文摘
高血糖的互补作用抑制胰岛β细胞再生是一个同系的小鼠模型研究。基因沉默是由感染C57BL / 6 shRNA慢病毒粒子的小岛。在病毒感染后54小时,蛋白质含量在培养目标的小岛是22%新孤立的小岛。六天移植后糖尿病老鼠,目标胰岛移植物与Ki67-staining核有相当多的细胞比不属预定目标的小岛。老鼠targeting-islet组明显短持续时间的临时比non-targeting-islet组小鼠高血糖症。长期的体外有益的影响还表示了沉默在移植肾功能累积治愈率明显高于糖尿病小鼠接受200年目标比小鼠胰岛接收200新小岛。我们的数据表明,高血糖和持久的抑制有协同效应在成年小鼠胰岛β细胞的复制。
1。介绍
可以被许多临床血糖稳态条件如怀孕和肥胖和原因β细胞大规模扩张以满足需求的增加胰岛素(1,2]。但是,底层的扩张行动的机制β肽是目前不清楚(3- - - - - -6]。虽然葡萄糖已经假定调节细胞周期蛋白D2在胰岛β细胞和β细胞补偿中发挥主导作用,目前尚不清楚如何控制细胞周期的胰岛β细胞葡萄糖(7- - - - - -10]。的一项研究表明,抑制cdk-inhibitors p27kip1和p18INK4c,但不是p27Kip1独自一人,促进内分泌肿瘤形成在啮齿动物11,12]。同样,虽然对细胞增殖细胞周期素D是重要,但其过度不触发β细胞复制(13]。它表明,成人胰岛测点控制调节β细胞复制的细胞周期。
我们先前的研究显示,主要的成年小鼠胰岛应对化学-机械消化和净化过程通过显著增加细胞周期蛋白B1但减少p27Kip1蛋白质含量(14]。在接下来的7天的培养,维持高水平的细胞周期蛋白B1但p27的快速恢复Kip1的小岛在含有高葡萄糖培养基中培养指出[14]。p27的快速恢复kip1培养胰岛水平可以解释为什么细胞数量没有增加对胎鼠胰岛β细胞中培养介质含有200 mg / dL葡萄糖(7天15]。p27以来Kip1是一个重要的G1 / G0检查点细胞周期的进展,有趣的是研究是否持久抑制p27kip1可以提高胰岛β细胞增殖hyperglycaemic环境。因为从实验中获得的数据使用细胞系,胎儿的小岛,小岛的淘汰赛老鼠阐明p27的角色kip1和葡萄糖对β细胞复制可能不适合申请成人胰岛,在这项研究中,我们使用主要的成年小鼠胰岛调查持续高血糖和p27的互补作用kip1抑制β细胞再生。
2。材料和方法
化学物质包括三羟甲基氨基甲烷(hydroxyl-methyl)甲胺液(三)histopaque - 1077,习类型胶原酶和抗体β肌动蛋白(AC-15)从σ获得化学公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。rpmi - 1640中是购自GIBCO表达载体,生命技术公司(美国纽约大岛)。抗体细胞周期蛋白B1 (GNS1),细胞周期蛋白D1 (DCS-6)和p27kip1(dcs - 72. - f6)获得热费希尔科学(弗里蒙特、钙、美国),和抗体FoxM1 g3(4)从微孔购买公司(美国质量Bilerica)。兔子和老鼠Ki67多克隆抗血清(ab15580)从Abcam购买公司(美国Cambridge, MA)。
2.1。动物保健和诱导糖尿病
雄性C57BL / 6小鼠(8 - 12周)从当地获得增殖并管理一个腹腔内注射链脲霉素200毫克/公斤体重诱导糖尿病。小鼠全血血糖水平保持在> 360 mg / dL 2周多被用作糖尿病人。3到5每个笼子里的老鼠被安置和美联储标准颗粒状食品和自来水随意。动物的房间有一个自动照明光周期12 h和12 h的黑暗。人道对待动物按照实验动物长庚纪念医院的指导方针。
2.2。胰岛细胞分离
胰岛细胞被孤立于C57BL / 6小鼠胶原酶消化、丰富histopaque密度梯度,最后手工挑选的。简而言之,管理异戊巴比妥钠诱导小鼠麻醉后,我们膨胀的胰腺nonfasted健康老鼠2.5毫升rpmi - 1640中含1.5毫克/毫升胶原酶,然后切除和孵化这些37°C水浴。小岛是纯化使用密度梯度和解剖显微镜下精心挑选。孤立的小岛直径在150μ米被收集并分为组每组50个小岛。最小化的影响批次实验观察胰岛功能的变化,每一批的胰岛分离出8 - 10只老鼠在一天之内被分成相等的组和移植到同等数量的老鼠在实验组和对照组在同一天。
2.3。肾包膜下移植
