负面影响的高葡萄糖暴露在人类促性腺激素释放激素神经元

文摘

代谢紊乱常与男性hypogonadotropic性腺机能减退,这表明下丘脑缺陷涉及促神经元可能影响生殖功能。代谢因素之一高血糖已经涉及生殖轴的控制在中央层面,在人类和动物模型。到目前为止,对病理性高葡萄糖浓度对人类的直接影响促神经元。在这项研究中,我们调查了高葡萄糖效应在人类GnRH-secreting FNC-B4细胞。基因表达分析中存在,证实FNC-B4细胞表达促性腺激性腺素释放素神经元和几个基因相关的功能(KISS1R KISS1,性腺素和瘦素受体,FGFR1、neuropilin 2,和semaphorins),连同葡萄糖转运蛋白(GLUT1、GLUT3 GLUT4)。高葡萄糖暴露(22毫米;40毫米)显著降低基因和蛋白质表达促,KISS1R, KISS1,瘦素受体,而正常的葡萄糖(5毫米)。与之前的研究一致,瘦素治疗显著诱导促mRNA表达在5毫米葡萄糖,但不是在高葡萄糖浓度的存在。总之,我们的研究证明高葡萄糖对人类有害的直接贡献促神经元,从而提供新的见解致病机制代谢紊乱与生殖障碍。

1。介绍

hypothalamic-pituitary-gonadal(高压天然气)轴是精细监管在中央层面的活动促神经元,一个奇特的下丘脑神经元族群,包括一些细胞(800 - 2000细胞在成人大脑)分散在下丘脑视前区(POA) (1,2]。促神经元的解剖位置使它们特别容易受到周围养分变化,由于靠近血脑屏障(BBB),在第三脑室(3]。此外,最近的研究结果表明,激性腺素释放素神经元树突的项目分组人口的地区在BBB之外,他们可能直接意义分子在血液中循环,因此扩展范围的因素,综合这些神经元的生殖轴的控制(4]。

在过去的几年中,引人注目的实验证据已经破译几个机制通过外围信号和神经内分泌途径集成最终传达给激性腺素释放素神经元调节功能。特别是代谢激素,包括瘦素、胰岛素、生长激素释放多肽,多肽XX,可能调节促神经元活动从而高压天然气轴(5]。除了外围的荷尔蒙,小说中央介质传送这样的代谢信息中心负责管理繁殖已确定。从实验动物最近的数据表明kisspeptin / KISS1R系统所扮演的重要角色在介导一系列代谢输入已知调节促性腺分泌([6- - - - - -8),评论)。

紊乱的高压天然气轴通常是与代谢紊乱有关。在男性性腺机能减退,频繁的条件在中年人和老年人9),影响患者2型糖尿病(T2DM)病人体内比科目没有(更频繁10- - - - - -12]。在2型糖尿病患者雄激素缺乏与不当正常垂体gonadotropins-LH甚至低血浆浓度和FSH - [13- - - - - -15]表明下丘脑缺陷和/或垂体促反应受损。正常LH和FSH激性腺素释放素已经证明对科目与2型糖尿病,这表明下丘脑而非垂体缺陷(16]。然而,致病机制之间的关系hypogonadotropic性腺机能减退(HH)和代谢紊乱还有待充分阐明。几项研究已经证明,胰岛素抵抗是最重要的因素负责低睾酮和2型糖尿病之间的关联([15),审查),尽管冲突的结果存在level-central和/或peripheral-at潜在的致病机制可能会干扰高压天然气轴活动。通过评估胰岛素敏感性与血糖euglycemic夹,Pitteloud et al。17)表明,增加胰岛素抵抗与减少睾丸激素睾丸间质细胞分泌而不是LH脉冲,从而表明生殖轴的外围障碍的含义。最近的一项研究报道,二型糖尿病患者显示垂体下丘脑脉冲频率没有变化反应低促性腺激素和睾丸应对hCG (18]。有趣的是,在同一研究据报道,血糖水平强烈与LH脉冲的数量,从而表明一个特定的高血糖的负面影响下丘脑分泌的促性腺激素(18]。此外,高血糖症的主要决定因素已被确定为一个代谢综合征之间的关系(大都会)和性腺机能减退19]。最近的一项研究的动物模型高脂肪食源性大都会(20.),旨在调查的贡献不同的代谢紊乱相关的HH条件,发现了一个强大的协会LH等离子体水平降低与葡萄糖耐受不良的严重程度,以及独特的下丘脑病变,包括葡萄糖转运体的表达增加GLUT4 [21]。这些改变发生在下丘脑视前区,排第三脑室,促神经元居住,因此,同样的下丘脑区域以减少immunopositivity促性腺激素(20.]和KISS1R [21]。总的来说,这些发现导致进一步调查所起的直接作用特别激性腺素释放素神经元葡萄糖调节功能。

