牛皮层膜在大鼠颅骨关键缺损中的促骨能力:组织学和免疫组织化学分析

抽象

辅助引导骨再生(GBR)过程的膜一直是促进这一修复过程的相容生物材料研究的主题。本研究通过评估GBR以及组织学、组织形态学和免疫组织化学反应，比较了不同的膜用于大鼠颅骨的关键尺寸缺陷。48只雄性白化大鼠随机分为4组(ñ = 12个，即C：无膜对照组（仅血块，阴性对照组）；BG：猪胶原膜组（Bio-Gide®阳性对照组）；GD：牛皮质膜组（第一实验组）；GDF：牛皮质膜较厚组（第二实验组）。术后30天和60天处死大鼠。组织计量分析的定量数据在以下情况下提交给双向方差分析和图基后验 。较厚的牛皮质膜在30和60天的组织形态学测量结果是有希望的，显示出更好的新骨形成值( ),和CD组呈现相似的结果在这两个分析期间，仅由GDF组被超过（ )。免疫组化结果与组织形态学数据相关。较薄的膜也有助于GBR。各膜均对GBR有促进作用，尤其是阳性对照组和实验组。

1.介绍

不足骨量的成功种植修复的主要挑战之一[1]。拔牙后，牙槽骨会经历垂直和水平方向的尺寸变化，拔牙后不久，颊骨板的再吸收会更加明显[2]. 在人类中，拔牙后12个月内水平尺寸明显减少50%，最具表现力的丧失发生在愈合的前3个月[3.]。

在20世纪80年代的种植牙治疗需求的增加刺激了外科技术的发展和完善骨移植，包括牙槽嵴保存程序[4]、牙槽骨牵张和引导骨再生(GBR) [5,6]。GBR是基于使用可再吸收的或不可再吸收的屏障膜，以防止某些类型的细胞迁移到骨缺损区域，如快速增长的上皮细胞和结缔组织，有利于的是能够执行骨新生物骨祖细胞的增殖的[5,6]。

在GBR中使用的膜是处理过程中必不可少的组成部分。该膜必须具有生物相容性，具有多孔性，允许等离子体和营养物质的扩散，并且必须是上皮细胞入侵的屏障[6]. 它还可以在血栓形成过程中保护脆弱的血管网[7]，保持支持其重量的尺寸稳定性，并抵抗相邻组织的压力。这些属性防止了临界空间的崩溃和随后的消除[6,8,9]。

屏障的生物材料可以从各种材料[制成6]。合成聚合物，如膨胀型聚四氟乙烯（E-PTFE），均膜用于GBR [第一材料6]。除了能够防止愈合过程中结缔组织和上皮组织的侵袭外，这些生物材料还具有足够的刚性来为成骨创造空间[6]。然而，它们可能较早接触口腔，导致骨移植材料受到污染，令骨再生困难[9,10]。

寻求克服这些障碍，天然聚合物组成的膜被开发[6]。这些膜的胶原蛋白可以从不同的牛或猪组织中提取，包括肌腱、真皮、心包和小肠[10], with a thickness of approximately 0.5 to 1 mm for clinical use [11]。这些膜的优点包括止血，趋化性到牙周膜细胞和齿龈成纤维细胞，免疫原性低，易于操作和适应的，并增加组织厚度[能力10]。

胶原蛋白经过巨噬细胞和多形核白细胞的酶降解，生成二氧化碳和水[10,11]. 膜的吸收是一个重要的特征。如果骨吸收发生在新生骨形成之前，它会导致骨移植的尺寸稳定性和损耗，从而损害GBR。然而，由于非功能膜降解产物的形成，延迟的再吸收可能对伤口愈合不利[10]。

牛皮质骨来源的I型胶原膜被组织很好地耐受[12- - - - - -14]。单核细胞和多核细胞在30 ~ 60天后完全再吸收[15]。最近，这种薄膜的新一代问世了。膜厚度的增加改善了GBR工艺。

一些因素可能干扰骨生物动力学和重建骨骨架的GBR。本研究的目的是评估的osteopromotor潜力三个胶原蛋白膜,两种膜的牛皮质骨与不同厚度(GenDerm®和GenDerm Flex®)和猪胶原膜(Bio-Gide®),在这个过程中安装在临界骨缺损后的GBR头顶的老鼠13- - - - - -16]在用组织形态计量学和免疫组织化学分析在30和60天。

