文摘

硫化氢(H2S)最近被确认为一种内源性气体信号分子。本研究的目的是调查的影响H2在高葡萄糖- (HG)诱导ADAM17表达和sFlt-1生产3 t3-l1脂肪细胞。首先,我们发现HG DMEM调节ADAM17的表达和生产3 t3-l1 sFlt-1的脂肪细胞。推倒ADAM17减毒的影响高脂肪细胞葡萄糖sFlt-1生产。HG CSE的表达和3-MST减少,以及内生H2年代生产。此外,推倒CSE和ADAM17 3-MST显著提高表达和sFlt-1生产。添加外源H2通过管理的钠氢硫化物(硫氢化钠)抑制HG-induced upregulation ADAM17表达和sFlt-1生产。总之,减少表达CSE 3-MST和随后的减少H2年代生产导致高glucose-induced sFlt-1生产通过激活ADAM17脂肪细胞。外生H2年代供体硫氢化钠有糖尿病血管并发症的潜在治疗价值。

1。介绍

Macroangiopathic和microangiopathic并发症是糖尿病患者死亡的主要原因。几项研究已经表明,升高循环可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体1,也称为可溶性fms-like酪氨酸激酶1 (sFlt-1)是一个主要贡献者macroangiopathic和microangiopathic疾病的发展,如缺血性心脏病、慢性肾脏疾病、子痫前期(1- - - - - -3]。Wieczor等人的研究表明,生产sFlt-1显著调节在2型糖尿病(T2DM)病人体内外周动脉疾病患者(4]。在肥胖和妊娠期糖尿病(GDM),脂肪组织,而不是胎盘组织,被认为是sFlt-1水平升高的主要来源(5]。然而,脂肪组织是否sFlt-1水平升高的主要来源在2型糖尿病患者外周动脉疾病仍然是未知的。几项研究已经表明,sFlt-1可以摆脱ectodomain的跨膜Flt-1 disintegrin和金属蛋白酶10 (ADAM10)和ADAM17 [6,7]。在Raikwar等的研究8),超表达ADAM17增加Flt-1解理而击倒ADAM17减少Flt-1乳沟建议ADAM17负责ectodomain Flt1脱落。直到现在,sFlt-1 ADAM17的表达和释放的脂肪细胞暴露于高葡萄糖仍有待阐明。

硫化氢(H2,最近发现气体传感器,可以在广泛的组织生产活动的胱硫醚-γ裂合酶(CSE)、胱硫醚-β合成酶(CBS), 3-mercaptopyruvate硫转移酶(3-MST) [9]。之前的研究表明,H2有抗炎、抗氧化应激、proangiogenesis和内皮保护属性在不同组织(10- - - - - -12]。在脂肪组织和脂肪细胞,CSE, CBS, 3-MST识别(13,14]。锅等。15)已经证明,大量葡萄糖抑制CSE的表达和生产的H2在脂肪细胞。然而,高葡萄糖是否会影响两个H的表达2CBS和3-MST S-generating酶,脂肪细胞仍然是未知的。H的影响2年代高glucose-induced ADAM17的异常表达和生产sFlt-1还需要进一步调查。在目前的研究中,我们假设H2年代可能参与调制高glucose-induced ADAM17在脂肪细胞表达和sFlt-1生产。测试,我们首先研究了ADAM17的表达和生产sFlt-1 3 t3-l1脂肪细胞暴露于高葡萄糖。然后,我们确认的角色ADAM17 sFlt-1释放脂肪细胞使用核方法。的影响,H2年代高glucose-induced ADAM17的异常表达,增加生产sFlt-1调查。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

3 t3-l1细胞(细胞银行、上海生命科学研究院、中国科学院)培养在high-glucose (HG) DMEM (Gibco)含10%新生小牛血清(Gibco) 37°C 5% - 95%二氧化碳空气。实现confluency三天后,细胞在含有10% (HG DMEM孵化v/v胎牛血清(的边后卫)(Gibco),补充了100 milliunits /毫升胰岛素,更易与0.5 l 3-isobutyl-1-methylxanthine(σ)和1.0μmol / l地塞米松(σ)2天。细胞被放置在HG DMEM包含10%的边后卫,与胰岛素补充,但没有任何其他补充额外的2天,允许3 t3-l1细胞分化成成熟的脂肪细胞。媒体取代每2天之后直到> 85%的细胞中脂滴。在实验潜伏期3 t3-l1脂肪细胞孵化了低糖DMEM (LG)含有10% (v/v)的边后卫。

