降低Caveolin-1表达在人类血管内皮细胞抑制信号转导对剪切应力的回应

文摘

血管内皮细胞有一个广泛的生理反应的剪切应力水平。有证据表明,蛋白质caveolin-1参与这种反应的早期阶段。在这项研究中,caveolin-1被RNAi人类内皮细胞表达下调。当这些细胞受到剪切应力的15达因/10分钟,Akt激活和ERK1/2明显低于控制细胞。此外,Akt激活和ERK1/2针对血管内皮生长因子显著低于细胞caveolin-1水平较低。然而,激活integrin-mediated信号在细胞粘附到纤连蛋白没有受到降低caveolin-1水平。总之,caveolin-1在内皮细胞的反应是一个重要的组件剪切应力。此外,结果表明,在这一过程中caveolin-1的作用在于促进高效VEGFR2-mediated信号。

1。介绍

血管内皮细胞(ECs)不断受到剪切应力引起的血液的流动。ECs积极响应这个剪应力的变化。他们可以将这些机械刺激转化为相关生物信号的过程称为转导(<一个href="#B1">1]。最著名的元素的早期阶段,这种反应是cell-anchoring整合蛋白(<一个href="#B2">2等)和某些膜相关受体,血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) [<一个href="#B3">3,<一个href="#B4">4)和g蛋白耦合受体(<一个href="#B5">5]。这些分子的初始活化后,生物信号传输到细胞的主要信号转导通路的激活,如增殖蛋白激酶(MAPK)途径,蛋白激酶B (PKB / Akt通路,和内皮一氧化氮合酶(以挪士)信号途径。这些事件导致细胞的功能反应,影响细胞凋亡和增殖率<一个href="#B1">1,<一个href="#B6">6),对炎症(<一个href="#B7">7),和细胞骨架重塑<一个href="#B8">8]。

研究表明,50纳米,omega-shaped膜内陷,称为小窝,与转导有关。大多数膜相关蛋白磷酸化的反应剪应力本地化这些域(<一个href="#B9">9,<一个href="#B10">10]。同时,ECs受到剪切应力,小窝在细胞膜的密度增加,调节信号通路的激活<一个href="#B11">11,<一个href="#B12">12]。此外,老鼠缺乏caveolar域的结构蛋白,caveolin-1,异常血管反应,当剪切应力是改变<一个href="#B13">13]。

为了获得更多的机械的见解的确切作用小窝EC对剪切应力,体外研究与caveolar函数直接进行干预。在一些研究中,胆固醇提取[小窝都中断了<一个href="#B9">9,<一个href="#B14">14,<一个href="#B15">15),在一项研究中caveolar功能抑制通过引入阻塞caveolin-1抗体(<一个href="#B16">16]。这些研究表明,干扰caveolar导致不良反应剪切应力函数,的特点是降低激活MAPKs [<一个href="#B9">9,<一个href="#B14">14,<一个href="#B16">16),一种蛋白激酶(<一个href="#B15">15),和以挪士<一个href="#B10">10]。

一个重要的分子生物学工具来研究蛋白质在细胞过程的作用是RNA干扰(RNAi)。通过使转染细胞与短核RNA)分子的序列互补的信使RNA蛋白质的兴趣,一个戏剧性的降低可以实现这种蛋白质的表达。工具是非常具体的,使用它的表达水平降低caveolin-1可能是有用的在确认的结果更多原油提取胆固醇的方法。

在这项研究中,我们使用RNAi人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)确认caveolin-1在EC转导的重要作用。我们还表明,降低caveolin-1水平导致VEGFR2信号受损,但不是信号转导,在这些细胞。这表明caveolin-1在VEGFR2激活下游信号转导在于耦合。

