同时人体内25 -羟维生素D的量化₃和24,25-Dihydroxyvitamin D₃在老鼠身上显示了强烈的血清和脑组织水平之间的相关性

文摘

而维生素D₃被认为是刺激神经组织的类固醇影响大脑发育和功能,有效的分析方法在确定维生素D₃脑组织的代谢产物仍然缺乏,维生素D的关系₃血清和大脑之间的地位仍然是难以捉摸的。因此,我们开发了一种新颖的分析方法通过使用高效液相chromatography-tandem质谱(HPLC-MS / MS)同时量化人体内25 -羟维生素D的浓度₃(25 (OH) D₃)和24日25-dihydroxyvitamin D₃(24、25 (OH)₂D₃美联储)大鼠血清和大脑的不同剂量的维生素D₃。我们进一步研究了血清维生素D是否变化₃代谢物可能影响维生素D₃在大脑中代谢物水平。分析了血清和脑组织HPLC-MS /喷雾电离与4-phenyl-1衍生化后的女士,2,4-triazoline-3, 5-dione (PTAD)。方法是高度敏感的,具体、准确量化25 (OH) D₃,24日,25 (OH)₂D₃在动物的脑组织。维生素D₃在脑组织代谢物显著降低与维生素D缺乏饮食喂养的老鼠比老鼠喂食高维生素D₃饮食。也有很强的相关性的维生素D₃在大脑血清和代谢物。这些结果表明,维生素D₃血清维生素D的影响生物利用度的地位₃在大脑中代谢物。

1。介绍

维生素D是牵连到许多疾病如癌症、免疫功能和心血管疾病除了建立角色在矿物平衡和调节骨骼健康1- - - - - -3]。新兴的研究还表明,维生素D缺乏可能发挥重要作用在中枢神经系统(CNS)疾病,如抑郁症、帕金森病、癫痫(4- - - - - -6]。维生素D的无知状态和概要文件脑组织中导致一个障碍在理解病理生理学作用在中枢神经系统的维生素D。目前,新陈代谢、存储和维生素D在脑组织功能仍然模棱两可的大脑由于缺乏信息分布的维生素D代谢产物和血清维生素D水平之间的相关性和大脑。

维生素D实际上包含两个不同的化合物,维生素D₃和维生素D₂。营养足够量的维生素D₃通常是皮肤biosynthesized 7-dehydrocholesterol通过紫外线照射后,也是吸收从饮食7]。血清维生素D的水平₂(这是完全来自植物来源)及其代谢产物通常不到十分之一的维生素D₃及其代谢产物(8]。因此,量化的维生素D₃及其在血清代谢物被广泛用作意味着评估维生素D的状态。一次循环,维生素D₃是人体内25 -羟维生素D转化为₃(25 (OH) D₃)在肝脏,它随后被转化为生物活性1α,25-dihydroxyvitamin D₃(1α25 (OH)₂D₃)在肾7]。1的半衰期α25 (OH)₂D₃(只有4 - 8 h)相比,短的半衰期25 (OH) D₃(2 - 3周),25 (OH) D₃维生素D的最佳指标是什么₃状态,因为它反映了所有维生素D供应来源而1的水平α25 (OH)₂D₃由矿物质代谢参数(严格监管9]。25 (OH) D₃通过转换成24被认为是无效的,25 (OH)₂D₃在人体内25 -羟维生素D 24-hydroxylase [10]。虽然只有25 (OH) D₃的定量提供临床相关信息,24日,25 (OH)₂D₃可以提供重要信息的维生素D代谢的研究环境。

很多都采取了维生素D的分析₃近年来在血清代谢物。气相色谱法(GC)质谱(MS)已被应用于维生素D₃代谢物量化(11]。然而GC分析中使用的高温经常导致烟花和异丙酯同分异构体的代谢产物的形成和降解代谢产物的风险,这可以避免了液相色谱-基于LC - MS / MS方法(12]。考虑到分析也遭受贫穷的准确性,重复性差,测量和干扰,国家对话的维生素D状态由美国国立卫生研究院的膳食补充剂办公室已经确定质/ MS方法作为首选方法(13]。然而,维生素D的分析₃代谢物仍是一个挑战,由于贫困引起的电离效率缺乏得极组。衍生化技术已经发展到提高维生素D的电离效率₃代谢物来提高检测的响应(14]。代表Cookson-type试剂、4-phenyl-1 2 4-triazoline-3, 5-dione (PTAD)商用,可以定量反应s-cis-diene维生素D的₃代谢物和减少干扰7,15]。