2.2。药物治疗

LG DMEM包含5.5 l更易与葡萄糖,HG DMEM包含25.0更易与葡萄糖/ l。硫氢化钠(σ)溶解在PBS。TAPI-1 (MCE)溶解在二甲亚砜(DMSO)。后7 - 10天的分化,3 t3-l1脂肪细胞无血清培养系统处理LG DMEM或血清HG DMEM 24 h。以确定的影响2年代,细胞无血清培养系统处理含硫氢化钠HG DMEM (10μ25米,μ50米,μ米)或无血清HG DMEM硫氢化钠24 h。阻止ADAM17功能,细胞无血清培养系统处理HG DMEM含有非特异性免疫球蛋白或anti-ADAM-17单克隆抗体(D1 (A12)) 24小时。抑制ADAM17功能,细胞无血清培养系统处理HG DMEM包含DMSO溶液或20μM TAPI-1。

2.3。RNA干扰

小干扰rna (siRNAs) CSE, 3-MST,设计并合成和ADAM17 GenePharma公司(上海,中国)。本研究中使用的核在补充说明(见表S1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/9501792)。控制核炒序列没有任何特定的目标。3-MST击倒CSE的表达,和ADAM17,培养3 t3-l1脂肪细胞转染CSE, 3-MST和ADAM17 siRNAs和消极的控制(数控)核使用Lipofectamine™2000(表达载体)24 h。

2.4。实时H2年代生产测量

培养细胞被刮掉的板冷的存在里帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏,印第安纳波利斯)。在4°C溶解产物很快被离心机10分钟,和上层清液被收集。然后实时动力学H2年代生产是由使用一个小型H2年代microrespiration传感器(H模型2S-MRCh Unisense,丹麦奥尔胡斯)耦合Unisense PA2000放大器(16]。简单,测量了温控microrespiration室(Unisense)。1.0传感器信号稳定后,更易与l半胱氨酸(σ)和1.0更易与l pyridoxal-5′磷酸(σ),酶的辅因子CBS和CSE补充道。H2年代生产速度然后确定初始陡斜坡上的每一个痕迹。

2.5。免疫印迹分析

培养细胞被刮掉的板的存在冷radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏,印第安纳波利斯)。在4°C溶解产物很快被离心机10分钟。上层清液的收集和蛋白质浓度使用BCA化验分析设备(Beyotime)。30μ克蛋白质样品由10%或15% sds - page分离,随后转移到硝化纤维膜。堵塞2小时后,膜抗体孵育CBS, CSE, 3-MST ADAM17,β肌动蛋白在一夜之间在4°C。膜被清洗和孵化中等辣根过氧化物酶,(合)共轭抗体(Santa Cruz)。西方化学发光免疫反应性的蛋白质是可视化使用止动剂合衬底(默克密理博)和Tanon 5200多扫描仪。带强度的比值β肌动蛋白得到量化的相关蛋白质表达水平。

2.6。ELISA分析sFlt-1

细胞培养媒体从不同治疗组是收获。sFlt-1文化媒体的内容是由酶联免疫试剂盒(Westang生物技术有限公司、上海、中国)根据制造商的指示。450纳米波长的吸光度测量与Denley龙Wellscan可3(热)。

2.7。统计分析

数据提出了均值±SEM。所有数据进行方差齐性Bartlett的测试之前分析的意义。个人比较是由单向方差分析之后,至少显著差异(LSD)t以及数据的正态分布。在所有的测试中, 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。高葡萄糖上调ADAM17表达和sFlt-1生产3 t3-l1脂肪细胞