2。材料和方法

2.1。抗体和试剂

Caveolin-1 siRNA是买试剂盒(西萨塞克斯郡,爱尔兰)(猫。不。SI00299635);负控制核从英杰公司(美国加州)(隐形RNAi消极控制介质GC内容)。抗体immunodetection来自以下公司:caveolin-1(σ,密苏里州,美国;C4490),一种蛋白激酶(Abcam(英国剑桥);ab28422)、phospho-Akt (Abcam ab27773) ERK1 (Abcam ab9363) phospho-ERK(美国加州圣克鲁斯;sc - 7976), GAPDH (Abcam ab9485)、山羊anti-rabbit IgG-Alexa 633(分子探针、矿石、美国;A21071),山羊anti-rabbit IgG-HRP(σ,A0545)抗体和鼠标IgG-HRP(美国加州病菌;81 - 1620)。 All products for cell culturing were from Lonza (Breda, The Netherlands) except for the partially purified fibronectin, which was obtained as a coproduct during purification of human factor VIII at Sanquin, Amsterdam, The Netherlands, and which was used at 2 mg/mL in phosphate buffered saline (PBS) to coat surfaces for cell culture. All other reagents were from Sigma, except when specified differently.

2.2。Huvec隔离和培养

HUVECs脐带中分离的方法Jaffe et al。<一个href="#B17">17),使用胰蛋白酶溶液(0.05% (w / v)胰蛋白酶,0.02% (w / v) EDTA在PBS)。获得内皮细胞培养在fibronectin-coated培养瓶在内皮生长medium-2 (EGM-2),含2%胎牛血清,直到他们达到confluency。汇合的时候,细胞脱离表面使用胰蛋白酶溶液和稀释1:3瓶新鲜fibronectin-coated文化。细胞被保存在一个湿润孵化器(,通过8),之后他们被丢弃。

2.3。核转染

转染的前一天,HUVECs 6-well板被播种,每在EGM-2细胞。第二天,细胞被洗一次OptiMEM介质(美国俄克拉荷马州Gibco),然后与800年覆盖L OptiMEM。转染一个核,使用下面的协议。15L (20混有145 M核解决方案L (OptiMEM介质,在室温下15分钟。8L (Oligofectamine(表达载体)和32L OptiMEM, 5分钟后Oligofectamine混合物与核添加到管。复合物被允许形成15分钟,他们添加到细胞中。在孵化器4小时后,500年L EGM-2三倍于正常水平的牛血清被添加到井。隔夜孵化后,细胞被洗PBS和孵化在正常EGM-2 6小时。

2.4。细胞治疗

剪切应力实验,四井siRNA-transfected细胞使胰蛋白酶化和山肩fibronectin-coated玻璃板的40岁。细胞在EGM-2留给坚持了两个小时,之后媒介取代内皮基底medium-2 (EBM-2)饿死在一夜之间的细胞。第二天,转染后48小时,细胞受到剪切应力在一个定制的平行板流室。设置的所有部分都在使用前消毒。室由两个平行玻璃板,间距为0.6毫米的玻璃间隔器,由一个不锈钢住房。室是连接到一个包含200毫升玻璃储层剪切介质(中199年青霉素100单位/毫升和100年g / mL链霉素)和蠕动泵(Watson-Marlow,鹿特丹,荷兰)。设置的不同部分互相连接在一个封闭的回路使用硅胶管(5毫米内径Versitec硅胶,橡胶BV、荷兰),和整个设置在一个孵化器保持适当的培养条件。媒介是然后通过流泵室10到30分钟的速度每分钟200毫升。这个收益率剪应力的理论估计大约15达因/。治疗后,流室拆卸;这些细胞被100年与PBS和刮洗一次L冰冷的裂解缓冲(1% (w / v)特里同x - 100 / PBS添加蛋白酶抑制剂(4 - (2-aminoethyl) benzenesulfonyl氟化物,抑肽素A, e - 64, bestatin,亮抑酶肽,和抑肽酶和磷酸酶抑制剂(国内外LR、斑蝥素(−)-p-bromotetramisole钒酸钠、钼酸钠、酒石酸钠,和咪唑))。然后,冰的溶解产物是孵化15分钟和离心机10分钟。上层清液被转移到一个新管,使用bicinchonic酸测定蛋白质浓度测定(皮尔斯,Etten-Leur、荷兰)。的equivolume 2×Laemmli样品缓冲被加入到溶解产物。由此产生的样本煮5分钟,然后储存在直到使用。