小岛是离心机为90秒(500克)PE-50管连接到一个200年μL吸管小费。异戊巴比妥麻醉下收件人鼠标,左肾是通过腰部切口暴露的。囊切开术是肾、极低的执行和PE-50管的顶端(美国新泽西州粘土亚当斯,日前)是先进的胶囊对上杆、下胰岛移植物植入的使用汉密尔顿注射器。左unsutured胶囊。使用双层缝合腹膜后腔被关闭。
2.4。目标,不属预定目标的慢病毒转导沉默在小岛
我们转导小岛用小发夹rna沉默p27(成分)kip1和使用不属预定目标的shrna控件,然后检查p27的效果kip1沉默在成年小鼠胰岛的适应。简而言之,新孤立的小岛,在50浓度每口井的小岛,被镀与150年96孔细胞培养板μL rpmi - 1640中包含8μ聚凝胺的g / mL。慢病毒是孵化与小岛20感染复数(MOI) 24小时在37°C。第二天,小岛被转移到新的盘子,洗两次,并进一步培养在37°C,每天中被改变了。收集在72 h后隔离,胰岛移植。p27kip1基因沉默是由感染4克隆的小岛使命shRNA慢病毒颗粒(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)设计的目标细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 b (p27kip1)。这四个克隆TRCN0000071063, (CCGGCGCAAGTGGAATTTCGACTTTCTCGAGAAAGTCGAAATTCCACTTGCGTTTTTG);TRCN0000071064 (CCGGCCGGCATTTGGTGGACCAAATCTCGAGATTTGGTCCACCAAATGCCGGTTTTTG);TRCN0000071066 (CCGGCCTTTAATTGGGTCTCAGGCACTCGAGTGCCTGAGACCCAATTAAAGGTTTTTG);TRCN0000071067 CCGGCCCGGTCAATCATGAAGAACTCTCGAGAGTTCTTCATGATTGACCGGGTTTTTG。
2.5。的影响沉默在胰岛细胞周期蛋白体外
转导的24小时,相同批次的针对新小岛(每批300小岛)洗3次冰冷的磷酸盐和细胞溶解缓冲区包含150更易与L氯化钠,0.2更易20更易与L / L ethylenediamine-tetraacetic酸Tris-HCl (pH值7.4),和0.5%十二烷基硫酸钠补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(德国罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。在4°C孵化20分钟后,溶解产物离心机在13000 g×15分钟在4°C,和上层清液收集总胰岛蛋白质含量。总胰岛分离蛋白质12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶electrophoretically转移到硝化纤维膜。朱红色年代染色检查传输效率后,膜被2小时在室温下有10%的脱脂奶粉(NFDM) Tris-buffered盐水(pH值7.4)含0.1% Tween-20 (TBST)。当时孵化一夜之间在4°C NFDM-TBST包含2μ克/毫升每个抗体β肌动蛋白(管家),p27kip1(G1 / G0检查站),细胞周期蛋白D1 (G1 / S),细胞周期蛋白B1 (G2 / M)和FoxM1 TBST洗3次,孵化为1.5 h在室温下与辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白G抗体(0.1μg / mL NFDM-TBST)。与TBST 3洗后,结合抗体被发现通过使用VisGlow化学发光设备从视觉获得的蛋白质生物技术(台北,台湾)和柯达以下女士的电影。细胞周期蛋白被表示为每个蛋白质的乐队比密度的β肌动蛋白在同一批次的总胰岛蛋白质。
2.6。的影响沉默在体外胰岛Glucose-Stimulation胰岛素分泌