2。材料和方法

本研究得到了Aracatuba牙科学校动物实验伦理委员会的批准(实验方案编号00217-2016)，并遵循了reach准则。

雄鼠四十八只，成年，三至四个月大(鼠形阿尔昆使用了大约200到300克重的材料。大鼠随机分为4组(每组12只)。他们被实施了30天的安乐死(ñ = 6）或60天(ñ= 6)术后。大鼠被关在笼子里，每个笼子养3只动物，喂食均衡饮食(NUVILAB, Curitiba, PR, Brazil)，含有1.4%的钙和0.8%的钾，并在Aracatuba的圣保罗州立大学牙科学院(UNESP)的vivarium免费取水。

2.1。手术过程

手术是在圣保罗州立大学牙科学院(UNESP)的vivarium进行的。术前禁食12小时，肌注盐酸氯胺酮(50 mg/kg Francotar;巴西圣保罗Vibrac do Brasil Ltda公司)与xylazine (5 mg/kg Rompun;拜耳动物保健公司，巴西圣保罗)。在颅骨区域进行三分术;用聚乙烯吡咯烷酮碘(PVPI, 10% Riodeine;Rioquimica, Sao Jose do里约热内卢Preto，巴西)和外用PVPI (10% Riodeine;在巴西的里奥克米卡(Rioquimica, Sao Jose do里约热内卢Preto, Brazil)和大鼠被放置在无菌的田野里。

A V-shaped incision of approximately 1 cm on each side was made in the scalp in the anterior region of the calvarium, allowing for reflection of a full-thickness flap in the posterior direction. An 8 mm diameter critical-size defect was made with a 7 mm internal diameter trephine (3i Implant Innovations, Inc., Palm Beach Gardens, USA) housed in a low-speed handpiece with continuous irrigation with sterile saline as previously described. The defect was made in the central portion of the calvaria involving the sagittal suture to maintain the integrity of the dura mater (Figure1)。

每组由12只动物组成。在C(凝块)组，外科手术的临界大小的缺陷填充了一个没有覆盖缺陷的血凝块。在BG (Bio-Gide®)组，外科手术的临界大小的缺陷被一个血块填充，并被猪胶原膜覆盖(Bio-Gide®;(Geistlich Pharma AG, Wolhusen，瑞士)。在GD (GenDerm®)组中，外科临界大小的缺损填充了一个血块，并用一层薄的牛胶原膜覆盖(GenDerm®;Baumer s.a.， Mogi Mirim，巴西)。在GDF (GenDerm Flex®)组中，外科临界大小的缺陷被血凝块填充，并被较厚的牛胶原膜覆盖(GenDerm Flex®;Baumer s.a.， Mogi Mirim，巴西)。

该过程之后，将软组织小心地重新定位，并使用可再吸收的缝合线在不同的平面缝合（聚乳酸，Vicril 4.0;爱惜康，约翰逊PROD，圣若泽多斯坎波斯，巴西）在深能级，和一个单丝线（mononylon，尼龙5.0;爱惜康，约翰逊PROD）间断缝合在最外部面而使用。

In the immediate postoperative period, each animal received a single and intramuscular dose of 0.2 ml of penicillin G benzathine (Veterinary Pentabiotic for Small Animals; Fort Dodge Saúde Animal Ltda., Campinas, SP, Brazil).

在术后30天和60天使用过量麻醉剂(硫喷妥钠，150毫克/公斤)对动物实施安乐死。将calvaria取出，放入10%甲醛溶液中静置48小时，在流动水中洗涤24小时，在20% EDTA中脱钙5周，在酒精溶液中脱水，透明。将制备好的颅骨纵向中间切开，分离骨缺损。所得的切片分别加到石蜡中μ得到m厚的切片。切片用苏木精和伊红染色。

2.2。形态分析

所有的形态学分析均采用带有AxioCam ICc相机(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)的双目光学显微镜进行，该双目光学显微镜带有×6.3、×12.5、×25和×40个透镜，以记录组织切片的图像。