小干扰rna转染细胞的VEGF刺激实验,孵化在生长介质,然后渴望与EBM-2 6小时。随后,转染后48小时,PBS的细胞被洗一次,其次是增加EBM-2 200 ng / mL。细胞被放在孵化器10分钟,之后准备如上所述溶菌产物。

整合素的活化实验进行如下。小干扰rna转染后,细胞在EBM-2挨饿过夜。第二天,转染后48小时,细胞使胰蛋白酶化,旋转下来,resuspended EBM-2 2毫升2% (w / v)牛血清白蛋白(BSA)。这些细胞被保存在悬挂在孵化器常数,光搅拌30分钟。然后,1毫升细胞悬液镀在fibronectin-coated表面,而剩下的细胞被剥离下来,与PBS洗一次,然后在裂解resuspended缓冲区。镀细胞离开坚持20分钟,之后准备如上所述溶菌产物。

2.5。免疫印迹和Immunodetection

样品受到钠十二烷基硫酸盐(SDS)聚(丙烯酰胺)凝胶电泳、免疫印迹,immunodetection根据共同的协议。不久,样本按大小分开10% (w / v)聚(丙烯酰胺)凝胶,和蛋白质带模式被转移到一家聚(亚乙烯基二氟化物)膜,使用Bio-Rad Mini-Protean 3系统。膜被1% (w / v)脱脂奶粉在25毫米三,150毫米氯化钠,0.05% (v / v) Tween-20 pH值8.3 (TBS-T)。主要的抗体被应用于膜阻断缓冲区,一夜之间。洗膜后TBS-T四次20秒,一次15分钟,二级抗体应用于膜阻碍缓冲一小时在室温下。相同的洗涤政权是重复,细胞膜是功能与西方SuperSignal毫微微衬底(皮尔斯)。三分钟后孵化,化学发光信号检测与柯达形象站CCD相机。

2.6。共焦显微镜

细胞被播种密度细胞每口井fibronectin-coated 12-well板玻璃盖玻片。他们用siRNA转染如前所述,但每口井的试剂的一半。转染后细胞孵化EGM-2一夜之间,然后用PBS,固定为4% (w / v)甲醛/ PBS在室温下15分钟。盖玻片被覆盖着透化作用缓冲(PBS和1毫克/毫升BSA和0 1% (w / v)特里同x - 100) 10分钟。主要抗体稀释在透化作用缓冲,然后孵化的盖玻片1小时。盖玻片是洗了三次5分钟与PBS和随后被覆盖着二级抗体在轻微透化作用缓冲(PBS和1毫克/毫升BSA和0.05% (w / v)特里同x - 100)。孵化后1小时盖玻片是清洗和100 ng / mL的解决方案6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)申请5分钟染细胞核。与PBS三个洗后,盖玻片是安装在显微镜载玻片用Mowiol (CalBiochem,达姆施塔特,德国)和存储在黑暗中,直到他们510年蔡司LSM共焦显微镜成像。估计的平均染色强度除以总执行信号场核的数量,确定利用ImageJ图像分析软件(<一个href="#B18">18]。

2.7。统计分析

信号强度immunodetection在西方使用ImageJ墨迹被量化。特定信号的强度归一化总蛋白质含量,所评估的加载控制在同一车道上。为了比较不同实验之间的信号强度,强度级别的一个示例之间的比率和总强度的样品,实验测定。这些规范化的平均比率绘制,代表标准偏差的误差。这些差异意味着被执行未配对进行统计显著性检测,双尾学生的以及。被认为是在统计上显著的差异值小于0。。