ADAM17已经证明负责跨膜蛋白水解过程Flt-1 sFlt-1。在脂肪细胞治疗与LG DMEM和HG DMEM ADAM17的蛋白表达是由西方墨点法。如图1(一)ADAM17 pro-ADAM17和活跃的蛋白表达显著增加3 t3-l1脂肪细胞暴露于汞DMEM。sFlt-1内容在媒体培养酶联免疫试剂盒测定。如图1 (b)、治疗3 t3-l1脂肪细胞与HG DMEM sFlt-1刺激生产。

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图1
高葡萄糖ADAM17的表达效果和生产的sFlt-1 3 t3-l1脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞治疗与LG DMEM或HG DMEM 24 h。(a)的影响高葡萄糖pro-ADAM17的蛋白表达和活性ADAM17 3 t3-l1脂肪细胞。pro-ADAM17的蛋白表达和活性ADAM17 3 t3-l1脂肪细胞是由西方墨点法中描述的材料和方法。代表蛋白质乐队提出的相应的直方图。(b)的影响高葡萄糖sFlt-1的生产。生产sFlt-1在媒体上被ELISA测定。数据提出了均值±SEM ( 文化)。 与表示。
3.2。高葡萄糖刺激sFlt-1生产通过增加ADAM17表达式3 t3-l1脂肪细胞

然后我们调查的角色ADAM17 sFlt-1版本3 t3-l1脂肪细胞暴露于汞DMEM使用核方法。转染的细胞和ADAM17 siRNA显著减少pro-ADAM17引起的表达和活性ADAM17表达式(图2(一个))。如图S1、高葡萄糖增加ADAM17表达式3 t3-l1脂肪细胞转染数控核和转染ADAM17 siRNA ADAM17表达式3 t3-l1减少脂肪细胞暴露于汞DMEM。如图2 (b)3、高葡萄糖增加sFlt-1生产t3-l1脂肪细胞转染数控核,和高葡萄糖sFlt-1生产的影响并不是发生在3 t3-l1和ADAM17 siRNA脂肪细胞转染。

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图2
影响高葡萄糖sFlt-1生产ADAM17击倒3 t3-l1脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞转染和小干扰rna暴露于LG DMEM数控,小干扰rna暴露于汞DMEM数控,或HG DMEM ADAM17 siRNA暴露。(a)代表蛋白质群pro-ADAM17和活跃的ADAM17 3 t3-l1脂肪细胞转染数控核和ADAM17 siRNA HG DMEM。3 t3-l1 ADAM17脂肪细胞的蛋白表达是由西方墨点法。(b)的影响高葡萄糖sFlt-1生产ADAM17击倒3 t3-l1脂肪细胞。生产sFlt-1在媒体上被ELISA测定。数据提出了均值±SEM ( 文化)。 , 与表示。

进一步证实ADAM17 sFlt-1生产的作用,脂肪细胞治疗与anti-ADAM-17单克隆抗体(D1 (A12))或ADAM17抑制剂TAPI-1。如图3,高葡萄糖sFlt-1生产的影响并不是发生在ADAM17-blocked或抑制3 t3-l1脂肪细胞。

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图3
高葡萄糖对ADAM17-blocked sFlt-1产量的影响或抑制3 t3-l1脂肪细胞。(a)的影响高葡萄糖sFlt-1生产ADAM17-blocked 3 t3-l1脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞治疗与LG DMEM含有非特异性免疫球蛋白或HG DMEM含有非特异性免疫球蛋白或HG DMEM包含anti-ADAM-17单克隆抗体(D1 (A12))。(b)的影响高葡萄糖sFlt-1生产ADAM17-inhibited 3 t3-l1脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞治疗与LG DMEM包含DMSO溶液或HG DMEM包含DMSO溶液或包含TAPI-1 HG DMEM。生产sFlt-1在媒体上被ELISA测定。数据提出了均值±SEM ( 文化)。 与表示。
3.3。高葡萄糖会使CSE 3-MST表达式,以及H2年代生产3 t3-l1脂肪细胞

