微波组织准备快速固定、脱钙作用,抗原检索,Cryosectioning,疣状

文摘

微波辐照的组织在固定和随后的组织化学染色过程大大降低孵化所需的时间在固定和染色的解决方案。最小化的孵化时间固定剂减少破坏的组织形态,并减少染色溶液中培养时间或减少非特异性标记抗体的解决方案。减少染色溶液中培养时间也减少背景噪音水平。微波组织制备适用于组织固定、脱钙的骨骼组织,治疗脂肪组织,抗原检索,和其他特殊染色的组织。微波组织固定和染色组织学分析是有用的工具。本文描述了协议使用微波辐照几个基本过程在组织化学的研究中,这些技术适用于其他协议组织固定,在细胞生物学领域的疣状。

1。介绍

微波辐照组织处理期间显著减少所需的时间固定,脱钙作用,与化学试剂染色,孵化与抗体。

自1980年代中期以来,微波辐射已越来越多地应用于组织学准备。微波辐照诱发快速振荡的水分子(2.45 GHz),从而增加组织的温度。传统的微波设备照射组织快速和均匀,和微波辐照协议根据具体不同微波设备使用。

微波辐照是经常申请特殊染色(1- - - - - -12]。微波辐照也被应用在固定(13和后续的染色过程,如enzyme-based染色和免疫荧光染色。

immunohistological研究组织的准备期间,许多构件破坏原始信号可能发生,其中大部分通常与后期固定或低固定的体积。后期准备组织引起蛋白质的分解,导致缺乏特定的抗原表位。破坏蛋白质的固定不利影响epitope-antibody在免疫组织化学反应。此外,形态变化也发生在固定cryosections和/或电子显微镜的样品。传统固定也可能导致收缩的组织,如骨骼或平滑肌细胞,培养细胞的或由于固定剂的渗透不足(如福尔马林溶液)完全修复组织,和需要长时间固定。

微波辐射可以用来实现更快速的固定,解决处理和疣状(13- - - - - -38]。微波辐照也申请了荧光原位杂交(FISH)石蜡包埋组织的分析39- - - - - -41]。最近,作者描述microwave-irradiated血管固定和免疫荧光显微镜42]。在这种情况下,微波辐照用于增加固定液的渗透。微波辐射的使用也减少非特异性结合的荧光标记抗体固定样本应用时。快速固定组织和培养细胞的免疫荧光染色也描述了使用微波辐射(43]。微波辐照证明显著减少所需的孵化时间与中小学抗体在免疫荧光显微镜。我们使用一种技术涉及的培养细胞在固定间歇微波辐射,导致好保护组织免疫反应性与传统固定相比,除了减少固定时间43]。

影响组织学分析的另一个问题是初加工硬组织的影响,如骨,这需要脱钙作用固定后软化组织,允许使用切片机切。很长一段时间也需要去除一些脂肪组织。传统脱钙作用需要一段时间约1 - 2周,从而防止早期诊断在组织学研究[44,45]。组织准备电子显微镜,包括固定和后续解决方案治疗,也是有问题的。固定使用formalin-based固定液使组织收缩。解决方案治疗,通过酒精脱水等系列,需要一个相对较长的时间在传统协议。

传统抗原检索通常被使用在高温高压蒸汽室执行(~ 121°)和高压,总是引起组织破坏和清除的幻灯片。微波辐照也非常适用于抗原检索在石蜡包埋组织切片46- - - - - -49]。

微波组织处理显著降低了酶反应所需的处理时间,过氧化物酶处理,和阻止程序。微波辐射降低了1/3-1/10的处理时间比常规程序。此外,微波辐照收益率低背景,高对比度图像由于染色溶液或减少非特异性结合的抗体免疫荧光染色。