显微镜下观察手术创面中心区域。定性分析通过肉眼观察是否存在肉芽组织/年轻纤维结缔组织、新形成的血管、成纤维细胞、成骨细胞和矿化骨基质、异物型肉芽肿、巨噬细胞和炎性多核巨细胞。

2.3。组织形态分析

用于组织形态计量学分析中，每周期（30天和60天术后）每个实验组的12个叶片进行了评估。具有附接的图像捕捉相机（R DC 300F;莱卡微系统公司）;使用光学显微镜（Leica微系统公司，希尔布鲁格，瑞士 - [R DMLB）进行测量。这些图像存储为TIFF文件，并使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，MD，USA）进行分析。存在于所有的骨缺损延伸骨组织的区域进行了评估。从分析中获得的数据转化到像素的绝对值以百分数为统计测试，以最小化由负尺寸差干扰。

2.4。统计分析

所有测试均使用SigmaPlot 12.3 (Systat Software, Inc.， San Jose, CA, USA)进行。最初，将数据提交给正态性检验(Shapiro-Wilk)，该检验识别同质数据( )。采用双因素方差分析(“膜”和“周期”)和“膜×周期”相互作用。此外，为了准确识别统计变化，采用了Tukey’s posttest。所有试验采用的显著性水平为5%。

2.5条。免疫组化分析

免疫组化参与免疫过氧化物酶活性的检测。内源性过氧化物酶活性通过过氧化氢抑制。随后，将载玻片处理使用磷酸盐柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），并使用脱脂奶粉以阻断内源性生物素抗原恢复。一级抗体是抗骨钙素（Santa Cruz公司，达拉斯，德克萨斯州，美国）和骨桥蛋白（Santa Cruz公司）。在驴（杰克逊ImmunoResearch Laboratories公司，西林，PA，USA）产生的生物素化的多克隆山羊次级抗体与抗生物素蛋白和生物素放大器试剂盒（Vector Laboratories公司，Burlingame的，CA，USA）中使用。二氨基联苯胺（Dako公司，Carpinteria的，CA，USA）用作色原体。此外，反应结束时对与哈里斯苏木切口染色进行。对于每种抗体，相关蛋白质的免疫标记强度通过分配不同的半定量得分评估，根据在骨修复过程免疫标记细胞的数目。使用上述R5 DMLB光学显微镜进行分析。免疫标记的强度进行评分为1至4，其中1是不存在的免疫染色和4是强烈标记。

三。结果

3.1。形态分析

采用光学显微镜对结果进行评估，并对四组切片进行标准化处理(见图)2和3.)。

3.1.1条。C组

(我)30天:在缺损边界附近有明显的大骨新生。关键缺陷的中心被疏松结缔组织填充，未建模。（ⅱ）60天:在没有完全封闭缺陷的情况下，缺陷残端更加接近。缺损中心为纤维结缔组织。

3.1.2。英国天然气集团

(我)30天:观察到大量新形成的骨组织，其间穿插有Bio-Gide®猪胶原膜碎片。在叶片中，从骨残端到缺损中心的新骨形成是明显的，在新形成的骨组织区域和结缔组织之间存在着膜残馀。在一些标本中，缺陷是闭合的。（ⅱ）60天:缺损边缘和中心新骨形成明显，与30天观察结果相似。然而，新形成的骨组织几乎填满了整个腔体。观察到残膜和组织良好的纤维结缔组织。

3.1.3。GD集团

(我)30天：缺陷区域是未修复的，朝向缺陷的中心观察到的新形成的骨组织。在较高的放大倍数，观察到膜碎片。骨新生物的面积分别为围绕膜碎片明显。（ⅱ）60天:在大部分缺损处发现新骨形成，但仅在一个标本中发现缺损完全闭合。膜碎片很少。