据报道,高葡萄糖下调CSE表达式和H2在组织生产。为了证实CSE的表达和H的生产2并确定哥伦比亚广播公司(CBS)的表达,3-MST在脂肪细胞暴露于高葡萄糖,哥伦比亚广播公司(CBS)的蛋白表达,CSE, 3-MST取决于西方墨点法。如图1,HG DMEM表达下调的蛋白质表达CSE(图4(一))和3-MST(图4 (b))。之间没有显著差异在哥伦比亚广播公司(CBS)表达式低葡萄糖和高glucose-treated脂肪细胞(图4 (c))。我们还确定实时H2年代生产脂肪细胞暴露于LG DMEM和HG DMEM。如图S2,实时H2年代产量明显减少脂肪细胞治疗高葡萄糖。

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图4
高葡萄糖对CSE的表达的影响,3-MST, CBS在3 t3-l1脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞治疗与LG DMEM或HG DMEM 24 h,然后,CSE的蛋白表达,3-MST,哥伦比亚广播公司(CBS)是由西方墨点法中描述的材料和方法。上面板,代表乐队CSE的蛋白表达,3-MST, CBS在3 t3-l1脂肪细胞与LG DMEM或HG DMEM治疗。降低电池板,CSE的蛋白质表达的累计数据,3-MST, CBS在3 t3-l1脂肪细胞与LG DMEM或HG DMEM治疗。数据提出了均值±SEM ( 文化)。 与表示。
3.4。CSE核和小干扰rna表达上调ADAM17 3-MST sFlt-1生产3 t3-l1脂肪细胞

然后,我们调查是否减少CSE和3-MST表达有助于高葡萄糖的影响ADAM17 3 t3-l1脂肪细胞表达和sFlt-1生产核方法。如图S3,转染减少引起的CSE siRNA CSE表达和转染引起的3-MST siRNA减少3-MST表达式3 t3-l1脂肪细胞暴露于LG DMEM。如图5,CSE siRNA或3-MST siRNA导致增加的表达ADAM17 sFlt-1 (a - b)和生产(c - d) 3 t3-l1脂肪细胞暴露于LG DMEM。

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图5
减少CSE和3-MST表情的表达ADAM17和生产3 t3-l1 sFlt-1的脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞转染与负控制(数控)核,CSE siRNA或3-MST siRNA 24 h。(a和b)的影响减少CSE (a)和3-MST (b)表达的蛋白表达pro-ADAM17和活跃的ADAM17 3 t3-l1脂肪细胞。pro-ADAM17的蛋白表达和活性ADAM17 3 t3-l1脂肪细胞是由西方墨点法中描述的材料和方法。代表蛋白质乐队提出的相应的直方图。(c和d)的影响减少CSE (c)和3-MST (d)表情sFlt-1的生产。生产sFlt-1在媒体上被ELISA测定。数据提出了均值±SEM ( 文化)。 , 与表示。
3.5。硫氢化钠抑制高Glucose-Induced Upregulation ADAM17表达和sFlt-1生产3 t3-l1脂肪细胞

在我们之前的研究中,我们已经表明,H2年代供体硫氢化钠抑制ADAM10表达和sFlt-1在胎盘细胞释放。ADAM10和ADAM17负责ectodomain Flt1脱落。我们发现ADAM17在脂肪细胞表达而ADAM10并不表示在脂肪细胞通过PCR检测和免疫印迹分析ADAM10(数据没有显示)。为了证实H的角色2年代高glucose-induced upregulation ADAM17表达式3 t3-l1脂肪细胞,培养3 t3-l1脂肪细胞处理高含硫氢化钠葡萄糖DMEM 24 h,常用的外源供体h2年代,然后,pro-ADAM17 ADAM17表达式是由西方墨点法和活跃。如数据所示6(一)和6 (b)、治疗3 t3-l1脂肪细胞与硫氢化钠(25 - 50海里)可能导致减少pro-ADAM10和活跃ADAM10剂量依赖性的方式表达。sFlt-1酶联免疫试剂盒测定培养上清液中的硫含量。如图6 (c)、治疗3 t3-l1脂肪细胞与硫氢化钠(25 - 50海里)可能导致减少sFlt-1以剂量依赖性的方式生产。