到目前为止,对激性腺素释放素神经元代谢紊乱的直接影响在人类的大脑。在这项研究中,我们利用一个在体外模型,FNC-B4细胞,一个长期的主要文化人类胎儿GnRH-secreting神经元,从男性胎儿获得和以前描述的22- - - - - -24),也表达了kisspeptin / KiSS1R系统(25,26]。为了研究促神经元控制高血糖的直接影响,我们暴露FNCB4细胞葡萄糖浓度升高。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

建立了人类GnRH-secreting FNC-B4细胞,克隆和传播在体外从男性胎儿的嗅觉系统,低温保存,之前的特点(22]。细胞生长使用黑人的修改F-12介质(欧文科学、圣安娜、钙、美国)补充10%胎牛血清(Eurobio, Les乌里,法国)和抗生素/抗真菌的解决方案(青霉素、100国际单位/毫升;链霉素,100毫克/毫升)。每次实验之前,细胞无血清培养系统在章节5到10被孵化24小时,然后实验使用glucose-free媒介执行补充与正常葡萄糖(5毫米),高葡萄糖(22毫米),非常高的葡萄糖(40毫米),或甘露醇(22毫米)24小时。实验进行的一个子集用1 nM瘦素治疗细胞24小时在5毫米,22毫米,或40毫米葡萄糖。细胞被洗的磷酸盐(PBS)和加工为免疫细胞化学定量mRNA表达或程序。

2.2。RNA提取和定量rt - pcr

隔离的RNA进行使用试剂盒试剂按照制造商的指示(欧洲生活技术,蒙扎,意大利)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用iScriptTM Bio-Rad的互补脱氧核糖核酸合成装备购买实验室(大力神,CA)。与荧光定量rt - pcr(存在)进行TaqMan方法,正如前面发表(25),使用特定的引物和探针混合物GnRH1 (Hs00171272_m1) KISS1R (Hs00261399_m1) KISS1 (Hs00158486_m1),纤维母细胞生长因子受体1 (FGFR1;Hs00241111_m1), neuropilin 2 (NRP2;Hs00187290_m1), semaphorin 3 (SEMA3A;Hs00173810_m1), semaphorin 3 f (SEMA3F;Hs00188273_m1),速激肽3 (TAC3;Hs00203109_m1), TAC3受体(TAC3R;Hs00357277_m1)、雄激素受体(AR);Hs00171172_m1),雌激素受体-α(ERα;Hs01046818_m1),呃β(Hs01100358_m1), G protein-coupled ER (gp / GPR30;Hs00173506_m1),瘦素受体(LEPR;Hs00174497_m1),葡萄糖转运蛋白1 (GLUT1);Hs00197884_m1)、GLUT3 (Hs00359840_m1), GLUT4 (Hs00168966_m1) mRNA,购买从生活的技术。18 s核糖体RNA亚基的表达,选择管家基因,是量化predeveloped试验(Hs99999901_s1;生命技术)。数据分析是基于比较阈值周期(Ct)的方法,如前所述[27]。放大和检测进行MyiQTM2双色实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室)。