几个允许游览器控制的微波辐照功率从150年到400年W是可用的。还可以精确控制温度使用两个独立的系统,例如,红外线和热电偶温度测量系统。

本文描述了一个微波组织协议准备组织固定、脱钙的骨骼组织,脂肪组织(脂肪),固定的抗原检索石蜡包埋组织,和其他技术的微波辐照是适用的。此外,应用微波辐射对血管细胞的电镜原位也进行了讨论。

2。申请组织固定

2.1。原位固定血管(42,50]

由于与固定血管相关的困难,由于收缩平滑肌组织,只有一些研究使用血管原位。很难获得良好的固定血管的动物,特别是内皮细胞,比获得其他器官。多聚甲醛的灌注引起平滑肌收缩根据formalin-based固定液的渗透。在固定时,血管收缩迅速在多聚甲醛溶液灌注。然而,我们使用了微波辐射在固定的血管和组织形态学和免疫反应性的取得了良好的保护。

2.2。协议

Aortae获得正常成年豚鼠体重400 - 600克。(1)灌注0.85%生理盐水含有肝素钠(1 U /毫升)执行通过左心室和胸降主动脉、腹主动脉和下腔静脉切除。(2)沿着背墙和血管切开固定到牙科蜡盘,暴露出腔的表面。(3)光学显微镜,主动脉是放置在一个100毫升烧杯包含50毫升的2%多聚甲醛在磷酸盐(PBS)。扫描和电子显微镜,建议使用1/2 Karnovsky的固定剂(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛在0.1钠甲次砷酸盐缓冲,pH值7.2)。(4)烧杯放在微波炉转盘和接受间歇微波辐射在200 W 5分钟(4 s / 3 s)。

微波辐照后,血管与两个或三个冲洗PBS的变化没有微波辐照每次10分钟。然后切成小段(约5 - 10毫米长度)和加工石蜡包埋或免疫荧光显微镜(见免疫荧光显微镜申请)。

3所示。培养细胞的固定43]

微波辐照适用于培养细胞的固定。传统的培养细胞固定至少需要30 - 60分钟1%多聚甲醛。微波辐射在固定可以显著减少所需的时间固定和染色免疫荧光显微镜。所有程序,包括固定和抗体染色,完成30 - 45分钟内没有任何损失的细胞形态和非特异性结合的染料。

3.1。协议

(1)盖玻片上培养的细胞是根据标准程序。(2)细胞被洗迅速与PBS的三个变化。(3)与1%多聚甲醛固定细胞间歇微波辐照(总5分钟;4 s / 3 s在200 W)。(4)在PBS固定细胞迅速冲洗三次总共5分钟没有微波辐射其次是免疫荧光显微镜(见免疫荧光显微镜申请)。

3.2。笔记

两个盖玻片(毫米)放置在塑料培养皿中直径50毫米。大约4毫升的固定剂添加到培养皿。

如果使用文化菜直径100毫米,超过10盖玻片(毫米)可以固定10毫升的固定剂。

微波辐照,作者的实验室使用mi - 77型微波辐照装置(Azumaya、东京、日本)可控微波辐射功率和温度控制。

4所示。申请脱钙作用[26,27,33,44,45]

脱钙骨固定后获得良好的石蜡是至关重要的部分。脱钙骨的组织学研究组织需要很长时间,也就是说,有10%甲酸2 - 4天或1 - 2周有10% EDTA。

与微波辐射,可以减少处理时间1/5-1/10最初的准备时间。

4.1。脱钙作用的解决方案

10%的甲酸蒸馏水或10%中性EDTA。

4.2。评论

甲酸脱钙作用(1)所有程序,使用间歇微波辐射400 W (5 s / 5 s)。(2)准备时间减少到原来的1/10的过程。甲酸,辐照可以一夜之间进行。(3)甲酸溶液温度不应超过45°C。

EDTA脱钙作用(1)使用间歇微波辐射400 W (5 s / 5 s)。(2)准备时间减少到原来的1/10的过程。对EDTA脱钙作用,辐照可以执行2或3天。(3)EDTA溶液温度不应超过45°C。(4)每天脱钙作用解决方案应该被改变。