胰岛功能转导沉默p27的成分kip1或非目标成分控制被glucose-stimulation评估胰岛素分泌。经过24小时的转导和3和7天的培养,顺序批30每口井的小岛被暴露于不同浓度的葡萄糖。小岛在100 mg / dL孵化葡萄糖60分钟。中被收集后,同一批次的小岛当时刺激360 mg / dL的葡萄糖为60分钟。净葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验(GSIS)之间的差异计算胰岛素内容中含有360 mg / dL和介质含有100 mg / dL葡萄糖。刺激指数(SI)的比例被认为是胰岛素的内容中含有360 mg / dL的葡萄糖在葡萄糖中含有100 mg / dL的同一批次的小岛。
2.7。短期内体外的影响沉默在胰岛细胞复制和函数
研究p27的短期效应kip1沉默对胰岛细胞功能和复制,鼠标小岛转导p27的成分kip1或非目标成分控制移植normoglycemic健康老鼠和糖尿病小鼠体外实验。全血血糖和体重每隔一天测量一次。移植胰岛移植后6天,被免疫组织化学检查。胰岛细胞移植的相对数量进行复制与核估计的相对数量的细胞染色阳性Ki67平均250个细胞移植(每组)。
2.8。长期的体外的影响沉默在胰岛细胞的功能
研究p27沉默的长期影响胰岛移植物的功能,小鼠胰岛转导p27的成分kip1或非目标成分控制移植到糖尿病小鼠体外转导后24小时和48小时后培养基中孵化。我们200胰岛移植接受者研究p27沉默对胰岛功能的影响在活的有机体内。移植后,整个体重和血糖水平在血液样本来自一个尾静脉测量12周每周2到3次,和暂时性的高血糖症的持续时间被认为是移植和2之间的一段时间连续测量全血血糖水平低于200 mg / dL。最后12周观察期间,左肾切除术进行所有老鼠把胰岛移植。所有进行肾切除手术老鼠存活2周证实移植肾功能,然后,胰岛素的胰腺被测量的内容。
2.9。测定胰岛素含量
胰腺胰岛素含量残余胰岛移植是由使用acid-ethanol方法决定的。短暂,胰腺或graft-bearing肾脏nonfasted老鼠被随机8到10点,显示日期,均质acid-ethanol解决方案,并存储在一夜之间在4°C。30分钟在2400转离心后,上清液收集和储存在−20°C。胰腺遗迹和胰岛移植又均质新鲜整除acid-ethanol解决方案和胰岛素re-extracted过夜。离心后,上清液收集和集中第一次提取样本。最后,胰岛素浓度用放射免疫检定法测量。
2.10。统计分析
数据表示为±标准错误。分析了统计差异意味着使用成对的或未配对的学生t以及,如适当。累计组治愈率的长期影响研究是使用kaplan meier方法评估。日志等级测试是用于分析不同组老鼠之间的治愈率。的值被认为是显著的。
3所示。结果
表1揭示了慢病毒携带p27Kip1针对成分有效地减少p27的表达Kip1蛋白质在成年小鼠胰岛54和96 h后感染和免疫印迹是代表图所示1。p27的Kip1蛋白质含量在培养胰岛54小时后病毒感染仅为22%,在新孤立的小岛,和p27的抑制Kip1蛋白质是维持甚至96小时后感染。表1表明,p27的抑制Kip1表达的增加伴随着B1和FoxM1蛋白质的水平,这表明p27减少Kip1表达式允许胰岛细胞进入细胞周期。控制的小岛感染新慢病毒p27Kip1/肌动蛋白的比值(),(),()24日,54岁的感染和96小时后,分别与新鲜的比率获得相比孤立的小岛。
研究慢病毒转染对胰岛功能的影响,分子生物学的胰岛素分泌(GSIS)和刺激指数(SI)的小岛在3和测量目标的新病毒感染后7天。表2表明,胰岛素分泌的比率和净差异360 mg / dL和100 mg / dL之间葡萄糖培养胰岛的目标没有什么区别的新病毒感染的小岛。
探讨p27的短期效应Kip1沉默在胰岛细胞增殖,批50每个目标的新转导的小岛被植入在左肾的被膜下的空间正常健康的老鼠和B6小鼠体外糖尿病患者;6天后,移植被移除和免疫组织化学。当糖尿病小鼠体外实验作为接受者,Ki67细胞核染色阳性的数量和(,)针对新胰岛移植,分别。图2显示了典型的结果胰岛移植物的免疫组织化学定位组(图2(一个)(图)和新组2 (b))。在正常健康小鼠,anti-Ki67抗体染色几乎没有可检测胰岛移植物的细胞核从目标和新团体(数据未显示)。针对新老鼠的糖尿病收件人群组,整个血糖水平和(,0)的一天和(,)在植入后6天,分别。针对新老鼠的体重糖尿病收件人群组g和g (,0)的一天g和g (,)分别在移植后6天。
(一)
(b)
