可溶或不可溶组分的定量gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba微小体积的寄生虫蛋白应用:标准Lowry分析的简化gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

在涉及蛋白质的任何研究领域中，蛋白质定量通常是必不可少的一步。虽然标准Lowry分析法及其改进在蛋白质定量中使用最多，但现有的方法是刚性的，或者通常表现出蛋白质浓度和颜色强度之间的非线性。一种快速准确的方法e定性和/或定量测定从中分离的可溶性/不溶性总蛋白质或微孔板固定化蛋白质gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba本研究描述了微小体积的寄生虫。必须改进具有成本效益的技术，以便在资源有限的情况下增加研究产出。该方法是对已建立的劳瑞蛋白质定量分析方法的改进。用牛血清白蛋白(BSA)标准系列制备的标准曲线计算未知样品的浓度。优化后的试剂为2n NaOH(氢氧化钠)，2% NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(碳酸钠)，1% CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(硫酸铜)2% KNaCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba(酒石酸钾钠)，2n福林和Ciocalteu的苯酚。这种改进的蛋白质分析方法对定量分析很敏感gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba总粗提物或可溶性馏分中大约10-500范围内的蛋白质gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升(1-50gydF4y2BaμgydF4y2Ba这是一种简便、快速、准确的方法，用于在资源有限的研究实验室中以经济高效的方式定量微体积蛋白质，供常规使用。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

利什曼病是一种病媒传播的寄生虫病，在世界上分布较广。这种疾病是由该属的寄生原生动物引起的gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．由于非典型症状和治疗的显著毒性，疾病管理具有挑战性。因此，需要更好的患者管理和更广泛的病例分布。在这种情况下，大多数研究科学家都致力于开发工具或生物标记基于gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba用于疾病诊断、预后或涉及寄生虫抗原制备并需要蛋白质定量的治疗应用的蛋白质抗原[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在其他不同的临床或研究应用中也需要蛋白质定量。因此，许多研究人员和商业机构建立了不同的蛋白质定量分析方法。该方法的适用性取决于程序时间，需要蛋白质样品的数量、准确性、再现性和成本.gydF4y2Ba

在迄今报道的最常见的蛋白质分析中，Lowry蛋白质分析[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]缩二脲试验[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]是两种已建立且最古老的蛋白质定量方法。1972年，Lowry分析法被修改，以产生更高的颜色，样品浓度与颜色强度之间呈线性关系[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．1972年以后，不同的研究小组对标准劳瑞蛋白分析方法进行了多次修改。他们提高了存在干扰化学物质时蛋白质定量的准确性，提高了从干扰物质中快速定量回收可溶性和膜蛋白的方案，适用于96孔微量滴定板和自动微量板分光光度计，以及达到最大值并在足够长的时间内保持恒定的增强的光密度[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

同样在1976年，Bradford等人通过提供含有考马斯亮蓝染料的试剂描述了一种蛋白质定量的新方法。但它受到样品中洗涤剂的存在或蛋白质之间的广泛差异的不利影响[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。不同的研究小组随后介绍了几种蛋白质分析方法。这些方法包括使用考马斯亮蓝G250染料试剂在高氯酸或盐酸中进行的分析，以及使用蛋白质与碱性铜和双金鸡纳酸（BCA）反应进行的分析，一种可与多层干分析元件一起使用的分析方法，一种利用微波炉照射样品的改良BCA方案分析方法，以及一种全固相或微粒固定化蛋白质的过程[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

最近，更先进的肽和/或蛋白质定量方法被开发出来，用于质谱分析和医学应用中的蛋白质的电化学定量[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．此外，还有一些由知名商业供应商开发的蛋白质分析的商标[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在目前的研究中，我们描述了一种成本效益和高度准确的修改标准Lowry分析，用于定量总可溶性和粗蛋白提取gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba寄生虫的最小检测时间。这种分析方法在资源有限的情况下很有用。gydF4y2Ba