2.3。免疫细胞化学

FNC-B4幻灯片上培养的细胞在适当的介质,然后用3.7%多聚甲醛固定(pH值7.4)10分钟和permeabilized PBS含有0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)10分钟。在PBS冲洗后,幻灯片和1%的牛血清白蛋白孵化15分钟。疣状如前所述执行(25使用单克隆抗体anti-GnRH我](1:200稀释;圣克鲁斯生物技术有限公司),兔多克隆anti-kisspeptin(1: 2000稀释,凤凰制药公司,贝尔蒙特,CA),或兔多克隆anti-KISS1R(1: 100稀释;凤凰制药有限公司)其次是共轭抗体:R6393罗丹明红色山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)(1: 200年,分子探针,尤金或)anti-GnRH我和488 - 11001 Alexa萤石山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)(1: 200年,分子探针),anti-kisspeptin或anti-KISS1R。幻灯片进行评估并使用尼康Microphot-FXA显微镜拍照(尼康)。Immunopositivity量化进行了使用Photoshop 5.5软件(Adobe Systems Inc .)。

2.4。统计分析

数据表示为的意思平均数标准误差(SEM) n样本。以上两组之间的差异进行评估与单向方差分析后跟Tukey-Kramer事后分析。被认为是显著的。

3所示。结果

为了提供更好地表征FNC-B4细胞表型、基因表达分析是由定量rt - pcr在未经处理的细胞。没有观察不同通道之间的差异(从5 - 10),因此,结果报道在图连接池1。FNC-B4细胞大量表达促,在一个较低的程度上,KISS1 KISS1R信使rna。最丰富的基因表达检测已知与促神经元迁移,如FGFR1、semaphorins (SEMA3A和SEMA3F),及其同源受体neuropilin 2 (NRP2)。相比之下,TAC3(或称为神经激肽B)几乎检测不到及其同源受体(TAC3R)不是FNC-B4表达的细胞。性类固醇受体中,有趣的是,基于“增大化现实”技术和G protein-coupled雌激素受体GPER1 / GPR30最丰富,相比经典的人(ERα和ERβ)。此外,FNC-B4细胞表达高水平的瘦素受体(LEPR),随着葡萄糖转运蛋白亚型GLUT1和GLUT3。虽然在一个较低的程度上,FNC-B4也表示GLUT4胰岛素依赖型对碘氧基苯甲醚。

图1

在FNC-B4细胞基因表达分析。激性腺素释放素神经元功能相关基因的mRNA表达相关的评估使用定量rt - pcr。根据比较Ct数据计算方法,使用18 s rRNA单元作为参考基因正常化。测量进行了四个不同的细胞制剂在不同段落(从5到10)。未发现统计学差异之间的通道,那么结果汇集和报道的意思扫描电镜。

研究是否长时间暴露于葡萄糖浓度增加可能会干扰促神经元功能相关基因的表达,FNC-B4细胞培养24小时的三种不同葡萄糖浓度(5毫米,22毫米,40毫米)。如图2高(22毫米)和非常高(40毫米)葡萄糖浓度显著降低的mRNA表达促(图2(一个))和KISS1R(图2 (b)),而KISS1信使rna抑制只有在最高的葡萄糖浓度。Osmolarity-induced改变被曝光排除因为没有效果观察细胞22毫米甘露醇(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。高葡萄糖依赖的下调促、KISS1R KISS1表达式也证实了免疫细胞化学分析,如图2代表故事(电池板d e、g-h和j - k, resp)和相关的计算机辅助量化immunopositivity强度(电池板f、我和l,职责)。

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图2

μ 在FNCB4细胞高葡萄糖效应。(a - c)定量rt - pcr分析激性腺素释放素(a)的mRNA表达,KISS1R (b)和KISS1, (c)基因在FNC-B4细胞暴露于正常(NG 5毫米),高(HG, 22毫米),高(VHG 40毫米)葡萄糖浓度或甘露醇(M, 22毫米)24小时。根据比较结果计算Ct方法,使用18 s rRNA单元作为参考基因正常化,并获得三个独立的实验中,每执行一式三份。数据报告的意思SEM和表达NG的百分比(%)。*;* *和NG。(d-l) Immunofluorescent激性腺素释放素(d, e)的本地化,KISS1R (g和h)和kisspeptin (j和k)蛋白在FNC-B4细胞暴露于NG (d、g和j)或VHG (e、h和k)。双标记的核染色DAPI(蓝色)和anti-KISS1R(绿色;g和h)或anti-kisspeptin(绿色;j和k)抗体也显示。原始的放大20.。;比例尺= 50m。计算机辅助图像分析量化促,KISS1R,和kisspeptin immunopositivity所示面板(f),(我),(l),分别。=分析细胞的数量。