由于维生素D信号在大脑功能和发展中扮演不可或缺的角色4,16,17),发现维生素D是否具有重要意义₃脑组织代谢物水平改变与血清当老鼠有饮食中缺乏维生素D₃。调查研究维生素D₃在老鼠的脑组织和血清代谢物水平与不同的维生素D₃饮食可能提供一个新的认识,以便更好地理解的维生素D的关系₃状态之间的末梢循环和中枢神经系统。然而,前面分析的维生素D₃血清中代谢产物表现出低敏感性[15]。简单的提取方法和更敏感的检测方法,因此,必需的。在这项工作中,我们研究了大鼠不同水平的维生素D₃饮食。HPLC-MS / MS方法开发的同时分析这些化合物在大鼠血清和大脑样本。分析了数据访问相关的维生素D₃脑组织和血清代谢物水平第一次。我们进一步研究了水平脑组织中是否会同步变化与大鼠的血清水平与不同的维生素D₃饮食。

2。材料和方法

2.1。化学物质

使用12 VDC RO水净化+ DI水试剂级水净化系统解决方案,Inc .(碧玉,格鲁吉亚,美国)。HPLC-grade乙腈(AcN)和甲醇(甲醇)从默克公司(达姆施塔特,德国)和购买HPLC-grade甲酸(FA)从罗伊科学Inc .(美国德圣纽瓦克)。25 (OH) D的标准₃,24日,25 (OH)₂D₃从ApexBio购买技术有限责任公司(美国波士顿)。氘内部标准(是)d6-25 (OH) D₃是来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。PTAD获得从东京化工有限公司(日本东京)作为衍生试剂。

2.2。样品收集

六个Sprague-Dawley老鼠从实验动物中心获得第二湘雅医院。老鼠在12/12光/暗周期在环境温度(20−22°C)和3动物每笼。老鼠被随机分为3组(6):低维生素D₃(LVD)、正常的维生素D₃(NVD)和高维生素D₃(HVD)。所有的动物喂养饮食包含10 000 IU /公斤(HVD)或1000 IU /公斤(NVD)或0 IU /公斤(LVD)维生素D₃(1 IU = 40μg)为6周。静脉穿刺获得的血然后在3000 g×10分钟离心分离血清和血细胞。牺牲后,大脑被移除的头骨在冰上。血清和大脑在干冰冷冻和储存在−80°C到分析。

2.3。样品制备

2.3.1。大脑样本

细解冻后,1毫升AcN和10μL是解决方案(包含d6-25 (OH) D₃在AcN 100 ng / mL)被添加到90毫克的老鼠大脑组织,使用组织和混合均质均质器避免光。涡5分钟后,混合物在4°C离心10分钟15 000×g。上层清液(800μ然后将L)转移到另一个埃普多夫管,随后干氮气。剩下的来自不同脑组织匀浆池是QC样品的方法验证大脑。衍生化100μL PTAD解决方案(1毫克/毫升在AcN)添加到残留其次是30年代的漩涡和3分钟的离心15 000 g在4°C。混合物在室温下过夜反应避免光。

2.3.2。血清样本

鼠血清样品制备是改编自发表人类血清的方法(18]。简单地说,200年μ血清L与600年了μL AcN和10μL是解决方案(包含d6-25 (OH) D₃在AcN 100 ng / mL)。混合物vortex-mixed 3分钟,离心机在4°C 10分钟15 000×g。一批血清和QC样品混合血清的方法验证。上层清液(650μ然后将L)转移到另一个埃普多夫管,随后干下氮。100年μL PTAD解决方案(1毫克/毫升在AcN)添加到衍生的残渣。然后混合物喜忧参半,离心机,反应在室温下隔夜如上所述。