2.材料和方法gydF4y2Ba

2.1.仪器、材料和试剂gydF4y2Ba

吸光度测量采用岛津UV 1601紫外/可见分光光度计(岛津公司，京都，日本)，Thermo electronic公司Multiskan EX微版阅读器和Epoch 2微版分光光度计(BioTek仪器)。微量吸液管(0-20gydF4y2BaμgydF4y2Bal, 20 - 200gydF4y2BaμgydF4y2Bal、 和100-1000 gydF4y2BaμgydF4y2Ba使用Nichipet EXII微移液(来自Nichiryo)、微孔板(96孔)(Sterilin, Tentorio，意大利)和细胞培养所需的试剂[青霉素-链霉素(Penstrep)、热灭活胎牛血清(HI-FBS)、培养基199汉克平衡盐(M199)] (Gibco Life Technologies, Grand Island，美国)。所有其他化学试剂和试剂，包括磷酸二钠(钠gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)、磷酸二钠(NaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)、碳酸钠(钠gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)、硫酸铜(CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)、酒石酸钾钠(KNaCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba)，氢氧化钠(NaOH)， Folin和Ciocalteu的苯酚试剂，牛血清白蛋白(BSA/分数V)，来自Sigma-Aldrich(现在称为默克，圣路易斯，密苏里，美国)。gydF4y2Ba

２.２.制备的标准gydF4y2Ba

以BSA为参比标准。用与未知样品相同的试剂制备BSA标准样品[例如，去离子水，1XPBS (1X磷酸盐缓冲盐水)，含洗涤剂的裂解缓冲液(例如，1% triton X-100)，或不含洗涤剂的裂解缓冲液]。在本研究中，BSA原液浓度为1mg /ml，这是通过将1mg BSA溶于1ml去离子水中得到的。gydF4y2Ba

2．3.在微孔板中进行Lowry分析的方案gydF4y2Ba

BSA稀释系列(10 - 500gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml牛血清白蛋白)和未知样品(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL)加入分离井中，与20gydF4y2BaμgydF4y2Bal的NaOH (2 N)在摇板机中搅拌10分钟。100卷gydF4y2BaμgydF4y2Bal试剂混合物A(2%钠gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba, 1% CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 2% KNaCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba一百 : 1. : 向每个孔中加入1）并混合5分钟，然后在室温下培养10分钟 N、 二十 gydF4y2BaμgydF4y2BaL)，立即混匀，室温避光孵育30分钟。用酶标仪在650 nm处读取吸光度。gydF4y2Ba

２.４.方法验证和数据分析gydF4y2Ba

方法验证按照美国食品和药物管理局(FDA)分发的生物分析方法验证指南进行[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．通过评价基质效应来评价测定的选择性。据此评价稀释后的牛血清白蛋白标准品的平行度，并分析标准曲线。非特异性结合使用空白基质(无分析物)进行测定。空白基质测量的吸光度值与用分析物(BSA标准)测量的每个基质的吸光度值相比降低，从而避免了基质的任何干扰，增加了分析的选择性。该方法的重复性是通过对每个浓度进行10次测定来确定的，从而确定了该方法的准确性。6种不同浓度的BSA标准(10 30 100 150 300和500gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml)，计算M(均值)、SD(标准差)、M + 2SD(上限)、M-2SD(下限)和CV(变异系数)。采用上述6种不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)进行10次测定，分别在同一天在同一平板上运行和在20天内运行，进一步测定了批内(运行内)和批间(运行间)的精密度或重复性。如果在任何情况下观察到任何浓度的BSA的吸光度值超出了可接受的限度(M + 2SD和M-2SD之间)，则拒绝该值，并重复测定。间歇精密度也被测量在不同的时间(20天)，不同的设备(使用thermoelectron公司Multiskan EX微版阅读器和BioTek公司Epoch 2微版分光光度计)，和不同的试剂(五批不同的库存试剂配制)和在两个不同的实验室。采用6个选择的最低浓度(5、10、30、60、80、100)建立定量下限(LLOQ)gydF4y2BaμgydF4y2BaG /ml)，每种浓度10次。以重现性好、精密度高、准确度高的最高标准确定了定量上限(ULOQ)。使用6种不同浓度的牛血清白蛋白(包括LLOQ、低浓度、中浓度和高浓度)在每次试验中重复生成的标准曲线，测定测定的线性度。SDgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(零浓度下标准曲线截距)评价方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。其值为3 × SDgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba10 × SDgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba分别计算为LOD和LOQ [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．进一步测定原液和标准液的化学稳定性，以评估新分析方法的稳定性[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．对浓度未知的牛血清白蛋白样品进一步分析验证的分析，并与以下所述的大规模进行并已在家庭实验室建立的标准Lowry分析方法进行比较[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