高葡萄糖暴露的影响促性腺表达也研究瘦素的存在,在FNC-B4能够诱导细胞,正如前面演示(26]。因此,瘦素治疗(1纳米,24小时)激性腺素释放素mRNA表达显著增加FNC-B4细胞在正常葡萄糖(5毫米)(图3(一个))。然而,缺乏这种效应在高葡萄糖浓度(22岁和40毫米)(图3 (b))。

(一)

(b)

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图3

高葡萄糖对瘦素的影响在FNCB4细胞信号。(一)定量rt - pcr分析FNC-B4 LEPR mRNA表达的细胞暴露于正常(NG 5毫米),高(HG, 22毫米),和非常高的(VHG 40毫米)葡萄糖浓度或甘露醇(M, 22毫米)24小时。(b)的影响瘦素(1纳米,24小时)激性腺素释放素mRNA表达在FNC-B4细胞暴露于不同浓度葡萄糖(NG, HG, VHG)或甘露醇(M, 22毫米)。根据比较结果计算Ct方法,使用18 s rRNA单元作为参考基因正常化,从至少三个独立的实验中,获得每一式三份。数据报告的意思SEM和NG是用%表示。*;* *和NG。

4所示。讨论

扰动的葡萄糖代谢被牵连的致病因素之一负责HH和代谢紊乱之间的关系19]。在实验大都会,高血糖和相关下丘脑炎症过程相关的损伤促/促性腺激素释放[20.]。使用良好的细胞模型,我们在这里展示的直接抑制作用增加葡萄糖浓度对人类胎儿GnRH-secreting神经元,FNC-B4细胞,因此解开,在病理条件下,高浓度的葡萄糖可以直接抑制促神经元功能相关的基因的表达。

众所周知,葡萄糖是一种生殖轴的关键代谢调节剂,可以微调脉动的促性腺释放([28),审查)。这项研究由Herde et al。4),显示促神经元的亚种群可能直接从外围,大大提高我们理解突然改变等离子体的分子水平如何调节脉动的促/ LH分泌。最近的证据鼠标GT1-7激性腺素释放素细胞系克隆涉及这促神经细胞系作为直接的葡萄糖传感器,进一步表明促神经元细胞外葡萄糖的变化可以直接(29日,30.),这glucosensing由性腺类固醇(调制29日,31日]。不过多数现有证据对葡萄糖调节促神经元活动来源于研究实验glucoprivation,表明促神经元对葡萄糖浓度的变化敏感的生理范围内(5毫米),与低剂量(0.5毫米)能够表达下调促性腺释放(29日,31日,32]。在这项研究中,我们已经测试了暴露的影响FNC-B4细胞葡萄糖浓度极高(22和40毫米),为了模拟病理条件下,如控制糖尿病高血糖,当大脑血糖水平更有可能超过5毫米。