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图6
影响硫氢化钠高glucose-induced upregulation ADAM17表达和sFlt-1生产3 t3-l1脂肪细胞。3 t3-l1脂肪细胞治疗与HG DMEM含硫氢化钠浓度的增加24 h。(a和b)的影响在高硫氢化钠glucose-induced upregulation ADAM17的表达式。3 t3-l1 ADAM17脂肪细胞的蛋白表达是由西方墨点法。代表蛋白质乐队提出的相应的直方图。(c)的影响硫氢化钠高glucose-induced upregulation sFlt-1生产3 t3-l1脂肪细胞。生产sFlt-1在媒体上被ELISA测定。数据提出了均值±SEM ( 文化)。 , 与表示。

4所示。讨论

目前的研究表明,减少CSE的表达和3-MST引起高葡萄糖显著刺激sFlt-1生产通过ADAM17激活脂肪细胞。H2供体硫氢化钠抑制ADAM17的表达和生产sFlt-1高葡萄糖诱导的脂肪细胞。

也称为可溶性VEGFR-1 sFlt-1,是一种抗血管新生因子。当与VEGF-A形成复合物,sFlt-1 VEGF-A生物活性降低,从而导致负面影响血管生成和内皮功能障碍。高架sFlt-1被发现参与macroangiopathic和microangiopathic疾病的发展因为这个因素作为VEGF与膜结合受体拮抗剂通过使其不可用信号,从而导致内皮功能障碍(1- - - - - -3]。Wieczor et al。4]在T2DM病人中发现sFlt-1生产复杂与外周动脉疾病高于非糖尿病患者外周动脉疾病患者。Lappas [5)表明,脂肪组织的主要来源是在肥胖和GDM sFlt-1水平升高。然而,sFlt-1生产在2型糖尿病患者脂肪组织仍有待阐明。在目前的研究中,我们发现高脂肪细胞葡萄糖显著增加sFlt-1生产。

许多可溶性蛋白质是来源于ectodomain跨膜的形式通过蛋白水解过程通过特定的“sheddases”,如基质金属蛋白酶(MMPs) (17,18)和亚当斯(19- - - - - -21]。ADAM10和ADAM17是两个重要的“sheddases”参与蛋白水解过程的跨膜Flt-1 sFlt-1 [6- - - - - -8]。根据我们的PCR检测和免疫印迹分析,ADAM17在脂肪细胞表达而ADAM10不是脂肪细胞表达的(数据没有显示)。ADAM17,也称为栓塞(肿瘤坏死因子-α转化酶),能够坚持多种基质包括淀粉样前体蛋白、肿瘤坏死因子-α(22),切口(23),和其他受体,以及许多生长因子,细胞因子和细胞粘附分子24,25]。周等人的研究表明,跨膜TNF -α几乎完全proteolytically加工成sTNF -α通过激活ADAM17[高葡萄糖26]。这强烈的证据表明高葡萄糖ADAM17激活脂肪细胞。在目前的研究中,我们表明,高脂肪细胞葡萄糖ADAM17表达明显增加。此外推倒ADAM17废除高葡萄糖sFlt-1生产脂肪细胞的影响。此外,高葡萄糖sFlt-1生产的影响并不是发生在ADAM17-blocked或抑制3 t3-l1脂肪细胞。这些结果表明,ADAM17参与跨膜的蛋白水解过程Flt-1 sFlt-1诱导高葡萄糖。

直到现在,机制负责ADAM17表达的增加和生产的sFlt-1脂肪细胞仍不明朗。我们之前的研究已经表明H2年代显著抑制sFlt-1从胎盘细胞并释放这种效应与脱落过程的抑制Flt-1 [7]。H2年代可以产生大范围的组织通过合酶酶的活动包括CSE, CBS, 3-MST [9]。我们的研究结果表明,CSE 3-MST, CBS在脂肪细胞中都有表达,与先前的研究结果一致(13,14]。在脂肪细胞(15和人类脐静脉内皮细胞25)、高葡萄糖显著抑制CSE的表达和生产的H2美国在目前的研究中,我们发现高葡萄糖减少CSE的表达和3-MST,以及内生H2生产,但CBS表达不受高葡萄糖。这些结果表明,降低H2生产和CSE, 3-MST表达式可能会刺激ADAM17的表达和sFlt-1在脂肪细胞的生产。在此基础上,我们发现推倒CSE和ADAM17 3-MST显著提高表达和sFlt-1生产脂肪细胞。这些结果表明,CSE的减少表现和ADAM17 3-MST有助于升高在脂肪细胞表达和sFlt-1生产。