2.5.在微型离心管中进行标准Lowry分析的方案gydF4y2Ba

BSA稀释系列(10 - 500gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml牛血清白蛋白)和未知样品(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL)分别加入微离心管中，与100混匀gydF4y2BaμgydF4y2Bal的NaOH (2n)100°C孵育10分钟，冷却至室温。1毫升的试剂混合物A(2%钠gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba, 1% CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 2% KNaCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba以100:1:1的比例)加入到每个试管中并混合好。试管在室温下孵育10分钟。福林和乔卡图的苯酚试剂(2 N, 100gydF4y2BaμgydF4y2BaL)，立即混匀，室温避光孵育30分钟。反应混合物的最终体积是1300gydF4y2BaμgydF4y2BaL在每个管子里。用紫外分光光度计在750 nm处读取吸光度。gydF4y2Ba

2.6。利什曼原虫蛋白质的定量分析gydF4y2Ba

利什曼虫gydF4y2Ba原鞭毛体在含有10% HI-FBS和0.1% Penstrep的完整M199培养基中生长[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．对数期晚期寄生虫，平均密度约1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞/ml被收集，颗粒在−20°C保存直到使用。原油gydF4y2Ba利什曼虫溶解产物gydF4y2Ba是从被采集的gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba采用冻融方法[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．在pH 7.4的0.01 M冷PBS中洗涤4次，并以1.0 g细胞颗粒的浓度在2.0 ml的0.01 M冷PBS中重悬。然后将悬浮液进行三次冻融(液氮冷冻30秒，室温解冻)。悬浮液中含有总粗裂解液，再以10000 g离心10分钟，分离含有粗裂解液可溶性部分的上清液。提取粗裂解液和可溶性部分蛋白质含量gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba粗裂解液使用验证过的微量lowry分析(我们使用去离子水制备BSA标准，因为只有2-5gydF4y2BaμgydF4y2Ba未知标本/粗抗原的L足够定量，制备至100gydF4y2BaμgydF4y2BaL使用去离子水)。gydF4y2Ba

2.7.使用新的分析方法监测微孔板抗原涂层不同缓冲液的效率gydF4y2Ba

分析了酶联免疫吸附试验(ELISA)中3种不同的抗原包被缓冲液，为后续应用选择最佳的包被缓冲液gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba用ELISA抗原。蛋白质与微孔板聚苯乙烯表面的结合通常是通过发生在碱性、中性和酸性缓冲液中的疏水相互作用完成的。本研究使用PBS (1X, pH 7.4)、磷酸盐缓冲液(0.02 M, pH 7.8)和碳酸盐缓冲液(0.05 M, pH 9.6)作为涂层缓冲液，因为其他研究人员广泛使用这些缓冲液gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba抗原制备及定量方法如上所述。等量抗原(3gydF4y2BaμgydF4y2BaG /well)的涂层。每个涂层缓冲液重复10次。每孔加入抗原(3gydF4y2BaμgydF4y2Bag/100 gydF4y2BaμgydF4y2Bal/well)，置于+4℃冰箱过夜。过夜孵育后，用PBS (1X, pH 7.4)冲洗三次，去除未结合的物质，用平板进行蛋白定量分析。对抗原包被孔进行了上述蛋白分析。在与上述涂膜孔平行的同一平板内进行一系列标准BSA稀释。用3种包覆缓冲液进行10个重复的M、SD和CV计算和分析，筛选出性能最好的包覆缓冲液用于后续的酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba抗原。gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