2.4。色谱和质谱

用日本岛津公司执行分离LC-20AD色谱仪(日本岛津公司公司,日本京都)。样本在autosampler在4°C瓶,和5μL样本注入在列。的热Accucore C18柱(2.6μ米、100×4.6毫米,热费希尔科学公司。沃尔瑟姆,美国马)保持在35°C。水相包含0.1% FA是去离子水作为修饰符。有机相B甲醇100%。开始梯度条件39% / 61% B从0到1分钟,达到14% / 86% B 2分钟和维护5.5分钟,然后回到39% / 61% B在8分钟,平衡和保留3.5分钟。流量被设定为0.3毫升/分钟。MS / MS分析,QTRAP 4000质谱仪是操作在电喷雾电离(ESI)正离子多反应监测(MRM)模式与窗帘气体设置为25 psi,离子枪电压5000 V,源温度设置为600°C,气体离子源设置为170 psi,气体离子源设置为270 psi, declustering潜在设置为80 V,潜在入口设为10 V,碰撞细胞退出潜在设为10 V。其他复合特定设置表中列出1。

2.5。方法验证

2.5.1。制备标准曲线和线性范围

通过溶解在AcN分析物,25 (OH) D股票的解决方案₃(1.0毫克/毫升),24日,25 (OH)₂D₃(0.2毫克/毫升)准备,然后在AcN进一步稀释到适当的浓度制备的校准曲线。标准曲线制备100% AcN,分析了在相同的运行分析。脑组织的水平25 (OH) D的标准曲线₃分别为0.39,0.98,3.91,5.86,78.13,195.31,937.50,和1250.00 ng / mL, 24日,25 (OH)₂D₃分别为0.47,0.78,3.13,7.81,62.50,93.75,500.00,和1000.00 ng / mL。的水平血清25 (OH) D的标准曲线₃分别为0.10,0.21,1.04,5.21,52.08,197.92,833.33,和1000.00 ng / mL, 24日,25 (OH)₂D₃分别为0.25,0.50,2.08,7.92,50.00,100.00,200.00,和333.33 ng / mL。确定方法的线性范围,八个水平(,每个浓度水平)的校准样品制备和分析如上所述。

2.5.2。检测和量化的极限

检测的极限(LOD)和量化的限制(定量限)被定义为给信号噪声比的山峰3:1和10:1,分别一式三份。

2.5.3。精密度和准确度

确定精度和准确性,内生的维生素D水平₃血清代谢物在大脑和QC样品进行了分析。QC样品准备遵循同样的步骤给低,中,高浓度的分析物。800年μL 200年脑匀浆或上层清液μL血清上升了10μ和10 L的解决方案μL的具体标准溶液生成校准水平覆盖范围的分析物(表3),分别。日内精密度和准确度的计算是通过分析质量控制样品在三个浓度(同一天,在每个浓度水平)。interday精度和准确度分析三个浓度测定五个复制连续三天。精度计算变异系数(CV)的盘中,interday分析结果。根据以前的研究报告,每个分析物的准确性是决定复苏的QC样品在三个层次15,19]。每个分析物的准确性评估通过比较QC样品的区别和平均水平的混合添加空白和样品的标准。

2.5.4。基体效应

基体效应的评价(我),实验根据以前的工作20.,21]。飙升的样本由已知数量的激增到200标准μL提取混合血清或800年μL脑匀浆上清液。分析物的添加浓度和QC样品一样。和校准器的解决方案在AcN同一水平的标准QC样品也准备好了()。化合物的峰面积比值的增加与各自的面积比以校准器的解决方案被添加相同水平的标准。基体效应的计算如下:

2.6。统计分析

数据采集是由分析师1.6.1软件(AB Sciex)。方法验证结果的统计分析,包括计算的意思是,标准差和变异系数进行使用Microsoft Excel。使用最小二乘法线性回归分析被用来评估每个分析物的校准曲线。协会组织和血清中分析物之间使用皮尔逊相关系数进行评估。大脑和血液的比率分析物被单向方差分析和评估Dunnett事后测试用SPSS软件(版本18.0)。统计学意义是截止。