手术时间应该由每个研究员。处理时间应修改根据骨骼的大小和硬度。微波辐照,作者的实验室使用mi - 77型微波辐照装置(Azumaya、东京、日本)可控微波辐射功率和温度控制。

5。应用免疫组织化学(7,17,21,27,33,36,38,51- - - - - -53]

免疫组织化学实验,avidin-biotin复杂交互(ABC法)通常用于检测特定类型的蛋白质主要使用特定抗体(Vectastain ABC设备;向量的实验室,伯林盖姆,CA)。尽管这是一个完善的组织化学过程的调查,传统的协议为ABC方法需要2 - 3小时。微波辐射减少手术时间和背景噪音(51]。

根据标准方法Deparaffinization应该执行。deparaffinization后,微波辐射可以被应用。一个协议使用ABC免疫组织化学下面是复杂的。

5.1。协议

(1)Deparaffinize组织使用标准程序没有微波治疗。(2)H₂O₂执行治疗阻断内源性过氧化物酶与微波治疗(5分钟间歇辐射;5 s / 5 s在200 W)。(3)抗原检索应该执行在这个步骤(参见申请抗原检索石蜡包埋标本)。(4)洗与PBS短暂。(5)块屏蔽解决方案5分钟与微波治疗(5 s / 5 s在200 W)。(6)孵化与第一抗体与微波治疗5分钟(5 s / 5 s在200 W)。(7)清洗样品短暂与PBS 10 s - 1分钟没有微波治疗。(8)孵化与生物素化的anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白与微波治疗。(二次抗体变化根据第一抗体的起源。)(9)清洗样品短暂与PBS 1分钟没有微波治疗。(10)孵化与微波治疗Vectastain ABC解决方案3 - 5分钟(5 s / 5 s在200 W)。(11)清洗样品短暂与PBS两次每次1分钟没有微波治疗。(12)开发复杂ABC diaminobenzidine直到染色发展没有微波治疗。

所有的试剂都应该做好准备根据提供的手册Vectastain ABC工具包。

6。应用免疫荧光显微镜(35,37,42,50,54]

免疫荧光显微镜,微波辐照降低孵化时间的1/5-1/10原始时间。我们实验室协议染色的下面是几内亚猪主动脉和下腔静脉。这是血管免疫荧光染色的一个例子。下面的协议应该适用于其他组织,虽然微波治疗的确切辐照功率和时间应该由每个研究员。详细的培养细胞协议之前被报道(43]。

固定使用微波辐射(参阅申请组织固定),aortae冲洗几次PBS和切成小块,和在面临做好了准备。

6.1。协议

(1)Permeabilize PBS Triton x - 100 0.5%的组织没有微波照射5分钟。(2)10%的标本培养正常山羊血清5分钟间歇微波辐射(4 s / 3 s在200 W)。(3)标本是冲洗几次没有微波辐射与PBS。(4)孵化应该执行的主要抗体(在这种情况下,antipaxillin作为标记的细胞基质粘附斑位于网站的附着力)5分钟,间歇微波辐射(4 s / 3 s在200 W)。(5)冲洗标本与PBS好几次没有微波治疗。(6)孵化与微波辐射FITC-labeled二级抗体5分钟(4 s / 3 s在200 W)。(7)(可选)进一步染色染料可以执行,如rhodamine-labeled phalloidin f -肌动蛋白或碘化propidium核染色与微波辐射(4 s / 3 s在200 W)。(8)样品上滑动眼镜山,紧随其后的是免疫荧光或共焦激光扫描显微镜。