新分析方法对所测分析物具有很高的选择性。根据BSA稀释系列(10 ~ 500)的结果构建的标准曲线gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml)，检测的两个变量，牛血清白蛋白浓度和650 nm处的吸光度值呈线性关系，其中相关系数RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，为0.999（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）．gydF4y2Ba

选定浓度的牛血清白蛋白(10,30,100,150,300,500)的吸光度值gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml)均在可接受的限度内(上下限如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）．该方法的重复性为100%，CV小于10%，因此该方法对蛋白质定量具有较高的准确性。gydF4y2Ba

分析gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba批内和批间的重复性分析显示了每个标准曲线gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba> 0.99, CV <10%。LLOQ和ULOQ分别为10和500gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml，分别为标准偏差gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba约0.140 (0gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml)，如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．因此LOD (=3 × SDgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)和定量限(=10 × SDgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)计算为0.420 (280gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml）和1.400（1260 gydF4y2BaμgydF4y2Ba分别g / ml)。gydF4y2Ba

根据制造商对微孔板阅读器(Thermo electron公司Multiskan EX)的建议，在405 nm处的精确范围为典型值±1% (0-2.0 Abs)。用于测定的化学物质包括2 N NaOH, 1% CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba, 2% KNaCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba, 2%的钠gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 2 N福林在室温下单独不混存时，稳定性可达3年以上[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．2 N福林应在黑暗条件下保存，避免阳光直射。牛血清白蛋白的制备时间为1gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml，并在−20°C下保存，避免重复冻融循环。虽然ali报价BSA可以使用一个月以上，但建议在每次试验前制备新鲜BSA，以提高试验的准确性。gydF4y2Ba

所述方法显示了浓度为10–500的蛋白质的准确定量 gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升(1-50gydF4y2BaμgydF4y2Bag/assay)在标准曲线的线性范围内，因此与已建立的蛋白测定法相比，具有中等灵敏度(见表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）．gydF4y2Ba

在标准Lowry分析中，浓度未知的牛血清白蛋白样品的吸光度值分别为0.378 (750 nm)和0.448 (650 nm)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和新优化的Lowry分析（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，(图中红色箭头表示未知样品的浓度)。根据各检测方法的标准曲线，计算BSA样品浓度为334gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升和336年gydF4y2BaμgydF4y2Bag/ml。因此，新分析的分析性能与标准方法相当。gydF4y2Ba

根据新的测定方法，总粗蛋白提取率gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba1克寄生虫细胞颗粒中含有15毫克寄生虫。新方法也进行了试验gydF4y2Ba利什曼虫gydF4y2Ba粗抗原在1X PBS (0.01 M PBS)和triton X-100(1%)裂解缓冲液中。新方法对两种方法都有效，并观察了可比结果。gydF4y2Ba

尽管与PBS和碳酸盐缓冲液相比，磷酸盐缓冲液包被抗原的量较高，但与其他两种缓冲液相比，磷酸盐缓冲液包被抗原的10次重复精度较低(表1)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）．变异系数显示了各条件的精密度/准确度，其中磷酸盐缓冲液的CV最高，碳酸盐缓冲液的CV最低，小于10%，与其他缓冲液相比，具有较好的精密度。因此，碳酸盐缓冲液可用于1gydF4y2BaμgydF4y2Bag抗原/孔足以用于后续的ELISA应用。gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