3所示。结果

3.1。色谱和质谱条件

据此前报道,有针对性的分析物在此产生了更强的信号使用电喷雾离子源在积极模式。因此,所有的维生素D代谢产物被发现在MRM模式。每个质量的碰撞能量优化过渡(表1)。每个转换建立的停留时间是100 ms。该方法的特异性是由AcN是补充道。没有干扰观察到25 (OH) D的保留时间₃-PTAD, 24日,25 (OH)₂D₃-PTAD(图1)。代表MRM色谱25 (OH) D₃-PTAD, 24日,25 (OH)₂D₃-PTAD, d6-25 (OH) D₃-PTAD在血清和脑组织匀浆数据所示2和3。25 (OH) D生产质谱₃-PTAD, 24日,25 (OH)₂D₃-PTAD图所示4。

3.2。线性、定量限、精密、准确和基体效应

所有标准曲线显示良好的线性在脑匀浆和血清。标准曲线的方程,相应的线性回归系数,线性范围见表2。因为目标分析物是内源性代谢物,定量限测定标准的混合物。每个分析物的定量限的结果见表2。

盘中的数据精度,interday精度,和恢复分析总结在表3对所有分析物在大脑和血清。表达的精度是CVs范围从2.5%到12.9%,盘中精度和interday精度从1.2%降至3.3%。精度是由复苏。标准的值精度和CVs的QC样品也表所示3。

25 (OH) D的基体效应₃范围从3.1−−5.3在血清和范围从4.1−−8.1的大脑。24日,25 (OH)₂D₃,矩阵的影响范围从3.2−−4.3在血清和范围从3.6至6.6−−在大脑。结果表明微不足道的基体效应在目前的方法。

3.3。维生素D的分析₃在血清和脑组织代谢物

HPLC-MS / MS方法用于25 (OH) D的同时测定₃,24日,25 (OH)₂D₃在老鼠的脑组织匀浆和血清。结果总结在表4。血清25 (OH) D水平₃,24日,25 (OH)₂D₃显著增加从LVD NVD组和HVD组最高。脑组织中,也有类似的增加维生素D₃代谢物组。与正常补充维生素D的组相比,无统计差异的25 (OH) D₃大脑/血清比率在不同的团体,以及24日25 (OH)₂D₃脑/血清比率。大脑和血清25 (OH) D的比值₃/ 24、25 (OH)₂D₃不同的团体也分析NVD组相比,并无统计差异被发现。

3.4。协会的分析物在血清和脑组织

线性回归用来分析水平的维生素D₃代谢物之间的血清和脑组织。25 (OH) D之间的显著相关性被发现₃,24日,25 (OH)₂D₃血清中水平(图5(一个),)。与此同时,也有25 (OH) D的线性相关性₃,24日,25 (OH)₂D₃水平在大脑(图5 (b),)。同样,线性回归分析还表明,25 (OH) D₃在血清和大脑在总样本(图高度相关5 (c),)。24岁的水平25 (OH)₂D₃在血清和大脑也显著相关(图5 (d),)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们设计了一种新的同步方法测量25 (OH) D₃,24日,25 (OH)₂D₃在脑组织和血清。通过使用这种方法,我们分析了维生素D₃代谢物的老鼠喂不同的维生素D₃剂量。据我们所知,这是第一个研究表明维生素D₃代谢物的大脑可能会影响维生素D₃饮食与血清有紧密的关联。