样品的温度不应超过40°C免疫荧光显微镜。

典型的一个例子双重染色anti-phosphotyrosine (PY-20)抗体(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)作为酪氨酸磷酸化蛋白质标记和rhodamine-labeled phalloidin肌动蛋白纤维染色显示在图1。上述协议适用于染色cryosections(参见[42])。参见石蜡包埋标本的免疫荧光显微镜其他作者(35,37]。

7所示。申请抗原检索石蜡包埋标本(23,37,46- - - - - -49]

一般来说,已与多聚甲醛固定石蜡包埋标本不适合免疫组织化学染色或原位杂交的掩蔽抗原位点的蛋白质与多聚甲醛交联。在一些formalin-fixed样本,某些蛋白质抗原蒙面根据甲醛蛋白质交联。因此,formalin-fixed样品需要抗原检索使用特殊治疗。燥热引起抗原检索通常用于检索蛋白质抗原表位的高压灭菌法或使用商用高压锅。燥热引起抗原固定样本检索有时造成损害。

传统程序涉及使用高压灭菌器与压力(121°C)。在某些情况下,一个家庭厨房微波炉使用(近100°C)。在许多情况下,组织在滑动眼镜变得独立,和高水平的背景噪音是由于高温的组织损伤。

使用专用微波辐照装置可以产生稳定的实验结果为研究[46,49]。

7.1。评论

(1)烧杯与抗原检索解决方案400毫升(例如,目标检索解决方案;DAKO Produktionsvej、丹麦)。(2)最大溶解温度:70°C - 99°C。(3)连续照射20 - 30分钟(间歇辐射:5 s / 5 s在400 W)。(4)精确的反应时间取决于每个研究员。

8。申请处理脂肪组织

胸腺、乳房和淋巴结标本是典型的脂肪组织(脂肪)。脂肪组织是困难的,因为固定的多聚甲醛的普及率低的解决方案。可怜的组织固定导致石蜡包埋组织破坏和“泡沫”部分。由于穷人多聚甲醛溶液的渗透,脂肪组织需要治疗二甲苯的混合物和甲醇后固定。一般来说,脂肪组织的治疗需要大约10 ~ 30小时。微波辐射,然而,固定时间可以显著减少对1/20-1/30固定好。

8.1。过程

以胸腺为例。

指申请组织固定的组织固定协议。(1)孵化固定脂肪组织在烧杯治疗解决方案:二甲苯:甲醇= 1:1(500毫升)。(2)间歇微波照射30 - 60分钟400 W (5 s / 5 s):替代治疗方案如果有沉积的脂肪。(3)在微波辐射,温度不应超过50°C。

辐照时间应该改变脂肪组织的体积。总辐照时间应该由每个研究员。

9。微波辐射的其他应用程序

9.1。申请电子显微镜

组织由电子显微镜分析通常是嵌入在ultramicrotomy树脂。虽然嵌入过程对化学成分不同,他们通常需要大约1周进行处理。在电子显微镜样品制备中,利用微波辐射降低了程序的时间只有2天没有任何损失组织样本的精细结构。我们的微波辐射技术固定似乎适用于透射和扫描电子显微镜(见图2SEM图像)。

指申请组织固定的组织固定协议。

9.2。协议

(1)Postfixation 1%四氧化锇与微波治疗15蒸馏水(所有程序在本协议使用间歇辐照,5 s / 5 s在200 W)。(1%醋酸双氧铀孵化与间歇微波辐照如果需要10分钟。)(2)酒精50%,微波照射5分钟。(3)酒精75%,微波照射5分钟。(4)酒精90%,微波照射5分钟。(5)酒精100%用微波照射5分钟×2倍。(6)氧化丙烯100%,微波照射5分钟×2次。

透射电子显微镜(56,57](7)氧化丙烯:环氧树脂= 1:1与微波辐射30 - 60分钟。(8)Ероху树脂100%,微波照射30 - 60分钟。(9)根据标准程序嵌入在环氧树脂(60°C) 15 - 20小时,其次是薄切片。

