色谱分析检测;其他的还没有被确认。生长素发现生产测量IAA等价物隔离。发现磷酸盐增溶的活动被视为有关BNM296和BNM299而没有或很低的活动出现在剩余的细菌。
3.3。大豆种子和根接种化验
b . amyloliquefaciensBNM340和p .荧光BNM296和BNM297选择进行接种试验。尽管他们敌对的效率高,不过和b的仙人掌隔离并不包括在任何进一步的实验,因为他们的基因关系有潜在危险的细菌(39,40]。
结果大豆种子和根殖民展示在表4。细菌的量化坚持接种导致种子的表面浓度BNM296或BNM340 BNM297高于。
关于殖民模式的两种类型的根这里提到,我们决定,在BNM340,强烈和松散细菌分数明显低于BNM296和BNM297。BNM340, BNM296 BNM297, CFU / mg之间没有明显差异dwr恢复强烈和松散连接的分数。没有等细菌菌落恢复noninoculated种子或幼苗控制。
3.4。化验缩影
当植物病原体的挑战,b . amyloliquefaciensBNM340是最有效的压力压制腐烂,紧随其后p .荧光BNM296(表5)。p .荧光BNM297无法施加任何影响大豆植物,反应像控制植物生长在土壤中只包含真菌。
植物接种BNM296发达相比更好地控制植物无菌核的土壤。植物的出现率在出没的土壤接种BNM340或BNM296显示同样的速度作为植物无菌核的土壤。BNM297未能保护植物这个参数也证明了这一点。植物生物量无菌核的BNM296土壤高于其他疗法;虽然有一个倾向于有更高的生物对于其他接种治疗控制相比,不具有统计学意义。当植物被挑战p .最后植物的重量记录在无菌核类似土壤,BNM297除外。植物的含氮量接种BNM296高于其他治疗,在这两种情况。未发现差异之间的其他治疗方法。
4所示。讨论
筛查策略进行本文由孤立的可耕种的细菌菌株通过生物电控制机制刺激植物生长的能力。接受被惠普尔说早些时候(1,41和其他作者2),有效的生物防治剂通常通过几个不同的组合机制,选拔程序,允许我们发现阳性菌株不止一个敌对的机制设计。的主要筛选导致一群细菌能够存活在其它微生物的存在和显示nonobligate细菌捕食者的行为(42),从而允许我们选择细菌显示几种拮抗机制。
我们专注于细菌属中经常发现的大量人口在土壤与一般疾病抑制(43),如积极的孢子形成的革兰氏阳性物种属于芽孢杆菌属革兰氏阴性的归属感假单胞菌。在这种情况下,最相关的隔离属于p .荧光,伯克不过组,b . amyloliquefaciens和b的仙人掌。我们的结果与早期提出的假设相一致,这群微生物是土壤中这种现象负责。此外,这是支持的报告Adesina et al。44)和Kuklinsky-Sobra et al。45),专注于soybean-associated南美地区的土壤。
虽然b的仙人掌和不过作为潜在PGPB隔离显示有趣的表型特点,我们决定不进一步分析他们的行为在种子接种以来化验区分农业生物农药和病原种类尚不清楚39,40]。因此,我们三个菌株特征如下:两个p .荧光BNM296 BNM297,b . amyloliquefaciensBNM340。
细胞壁降解活动似乎是负责的机制b . amyloliquefaciensBNM340对抗,因为几个酶活动(蛋白水解,chitinolytic和纤维素)被发现,也因为这一毒株排泄surfactin和一些iturin-like lipodepsipeptides,如iturin a。这些机制之前与抗真菌活性(4,46]。如前所述,假单胞菌(43),p .荧光对立与比发现机制更加多样化芽孢杆菌。发现的特征包括含铁细胞、挥发性化合物、抗生素等对PLT、细胞壁降解分子,细胞外的几丁质酶,蛋白酶酶,所有被证明参与敌对活动(4,27,28]。发现这些菌株之间的差异被BNM297 HCN的生产而不是BNM296和生产打印PLT BNM296但不是BNM297。我们测量了增强大豆早期发育试图将这些结果最重要的细菌属性(33,45]。尽管BNM296,除了生物防除属性,能够溶解磷酸,是不可能将这一结果与植物生长增强。期间产生的光环BNM296 PGPB的测定与这些菌株分析de Freitas et al。(9在根际细菌从油菜和大豆根际Bradyrhizobium菌株研究费尔南德斯et al。47]。自三个菌株能够产生茁长素的条件测试,虽然没有直接表明植物生长增强是由于他们的排泄,它更有可能的是,这种现象是由于这些物质的存在。此外,我们应该考虑被检测出大量的植物生长激素类似前所述PGPB的康等人p . chlororaphis(48)和伊德里斯等人b . amyloliquefaciens(49]。
大豆根际的殖民化的结果证实报道的交互b . amyloliquefaciens和假单胞菌菌株,支持他们使用根际殖民者(48,50,51]。
b . amyloliquefaciens从高BNM340-inoculated大豆植物保护p .最后侵扰,因为只有30%的幼苗出现在控制治疗。的存储和持久性芽孢杆菌土壤中使这株很好的候选人被包括在变质剂配方。
我们的结果指出p .荧光BNM296大豆早期生长促进剂。接种导致更健康和更大的植物。含氮量的增加显著,没有多少报道抗真菌菌株分享这个特征(46,52]。含氮量的增加可能是由于只对增加植物将固定氮的能力。
这一事实应变BNM297无法保护植物免受腐烂与相关化验的对抗,因为它有一个微弱的回应p .最后在培养皿中。抗生素生产BNM296和BNM297之间的差异可以解释为什么植物对接种反应不同,进一步验证筛选过程设计。尽管如此,所选菌株必须进行进一步的分析,如接种植物与其他病原体的挑战。
筛选过程证明是非常有效的。虽然我们没有建立直接的描述机制和保护之间的关系,这些菌株演示对腐烂,这项工作的主要目标是完成开始,它显示了一个有前途的菌剂的配方,包括土著细菌。这种类型的研究的现实意义获得其真正的重要性在考虑需要更换熏蒸剂和其他化学控制程序处理的土壤和/或植物病害。
确认
这项工作得到了通讯社的记者Nacional de Promocion Cientifica y Tecnologica(皮克特人10892),先涛公司Argentino-Brasileno de Biotecnologia(2004年CABBIO公关7),和Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas CONICET 5003 (PIP)。毫升和PMY CONICET的家伙。