研究p27的长期影响Kip1沉默在胰岛移植肾功能,批200同系的小岛与目标或新转导植入的左肾的被膜下的空间B6小鼠体外糖尿病,和整个测量血糖和体重。如数据所示3(一个)和4收到200,所有治疗糖尿病小鼠胰岛转换为normoglycemia,和目标组的小鼠有显著短临时高血糖症期比老鼠的新集团(,与,,在表3)。长期的体外p27产生的有利影响Kip1沉默对移植物功能还表示了累积治愈率明显高于糖尿病小鼠接受200年目标比小鼠胰岛收到200的新岛()(图4)。在12周观察期结束后,移植被证实那些潜在的效果。graft-bearing肾切除的三天后,老鼠显示整个血糖水平的快速提升,体重明显降低(数字3(一个)和3 (b))。针对新组之间没有区别的移植和胰腺的胰岛素内容遗迹在移植后12周(表3)。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这项研究中,我们用lentivirus-carrying转导成人胰岛shRNA压制p27的80%Kip1蛋白质,p27的合成抑制Kip1表达持续了超过96小时后感染。转导和后续p27Kip1抑制不影响胰岛功能分子的胰岛素分泌。已经表明,次优的胰岛组织不足以实现normoglycemia糖尿病接受者;接枝β细胞复制后最初但不增加了18天,尽管持续的高血糖,和β细胞质量逐步下降16]。因此,在这项研究中,50胰岛组织/收件人用于短期移植实验呈现的胰岛β细胞高复制率在糖尿病接受者;200胰岛组织用于长期实验为了缩短暂时性的高血糖天,避免β细胞群通过持续的高血糖。在短期内体外研究中,当normoglycemic健康老鼠作为接受者,无论是控制小岛还是与p27小岛Kip1沉默与细胞核染色检测细胞阳性Ki67,在移植后6天。相反,成人与p27小岛Kip1沉默表达更多的核和积极Ki67染色密度高于控制小岛,小岛在6天后被移植到糖尿病小鼠体外实验。我们的数据表明,p27Kip1抑制并不能提高胰岛细胞增殖但高血糖和持久p27 normoglycemic老鼠Kip1抑制对胰岛细胞复制协同效应Ki67细胞核染色阳性。为了进一步证实高血糖和p27的互补效应Kip1沉默在β细胞复制,我们成年小鼠胰岛移植有或没有p27Kip1沉默糖尿病小鼠和跟进所有治疗小鼠为3个月。p27的有益作用Kip1沉默在移植复制表示了明显短临时高血糖的时期和累积治愈率显著提高糖尿病小鼠接受针对小岛比老鼠接受相同数量的新岛屿。
在早期的细胞周期G1期,细胞周期蛋白D-cyclin依赖激酶催化磷酸化4/6的视网膜母细胞瘤蛋白(复审委员会)和磷酸化复审委员会抑制anaphase-promoting复杂——(APC / C)介导polyubiquitination和随后skp2蛋白水解作用,导致增加skp2与p27的减少Kip1蛋白质(17]。p27的退化Kip1是至关重要的细胞进入G1 / S阶段对复制和胰腺β细胞的复合自适应扩张(11,12]。在S-G2-M阶段的β细胞分裂,葡萄糖会使细胞周期蛋白D2表达式,将减少磷酸化复审委员会并导致减少skp2 p27和增加Kip1蛋白质(10,17]。p27的增量Kip1蛋白质在S-G2-M阶段的β细胞分裂阻止细胞有不成熟进入下一个周期(17]。在G2期后期,B1蛋白质在非洲爪蟾蜍卵母细胞的数量是20 - 30倍高于G1和细胞周期蛋白B1蛋白质水平必须达到一个阈值在有丝分裂过程(18]。一旦启动,通过有丝分裂进程依赖于几个细胞周期调控蛋白的降解由APC / C,包括细胞周期蛋白B1和skp2,又可以防止细胞不当进入其他阶段在有丝分裂期间(19,20.]。我们先前的研究显示,孤立的小岛的成年小鼠持续表达高水平的细胞周期蛋白B1特别是当培养基包含高葡萄糖(14]。在这项研究中,我们使用shrna p27沉默Kip1高血糖作为互补因素研究葡萄糖和p27的协同效应Kip1在成年小鼠胰岛的适应。虽然高血糖的协同效应的作用机制和p27Kip1沉默在成人胰岛β细胞复制还不清楚,我们假设p27的持续镇压Kip1lentivirus-carrying成分在成人胰岛细胞将推动更多细胞G1 / S期和高glucose-mediated持久的细胞周期蛋白B1准备将准备更多的细胞进入有丝分裂,增加β细胞复制。
总之,我们的数据表明,成年小鼠胰岛β细胞可以复制,当代谢需求增加和协同效应的高血糖和并发p27的抑制Kip1胰岛β细胞复制。
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