笔记。透射电子显微镜法,微波辐射还可以减少染色时间和铀酰乙酸酯和柠檬酸铅24,58]。

扫描电镜(55](7)转移到100%丁酒精用微波照射5分钟×2倍。(8)在高真空冷冻干燥样品。(9)脱水样品涂用离子溅射设备(又)和扫描电子显微镜观察到。

样品有/没有微波治疗如图2。

9.3。笔记

样本大小不应超过2毫米(增加大型标本时间> 2毫米的长度)。的最高温度不超过50°C。确切的时间应该由每个研究员。的最高温度不超过50°C在脱水过程中使用酒精系列(50% - -100%)。

在四氧化锇postfixation样品温度不应超过37°C时使用微波辐射。防止接触四氧化锇气体,应该执行过程在实验室通风柜。另外,postfixation可以执行常规1小时在室温下无微波辐射在严格封闭的有螺旋盖的瓶(1毫升1%锇酸溶液10毫升瓶)。

10。申请Cryosectioning [42]

冻结部分用于病理诊断、酶检测和immunofluorescent显微镜使用抗体。快速冻结期间,水结晶破坏组织。微波辐射降低了地层水的晶体在组织和维持精细结构。微波辐射混合与常用Tissue-Tek 10月化合物(樱花Finetek、东京、日本),可以很容易切。与未照射的标本相比,microwave-irradiated样本少泡沫在组织和结构保存完好。

指申请组织固定的组织固定协议。

10.1。协议

(1)cryoprotection,固定组织都沉浸在30%蔗糖溶液与微波照射到样本下沉烧杯的底部(所有程序在本协议使用间歇辐照,5 s / 5 s在200 W)。改变蔗糖溶液2 - 3次,以防止减少蔗糖浓度。(2)解剖样品成小块(5 - 10毫米)用一把锋利的刀。(3)浸泡了组织在10毫升Tissue-Tek /蔗糖溶液(1:1)在一个小烧杯或塑料瓶与微波辐射10 - 15分钟(5 s / 5 s在200 W)。(4)将上述组织放在保鲜膜(Bemis软包装,芝加哥,IL)放Tissue-Tek样本。(5)(可选)如果泡沫周围观察到的组织,样本可以用微波照射5分钟(5 s / 5 s在200 W),可以删除一些泡沫。(6)把Tissue-Tek预冷低温恒温器头,山上面示例中,放Tissue-Tek样品尽快。(7)快速冻结Tissue-Tek冷和样本HFC134a喷雾剂(CRYON: Oken-Syoji,日本东京)。(8)削减cryosections根据标准程序。

评论。当样品安装在预冷低温恒温器头,尽快冻结防止冰晶形成的样本。

11。申请特殊染色

等特殊染色,使用周期(PAM) acid-methenamine-silver污点,祈祷的召唤染色,Grimelius”方法,Fontana-Masson污点,六亚甲基四胺硝酸银Gomori-Grocott的变异和刚果红染色,微波辐照允许好的结果,而背景染色在很短的时间内。一般来说,上面的染色过程需要1 - 2小时,而微波辐射允许在5 - 10分钟内完成染色(1,3,5,7,8,59]。

12。结论

微波辐射可以应用在多聚甲醛固定和几种类型的染色过程。也大大减少了染色过程所需的时间,如免疫组织化学、免疫荧光显微镜和特殊染色的组织。此外,它降低了骨脱钙作用所需的时间。传统的微波炉不适合实验室使用,因为辐照功率过高或他们不允许权力和样品温度的精确控制。传统的微波炉的使用需要校准(60]。现代微波设备建立专门为实验室使用允许精确控制微波辐射和样品温度的力量。微波辐射应该是高度适用于许多组织学和细胞生物技术没有任何损失的形态学和免疫反应性的组织。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

补助金支持的工作报告是为推广项目先进的教育和研究,国立大学公司筑波大学的技术。

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