3所示。结果

3.1。在Ecs转导

为了研究转导在我们流室系统,HUVECs受到生理相关的剪切应力10分钟和30分钟。这些疗法后,细胞溶解产物被免疫印迹检测磷酸化Akt和ERK1/2。如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig1/" target="_blank">1,10分钟的剪切应力导致显著增强的一种蛋白激酶的磷酸化和ERK1/2。30分钟后的剪切应力,磷酸化水平下降值与静态情况。因此,我们决定为我们的研究集中在早期的计算到的caveolin-1 EC转导作用。

3.2。Caveolin-1 Downregulation

HUVECs caveolin-1 siRNA处理时,caveolin-1的表达显著降低,不到三分之一的caveolin-1水平未经处理的细胞,通过免疫印迹(见图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig2/" target="_blank">2(一)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig2/" target="_blank">2(b))。细胞转染与消极控制核时,没有检测到显著降低caveolin-1表达式,显示核的特异性治疗。此外,表达一种蛋白激酶和ERK1/2并不影响转染过程或caveolin-1降低的水平(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig2/" target="_blank">2(a))。的差别,对这些caveolin-1证实了使用immunocytofluorescence(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig2/" target="_blank">2(c))。显微镜使用相同的设置,染色强度大约是未经处理的细胞的高四倍比caveolin-1 siRNA-treated细胞。其余的caveolin-1 siRNA-treated细胞主要位于细胞核周围的区域,与缺乏强烈的膜染色的治疗和控制细胞RNA治疗。

(一)

(b)

(c)

图2

由RNAi Downregulation caveolin-1表达。HUVECs服用caveolin-1 siRNA -控制核,或不及时治疗。Caveolin-1水平测定转染后48小时。(一)细胞溶解产物的免疫印迹分析。等于加载每个转染条件保证了检测的蛋白质上的不相关的代谢酶GAPDH相同的污点。(b)在免疫印迹分析量化信号的强度。酒吧代表的平均强度caveolin-1乐队在七个单独的实验。误差棒表示标准偏差。Caveolin-1核细胞治疗Caveolin-1表达明显低于控制siRNA-treated细胞(,学生的以及)。未经处理的细胞之间没有发现显著差异和消极控制siRNA-treated细胞。酒吧代表平均七个独立的实验。(c) caveolin-1共焦显微成像。治疗细胞被固定和贴上caveolin-1抗体检测到Alexa 633 -耦合的二次抗体。核与DAPI染色。所有图片相同的显微镜拍摄设置。比例尺是50米。

3.3。转导与降低Caveolin-1 Ecs的水平

HUVECs与正常水平和降低caveolin-1受到生理水平的剪切应力在平行板流室。10分钟后的剪切应力、磷酸化状态的重要分子mechanotransducing Akt ERK1/2是由phospho-specific免疫印迹。总这些蛋白质表达水平没有影响核治疗,由免疫印迹(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig2/" target="_blank">2(a))。让HUVECs剪切应力后,一种蛋白激酶的磷酸化状态和ERK1/2增加(见图大约五到十倍<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig3/" target="_blank">3)。我们发现的激活信号转导通路显著低于caveolin-1 siRNA-treated细胞比消极对待控制核。没有发现显著差异的激活水平控制siRNA-treated细胞和未经处理的细胞。

(一)

(b)

图3

Akt激活和ERK1/2剪切应力。HUVECs转染了要么caveolin-1 siRNA -控制核,或不及时治疗。转染后48小时,细胞受到剪切应力约为15达因/10分钟。(一)治疗后,细胞是细胞溶解,磷酸化Akt和ERK1/2决心通过免疫印迹。等于加载每个转染条件保证了检测的蛋白质上的不相关的代谢酶GAPDH相同的污点。静态培养细胞的磷酸化状态显示为参考。(b)在免疫印迹分析量化信号的强度。每个酒吧代表四个不同的平均强度实验。误差棒表示标准偏差。Akt和ERK1/2磷酸化提高5 - 10倍时未经处理的细胞受到剪切应力。一种蛋白激酶和ERK1/2磷酸化显著降低(,,学生的以及)当细胞接受caveolin-1 siRNA而不是负控制核之前对细胞剪切应力。未经处理的细胞和细胞间无显著差异检测转染与消极控制核,表明转染过程本身没有影响。图代表了四个独立实验的平均值。