3.1.4。GDF集团

(我)30天：从残端向缺损中心可见新骨形成。在缺损周围，结缔组织仍被膜覆盖。在每个缺损的顶部观察到膜残留。在一些大鼠中，细胞膜包含有组织的结缔组织，这些结缔组织与许多成纤维细胞形成良好的血管。另一些则在膜的内表面发现新生骨组织。在膜的外表面附近观察到巨大的细胞。此外，还观察到结缔组织和成纤维细胞平行排列在膜和新形成的骨组织之间。一些标本证实了缺陷的闭合。（ⅱ）60天：在骨残端附近观察到一个大的骨新生，存在完全累及其内部骨组织和外部纤维结缔组织的膜残留。大多数标本可见缺损中心闭合。然而，也观察到未闭合缺陷的样本。在膜残体旁观察到大量的巨细胞。

3.2条。组织形态学分析

在组织形态评价(图4)骨修复的时间演变(组内分析)，在GDF组中，只有时间因素在30天和60天之间有统计学差异(Tukey’s test; );其他组无统计学差异:GD (Tukey’s test; ),BG（Tukey检验; ),和C (Tukey 's test; ),但在GD组中，观察到GBR的改善潜力。在组间分析中，GDF组较阳性对照组(Tukey’s test; );GD组和C组无统计学差异(Tukey’s test; )。

3.3。免疫组织化学分析

免疫组织化学分析的结果显示在图5和表1具体如下。

3.3.1。英国天然气集团

(我)骨桥蛋白：在30到60天的骨修复的显微照片显示光（+）和骨桥蛋白的蛋白质的中度（++）标签，分别。（ⅱ）骨钙素:骨修复30和60天后的显微照片显示，骨钙素生物标记物在残端和缺损中心有强烈的标记(+++)。

3.3.2。GD集团

(我)骨桥蛋白：30天时，检测到中度活动（++），表明修复过程的组织。60天时，轻阳性免疫标记显示骨基质形成减少。（ⅱ）骨钙素：30天时的骨修复表示为在中心中等至强烈的标记（++ / +++）。未找到结缔组织在此位置进行矿化。在60天，中度至剧烈的大多数骨缺损的标记（++ / +++）进行了观察。

3.3.3条。GDF集团

(我)骨桥蛋白：在30天，几乎所有的缺陷都关闭和强烈标记（+++）骨桥蛋白在两个细胞和骨基质的水平进行检测。在60天，几乎所有的缺陷用的骨桥蛋白（+）的光标记一旦新骨形成被定义封闭的，在骨细胞标记。（ⅱ）骨钙素：强烈标记（+++）在30和60天后观察。

4.讨论

GBR的主要目的是使骨缺损区域的骨再生一致且成功，并发症的风险较低。其次，GBR旨在以较少的手术干预、较低的患者发病率和较短的修复期获得成功的结果。在过去20年，在发展GBR的技术和材料方面取得了重大进展，以预期的方式实现再生的目标[17,18]。

控制缺陷（不凝块膜）的修复发生在以标准的方式，与骨形成被限制的缺陷和中心的边缘被纤维结缔组织被填充。通过引入在膜的形式的机械屏障，有增加了新形成的骨和组织再生的量。这是因为由阻挡，其分开骨组织内皮产生的空间的。由血液凝块初始填充的缺陷经历愈合过程，它导致更大的骨新生物对照相比疵时[19,20.]。

临界尺寸的骨缺损被认为具有最小的直径，并且在动物的整个生命周期中不会自动再生[21]。因此，只有那些真正能够在骨愈合协助生物材料将是显著优于凝块填充对照组[14]。根据多项研究，本研究中产生的8毫米直径骨缺损被认为是关键的[13,14,21,22]，结果这里提出。用于试验采用的30和60天安乐死的时间被认为是在其他的研究和用于表示在该动物模型的期间矿化和骨组织修复的成熟的[标准23,24]。

是否有模式和新生物骨量与使用不同类型的膜的区别在哪里？各种各样的GBR膜是市售的。的材料的选择应基于临床需要，并且该材料的基本性质应包括生物相容性，组织整合，空间的形成和维护，易于操作，限于易感性的并发症，和细胞闭塞，这避免了不期望的细胞的侵袭，如成纤维细胞[6,8,10]。