尽管目前有许多已建立的蛋白质定量试剂盒，但这些试剂盒的效率根据不同的应用而有所不同。大多数产品的成本都很高。因此，开发和验证一种在资源有限的环境下用于常规研究的成本效益高的蛋白质定量方法是至关重要的。如上所述，测定验证使用了几个标准参数。在分析验证中，线性度是评价准确度最重要的指标之一。试验结果表明，该方法具有较高的精度gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba几乎等于1。而且重现性和重复性高，试剂稳定三年以上，灵敏度范围广(1-50gydF4y2BaμgydF4y2BaG /测定法)进一步表明新方法适用于常规研究。gydF4y2Ba

当考虑劳里分析背后的反应机制时，洛瑞等人在1951年描述了蛋白质与碱性铜反应,减少产生亚铜离子Folin-Ciocalteu产生特有的蓝色耦合的一种蛋白质在碱性铜的缓冲溶液与Folin-Ciocalteu试剂含有磷钼和磷钨酸(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．最近，Everette等人提出，反应机理既包括Folin-Ciocalteu试剂的还原，也包括芳香残基(主要是色氨酸和酪氨酸)的氧化。实验还表明，半胱氨酸对福林-丘卡图也有反应，蛋白质中的半胱氨酸残基也有助于Lowry分析中看到的吸光度[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

标准Lowry方法存在许多缺点，包括蛋白质浓度和颜色强度的非线性、方法刚性、重复性差，需要精确地定时添加试剂、立即涡旋和长时间孵育[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．1972年，哈特里发现了一种改进的洛瑞测定方法，该方法于1951年被描述为通过在高于环境温度的更浓的碱性酒石酸铜试剂中孵育蛋白样品，在650 nm处的吸光度之间存在正比关系，从而获得更高的显色率[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。尽管有不同的方法作为标准Lowry分析的修改，用于处理大量样品的实验室的特定目的，以及已经使用微孔板分光光度计用于其他目的的实验室，但迄今为止，还没有开发出获得线性b的方法蛋白质浓度与颜色强度之间的高精度关系[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）．这里所描述的新方法几乎克服了所有这些问题，而不需要在高于环境温度的温度下孵育。与标准Lowry分析方法相比，新方法在小范围内进行，使用更少的化学试剂或试剂、BSA标准品和未知样品。此外，在微孔板中，可以同时定量大量的样品。这减少了化学品或试剂、消耗品的成本，以及在基本的小型实验室环境中进行实验的时间。新方法避免了购买商业蛋白质定量试剂盒的要求。考虑到消耗品、化学品和设备的费用，每个样品的成本约为2.8美元。gydF4y2Ba

5.结论gydF4y2Ba

这是一种简化的标准Lowy蛋白分析，以相对简单和准确的方式定量寄生虫蛋白(在粗提取物，可溶性组分，或固定化到微滴度板)。这也是一种在蛋白质研究工作中使用的划算的方法，而不是使用昂贵的试剂盒或试剂。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

支持本文结论的数据包含在本文中。如有合理要求，可从通讯作者处获得更多细节。gydF4y2Ba

信息披露gydF4y2Ba

内容完全由作者负责，并不一定代表上述资金来源的官方观点。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明他们没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

BD、PS和YS概念化并设计了这个项目。BD开展项目，分析数据，撰写论文初稿。SW、TPA和NW对数据采集和技术指导作出了贡献。YS提供资金，指导BD的所有步骤，并对手稿进行严格审核。PS提供实验室设施和技术指导，审核稿件。朝鲜提供了后勤和行政支持。NW对手稿中重要的知识内容进行了严格的修改。所有作者都同意最终的手稿。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

我们感谢Dilusha Fernando、Nilusha Priyanthi、Yasasmi Gange、Sashika Dayananda、Himali Gunethilake和Nirosha Pathirana提供的技术援助。该产品已提交斯里兰卡国家知识产权局申请专利(国家专利LK/P/20443)。本文报道的研究得到了科伦坡大学研究基金(AP/3/2/2014/RG/13)和NIH/美国基金(R01AI099602)的支持。gydF4y2Ba

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