3.4。信号转导与降低Caveolin-1 Ecs的水平

为了揭示机制无效的转导细胞caveolin-1较低的水平,我们诱导信号转导通过激活细胞表面受体。我们选择激活的整合蛋白和VEGFR2,因为这些蛋白质转导的必要条件是众所周知的。为了评估integrin-mediated信号转导,细胞被保存在暂停30分钟然后fibronectin-coated表面镀了20分钟。当检查一种蛋白激酶的磷酸化状态和ERK1/2 phospho-specific免疫印迹,之间没有显著差异可以检测到信号转导通路的激活负控制低caveolin-1 siRNA-treated细胞和细胞水平(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig4/" target="_blank">4(一)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig4/" target="_blank">4(b))。激活VEGFR2是通过刺激缺乏细胞200 ng / mL10分钟。在这种情况下,细胞内信号转导被发现显著降低,治疗caveolin-1 siRNA比caveolin-1细胞与正常水平(见图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig4/" target="_blank">4(c)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/532432/fig4/" target="_blank">4(d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

Akt激活和ERK1/2对外部刺激的反应。HUVECs转染了要么caveolin-1 siRNA -控制核,或不及时治疗。转染后48小时,细胞受到刺激后。(a)、(b)细胞在悬浮30分钟,然后镀fibronectin-coated文化板块激活integrin-mediated信号。磷酸化Akt (a)和(b) ERK1/2相比显著增加细胞悬浮。激活水平没有显著差异检测HUVECs之间caveolin-1高或低的水平。(c), (d)细胞被饿死在基础培养基,然后用200 ng / mL VEGF治疗10分钟。(c)一种蛋白激酶和磷酸化(d) ERK1/2为了应对这种刺激显著低于细胞caveolin-1比水平较低,处理消极控制核()。所有的酒吧灯光都平均三个独立的实验。

4所示。讨论

我们的研究表明,降低人类ECs caveolin-1的表达水平RNAi抑制转导对剪切应力的回应。因此,我们确认小窝的重要作用的EC对剪切应力也被研究小组建议,干扰caveolar函数使用方法如胆固醇萃取(<一个href="#B14">14和抗体阻断<一个href="#B16">16]。

我们表明,一种蛋白激酶的激活和ERK1/2 caveolin-1降低的影响。在这两种情况下,这种降低会对细胞功能的影响。Akt是很出名的,在细胞生存和抗细胞凋亡中的作用。事实上,一种蛋白激酶的激活在剪切应力可以抑制细胞凋亡在ECs (<一个href="#B15">15,<一个href="#B19">19]。基于这些发现在这项研究中,一个较低的期望,ECs caveolin-1水平更敏感比未经处理的细胞凋亡时受到剪切应力。这将是一个有趣的和违反直觉的结果,因为缺乏caveolin-1通常呈现细胞凋亡(太敏感<一个href="#B20">20.]。这减少细胞凋亡敏感性的确切机制尚未阐明,尽管Akt通路绝对是涉及(<一个href="#B20">20.]。许多重要的膜受体ECs,如激活素受体激酶1 (ALK-1) [<一个href="#B21">21],VEGFR2 [<一个href="#B22">22),上皮生长因子受体(EGFR) [<一个href="#B23">23),已被证明和caveolin-1交往。此外,所有提到的受体已被证明产生一种蛋白激酶信号(<一个href="#B24">24- - - - - -<一个href="#B26">26]。因此,这些受体之间的关系和caveolin-1后者的差别,对这些基因可能是一个原因Akt激活和凋亡敏感性的变化。鉴于EC凋亡的重要性在动脉粥样硬化的发生和发展<一个href="#B27">27),未来的研究应该提供更多的洞察在这个执行的功能含义大大降低Akt激活细胞caveolin-1较少。