上述研究结果的基础上,包括减少的表达CSE 3-MST,以及内生H2年代生产脂肪细胞暴露于高葡萄糖,我们推测,外生的H2年代可能减弱高glucose-induced ADAM17表达式和sFlt-1生产。硫氢化钠是一种广泛使用捐赠者的外生H2当溶解在溶液中,硫氢化钠迅速水解Na+和海关−。在这之后,海关−同事与H+生产H2美国在目前的研究中,我们的研究结果表明,硫氢化钠,捐赠者的外生H2的年代,显著抑制高glucose-induced upregulation ADAM17在脂肪细胞表达和sFlt-1生产。这些结果表明,H2年代直接影响ADAM17在脂肪细胞表达和sFlt-1生产。它还提出了一种可能性的使用硫氢化钠作为一个潜在的治疗代理高glucose-induced ADAM17表达式和sFlt-1生产。尽管高葡萄糖在H的抑制效应2已经证明了S生产几种不同类型的细胞(15,27,28),负责高葡萄糖H的机制2合酶仍不清楚。据报道,高葡萄糖抑制H2年代生产通过TLR4炎症途径在小鼠系膜细胞(28]。此外,几个小分子核糖核酸的表达,包括mir - 192 (29日],mir - 204 [30.],mir - 217 (31日),被高葡萄糖调节。根据网站上的生物信息学分析“TargetScan”, mir - 192的预测目标基因和mir - 204 CSE, mir - 217的预测目标基因是哥伦比亚广播公司。这些表明,高葡萄糖可能通过米尔调节通路。然而,TLR4炎症通路和米尔通路是否参与调制效应的高葡萄糖在H2年代合酶需要进一步调查。更多的是H的实际效果2年代高glucose-induced sFlt-1生产和ADAM17表达于脂肪组织在未来应该调查体内。

5。结论

综上所述,我们的研究结果表明,H2合酶酶CSE和3-MST发挥关键作用的调制sFlt-1生产和ADAM17脂肪细胞中表达。减少表达CSE和3-MST有助于高glucose-induced sFlt-1生产通过激活ADAM17脂肪细胞。本研究还提出了一种可能性的使用硫氢化钠作为一个潜在的治疗代理糖尿病血管并发症。需要额外的研究来证实这些发现体内。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

王Tian-xiao胡锦涛和帮派贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的医学科技创新的主题南京地区(没有。14 zx30)和杭州的卫生科技计划(没有。2016 b56)。

补充材料

Table.S1。CSE的siRNA序列,3-MST ADAM17。Fig.S1。高葡萄糖的影响pro-ADAM17 (A)和active-ADAM17 (B)表达并不发生在3 t3-l1 ADAM17-siRNA脂肪细胞转染。3 t3-l1 ADAM17脂肪细胞的蛋白表达是由西方墨点法中描述的材料和方法。数据提出了均值±SEM (n = 3文化)。* * * P < 0.05, P < 0.01 vs表示。Fig.S2。高的影响在脂肪细胞葡萄糖实时硫化氢生产。实时硫化氢产量明显减少脂肪细胞治疗高葡萄糖。 The real-time H2S production in adipocyte was determined by using aminiaturized H2S micro-respiration sensor. Fig.S3. Representative protein bands of CSE(A) and 3-MST(B) in 3T3-L1 adipocytes transfected with CSE-siRNA and 3-MST-siRNA. The protein expression of CSE and 3-MST in 3T3-L1 adipocytes were determined by western-blotting as described in materials and methods.

  1. 补充材料
  2. 补充材料