发达质/ MS方法被证明是高度敏感的,具体、准确量化25 (OH) D₃,24日,25 (OH)₂D₃首次在动物脑组织。Lipkie等人描述的过程涉及的液/液萃取一步纯化鼠软组织的分析物,虽然没有令人满意的复苏25 (OH) D₃实现(22]。在我们的工作中,我们使用一个简单的样品制备过程达到高效提取的维生素D代谢产物。同时,使用PTAD Cookson-type试剂可与共轭二烯反应系统的维生素D代谢产物,导致了大约100倍增加分析的反应。Aronov等人研究了25 (OH) D的衍生化率₃在室温下与PTAD [15]。根据一项符合一级动力学模型,25 (OH) D₃小于1分钟。因此> 99%的收益率的衍生产品在一夜之间实现在室温下反应在我们的方法。此外,他们还发现,增加PTAD浓度超过2毫克/毫升导致产量下降。因此,1毫克/毫升PTAD选择在我们的工作。最近的研究表明,两个异构体,6 s和6 r是由与PTAD因为衍生化试剂的反应s-cis-diene一半的α——β方和的比值大约是4:1 (23]。因此,有两个山峰为MRM离子色谱图中的每个化合物。在这种情况下,主要的峰值6 s同分异构体是用于集成和量化。

正如上面提到的,越来越多的证据牵连,缺乏维生素D在中枢神经系统疾病中起着重要的作用24,25]。因此,有必要找出血清维生素D的关系₃地位和它的大脑的浓度。在这个研究中,我们评估的相关性25 (OH) D₃,24日,25 (OH)₂D₃水平的大鼠血清和脑组织之间不同的维生素D₃第一次摄入。结果表明,25 (OH) D₃在脑组织中的地位与25 (OH) D高度相关₃血清中不同的群体。在老鼠维生素D₃缺乏摄入量为6周,25 (OH) D₃的血清含量降低了平行于类似的减少25 (OH) D₃脑组织中,补充组25 (OH) D₃在脑组织和血清中水平增加。特定的传输机制提出了运输的中枢神经系统的循环维生素D代谢产物。在末梢循环,25 (OH) D的大部分₃紧密结合维生素D结合蛋白(菲律宾),形成维生素D-DBP-complex [26,27]。交通的维生素D-DBP-complex依赖于分子Megalin和Cubulin在老鼠脑微血管内皮细胞(28]。我们推测Megalin-dependent交通脉络丛可能是重要的25 (OH) D之间的相关性₃在脑组织和血清,和同步Megalin的表达可能会改变25 (OH) D₃血清中状态以满足运输的要求。此外,我们发现,24日,25 (OH)₂D₃浓度与25 (OH) D高度相关₃在不同组血清,以及脑组织中。结果表明:25 (OH) D的分解代谢₃到24日,25 (OH)₂D₃玫瑰与增加25 (OH) D₃浓度,与其他研究者的结果一致(29日- - - - - -31日]。它还表明,24日,25 (OH)₂D₃,最丰富的25 (OH) D₃代谢物,在血清和脑组织云作为替代标记的维生素D状态和测量24日25 (OH)₂D₃可以提供临床上有用的信息关于维生素D状态和补充。同时血清测定系数和大脑24日25 (OH)₂D₃是0.8219。强烈的相关性中演示了我们的研究可能提供一个潜在的方法来估计25 (OH) D的水平₃,24日,25 (OH)₂D₃脑组织中数据的血清浓度。

5。结论

目前的研究提出了一种新颖的HPLC-MS / MS方法同时量化25 (OH) D₃,24日,25 (OH)₂D₃在血清和脑组织的老鼠和提出25 (OH) D之间具有很强的相关性₃,24日,25 (OH)₂D₃老鼠的脑组织和血清之间接收不同的维生素D水平₃第一次。结果表明,血清中维生素D代谢产物的水平是密切相关的大脑,这可能会影响神经细胞的就业维生素D。维生素D的考虑₃起着重要的作用在大脑发育,维生素D的摄入量不足₃可能会影响中枢神经系统的功能。进一步的研究应该继续探索维生素D的变更₃维生素D代谢物水平与不同的持续时间₃补充可以帮助临床医生在调整为维生素D的时间长度₃补充,实现最优个体受益。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

江Huan-De李和裴负责研究概念和设计;应雪做了实验。鑫他,杨邓,苗族,花林Cai,咪咪Tang和Rui-Li见鬼了在收购日期;薛应分析和解释数据,并起草论文;鑫他进行关键论文的修改。应雪和鑫他贡献了同样的工作。

确认

这项工作是由湖南省为研究生(没有创新的基础。CX2013B099)和中国国家自然科学基金(没有。81401113)。

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