另一个著名的Akt激活下游效应是增加以挪士活动(<一个href="#B28">28]。基于我们发现降低水平的caveolin-1抑制Akt激活,可以预计,以挪士激活和由此产生的对血管的影响,如血管舒张,也受损。体外研究的确表明,以挪士激活和血管舒张反应流体较低的动脉caveolin-1基因敲除小鼠比野生型老鼠的血管<一个href="#B13">13]。

大大降低了激活ERK1/2针对剪切应力在caveolin-1 siRNA-treated ECs,我们描述在这项研究中还将有功能的影响。激活ERK1/2调节基因表达的一个重要的角色在应对剪切应力。两个很好的描述的例子表明,ERK1/2激活对剪切压力诱导增加至关重要的表达矩阵metalloprotease-9 [<一个href="#B29">29日和以挪士<一个href="#B30">30.]。没有ERK1/2激活我们的系统肯定会影响这些剪切压力诱导表达的变化。

当试图确定caveolin-1有助于转导的机制,我们首先决定调查反应的信号转导在这些细胞整合素结合。Integrin-mediated信号转导(是一个重要的过程<一个href="#B2">2,<一个href="#B31">31日]。此外,已经有多个报告caveolin-1的参与的信号通路(<一个href="#B32">32- - - - - -<一个href="#B34">34]。尽管这些报告,我们无法发现任何Akt激活的变化或ERK1/2 caveolin-1 siRNA-treated细胞和未经处理的细胞。可能是在我们的系统中其余caveolin-1仍足以正确诱导这些信号事件。我们的系统不同于上述报告中使用的细胞类型,caveolin-1水平,选择输出参数来确定有效的信号。基于我们的实验,我们可以得出结论,不太可能在我们的系统中看到的转导效率低下是由于受损的信号转导。

我们也决定调查在应对VEGF信号转导caveolin-1 siRNA-treated ECs。Ligand-independent激活VEGFR2转导(是另一个重要事件<一个href="#B3">3),刺激VEGF可以作为一种特别激活和监控信号网络的这一部分。caveolin-1在VEGF-induced信号转导的作用仍然是模糊的和可能取决于细胞类型和文化条件。的差别在一些细胞系统,对这些caveolin-1导致hyperactivation的信号转导途径<一个href="#B35">35]。此外,其他研究,关注的角色caveolin-1在VEGF-initiated信号表明,增加和减少的ECs的caveolin-1水平产生负面影响下游信号转导(<一个href="#B22">22,<一个href="#B36">36]。caveolin-1之间的直接联系和VEGFR2抑制活化的后者,但另一方面,协会也需要适当的起始生长因子受体激活后下游信号。此外,caveolin-1小鼠受损vasculogenic潜力,由于受损VEGF信号(<一个href="#B36">36]。也在我们的系统,降低caveolin-1水平有负面影响在信号转导ECs与VEGF的刺激。这表明缺乏转导ECs caveolin-1水平较低是由于caveolin-1扮演的重要的角色耦合VEGFR2激活下游信号事件。

基于本文中给出的结果,可以得出结论,caveolin-1需要激活的一种蛋白激酶和ERK1/2 ECs受到剪切应力。我们的研究结果表明,这些通路的激活受损ECs caveolin-1水平较低是由于低效VEGFR2信号。这项研究强调了EC caveolin-1在正常运作的重要性。ECs的caveolin-1在生物学中所扮演的角色和它对生理的影响体内血管变得越来越清晰。因为在内皮caveolin-1信号的重要性,这是一个潜在的临床应用的目标,例如,在肿瘤血管生成和动脉粥样硬化。因此,caveolin-1在EC剪切应力响应的作用绝对是值得研究的更多细节。