胶原膜取自不同的牛或猪的动物组织(肌腱、皮肤和肠道)[6,25]. 虽然胶原蛋白有许多优点，例如低免疫原性，吸引牙龈成纤维细胞的能力，以及生物相容性[10,25]，降解速率是高的和胶原可以不被维持的持续时间是足够的足够的组织再生[6]。胶原膜的可预测性取决于胶原蛋白的类型以及胶原蛋白必须经过的各种化学和物理过程，以消除杂质和稳定其组成纤维，这对于改善其机械性能和降低降解速度是必要的[6,10,25]。

BG组使用的可吸收Bio-Gide®膜由I型和III型纯猪胶原蛋白组成，不含交联或化学添加剂，并经过精制以去除抗原[12]。在文献中描述的劣化的期间为8周[变化26]到内4〜6个月[11,27]。在本研究中，在语形学分析中观察到的膜的在两个30和60天时的存在，并且没有观察到巨细胞。这些意见肯定，在60天（约8周），生物Gide®膜没有表现出恶化的迹象，因此可以被认为是一个缓慢降解膜。

所述阻挡结构包括两层。多孔表面与骨接触。的致密表面保持与软组织接触，以防止纤维组织的生长到骨缺损[28]。在BG组，在岛的形式中观察到的骨新生性和结缔组织较少细胞，这提示局部骨吸收和骨组织的渗透。这可能是由于膜，其允许血管生成的高渗透性。在30和60天，更多的缺陷被关闭，并在30天后的骨体积似乎被维持，直到修复过程的在60天结束。因此，BG组中使用的膜保持在骨修复过程的高级的性能，与以前的观察结果一致[11,27]。

GD组和GDF组使用的膜由脱钙牛皮质骨的I型胶原组成。根据制造商，GenDerm®膜厚度为150–200 μm，比GenDerm Flex®膜更薄，200-250μm、 GD组显示纤维细胞结缔组织，仅在30天和60天检测到GenDerm®膜的碎片，在60天观察到的碎片较少。这些结果证实了先前的研究，这些研究报告了膜碎片[14]或完全不存在该膜的[13,16]30天。

在GDF组，骨新生更进展。显微分析显示吸收较GD组慢。在一些大鼠中，可以在60天内验证几乎完整的膜的存在。多核巨细胞的观察膜的外表面GDF小组30和60天建议尝试吸收的生物材料,之前报道,可以改善GBR的结果,为外科医生提供其他选项来解决所遇到的困难在日常门诊14]。

GD组和GDF组比较发现，GD组骨新生面积比GDF组小，这可能与GenDerm®膜比GenDerm Flex®膜降解更快有直接关系。免疫组化检测发现GDF组和BG组有相似的生物学行为，骨桥蛋白和骨钙素标记物的比较证实了这一点。

膜厚度可以在具有相同成分的膜(GenDerm®和GenDerm Flex®)中进行分析。这对GD组和GDF组的GBR结果产生了负面影响，因为与较薄的膜相比，较厚的膜导致更有效的GBR过程。这可以解释为早期降解的膜在GD组，这允许结缔组织的生长缺陷。这可以抑制骨新生。膜厚度对其完整性的时间维持的影响已在前面描述过[13]。

选择适合特定临床问题的膜的标准是基于他们在研究中证明的生物行为的结果。在诸如牙槽骨保存、植入前或植入时牙槽骨嵴增强、骨内缺损等情况下，需要使用膜，GDF组证明GenDerm Flex®在这些情况下是一个高度可行的选择[29]。

一本研究的主要限制是对使用GenDermFlex®型膜的缺乏可用的参考材料。这可能反映其相对近期的商业化。在30天与60天期的分析也限制了膜，主要是生物Gide®，这60天没有表现出吸收的发作的证据完全吸收的评价。较长的评估期研究是有价值的。

五，结论

这些结果支持我们的结论，即我们检测的膜，Bio-Gide®，GenDerm®，和GenDerm Flex®，促进GBR在大鼠关键的颅骨缺陷。阳性对照组和GDF实验组在GBR过程中表现出更好的生物学行为和更高的骨新生指数。

数据可用性

本文包含了支持本研究结果的数据。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

感谢UNESP (FAPESP, 2016/12053-0)学校阿拉卡图巴牙科矿化组织研究实验室(LSMT)进行的免疫组化分析。

补充材料

到达指导清单。(补充材料)

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