促神经生物学的调查强烈受到这些几百的特殊的解剖分布的细胞分散在下丘脑POA。的可用性FNC-B4激性腺素释放素神经元细胞有促进机制调节的研究人类的起源(22- - - - - -26,33- - - - - -36]。这些细胞表达和释放促性腺在应对不同的刺激,包括性类固醇(23],kisspeptin [25,瘦素(26]。此外,先前的研究已经发现,FNC-B4细胞表达胰岛素生长因子(IGF)系统由高葡萄糖表达下调(20 mM)接触(37]。我们这里显示FNC-B4细胞表达葡萄糖转运蛋白(GLUT1、GLUT3 GLUT4),进一步证明这些细胞可能对葡萄糖浓度的变化,从而打开新的机械的见解促性腺释放的直接代谢控制。暴露FNC-B4细胞高葡萄糖显著降低基因和蛋白质表达不仅促而且KISS1R, kisspeptin激活后,被认为是主调节器的促生产。正如前面演示(25),我们这里确认FNC-B4细胞表达KISS1,表达的也是受高葡萄糖曝光。这一发现显然与当前的理解相反KISS1 / KISS1R系统前脑的老鼠和老鼠,这表明kisspeptin-secreting神经元是一个有别于GnRH-secreting神经元(下丘脑神经元群(8),审查)。然而,在良好的协议与我们的结果,鼠标GT1-7细胞系,永生的下丘脑促神经元(38],表达KISS1 [39]。基因表达分析更好地阐明FNC-B4表型,丰富表达基因,如FGFR1、NRP2, SEMA3A, SEMA3F,已知参与正常迁徙过程,通过促神经元到达最后的下丘脑的目的地在胚胎发生。众所周知,FGFR1突变导致Kallmann综合症,一种异构的遗传性疾病,将HH由于促性腺激素缺乏与嗅觉缺失症(40]。同样,neuropilins (NRP1和NRP2)及其配体semaphorins (SEMA3A和SEMA3F)已经与促发展的系统[41]。有趣的是,不仅FNC-B4细胞表达古典雄激素和雌激素受体(AR、ERα,呃β),因为之前报道(23,26),而且膜雌激素受体GPER1 / GPR30,最近已涉及快速雌激素在灵长类动物(42和老鼠43)促神经元。此外,的身份FNC-B4激性腺素释放素神经元细胞的观察证实这些细胞不表达TAC3,基因编码神经激肽B (NKB),也不表达TAC3R,这对于NKB受体编码。这一发现与研究报告是在协议缺乏TAC3R促神经元的羊44,45和老鼠46]。的确,有人认为NKB KISS1神经元释放的,而不是通过提高kisspeptin分泌促神经元和行为自分泌或旁分泌机制,通过TAC3R [47]。因此,kisspeptin灌注恢复促性腺激素患者使用TAC3或TAC3R丧失突变(47]。

在这项研究中,我们最初证明FNC-B4细胞瘦素信号的调节葡萄糖的曝光。瘦素的作用作为繁殖宽容代谢信号,通过刺激作用影响促性腺激素的分泌是众所周知的48]。正如前面演示(26),我们确认在5毫米葡萄糖浓度瘦素保留FNC-B4细胞诱导促性腺表达的能力。相比之下,激性腺素释放素表达瘦素未能刺激葡萄糖高剂量的存在,因此建议瘦素信号受损,很可能由于两个22的抑制作用和40毫米葡萄糖浓度LEPR表达式。尽管人们普遍认为促神经元生理上不表达LEPR,建议中间神经元电路和信号的参与49),我们的研究结果与先前的报道显示,在协议激性腺素释放素分泌瘦素的刺激效应可能直接在细胞,这类似于FNC-B4,表达LEPR [50]。

因为FNC-B4细胞有一个男性核型,任何外推的结果来解释由葡萄糖激性腺素释放素神经元的控制仅限于男性患者。的确,大都会女性生殖系统的影响(LH的分泌增加,雄激素过多症)是完全不同于那些发生在男性。下丘脑核的两性异形,女性参与调停的积极反馈卵巢类固醇,排卵期前的必不可少的促黄体激素激增,可能涉及的不同反应女性生殖系统代谢紊乱。进一步的研究可以阐明是否神经元,类似于FNC-B4,女性染色体组型将有不同的控制同样的基因和蛋白质。

总之,即使获得在体外,我们的研究结果支持这样的设想高血糖对人体有害的直接贡献的促神经元,从而提供新的见解HH与代谢疾病的致病机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突,可以视为损害公正性的研究报道。

确认

这项研究受到了Under40-Young调查资金从意大利卫生部长(批准号每gli gr2008 - 1137632)和洋底Investimenti真主安拉Ricerca迪基(FIRB、协议号2010 rbfr10vj56 002)意大利部长大学的研究和指导。

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