气相色谱/质谱分析挥发性代谢物在牛阴道分泌物和评估他们的生物活性

文摘

阴道分泌物的化学资料收集的奶牛发情和nonoestrus由气相色谱分析-质谱法(gc - ms)分析了建立任何定性差异可能在牛biocommunication潜在价值。八个不同的有机化合物被发现使用两个色谱图。发情的化学资料阴道分泌物显著区别的存在三个具体的物质,即三甲胺、乙酸和丙酸,没有出现在nonoestrus阶段。发情特定合成化合物被摩擦到nonoestrus动物的生殖器官区域(假牛),和公牛被允许嗅生殖器区域和观察到的性行为。统计学意义是高()在公牛队表现出重复flehmen和越来越多的行为对乙酸的混合物,丙酸和三甲胺相比,这些化合物单独测试。得出结论,是挥发性物质存在于牛发情期间阴道分泌物可以作为化学传播者。

1。介绍

信息素的作用在繁殖记录在几个种哺乳动物(1- - - - - -4]。pheromonal信号通过粪便排出,尿、阴道分泌物、唾液,扮演了一个重要的角色在专门的气味腺性和社会行为(5]。在牛,众所周知,公牛可以探测信息素气味和区分发情和nonoestrus尿液或阴道分泌物6- - - - - -8]。牛阴道粘液的物理和化学性质的长期利益生殖生物学家,因为粘液增强概念通过促进精子的生存能力和运输(9]。发情的女性吸引男性,并通知其接受状态通过化学信号产生阴道分泌物(10和尿液11]。有相当多的证据表明嗅觉组件产生阴道分泌物影响男性性行为在水牛12],仓鼠[13)、羊(14),和牛15,16]。此外,它报道,阴道分泌物的小母牛发情刺激的性活动和越来越多的行为(17]。

个体动物可能产生一些挥发性化合物的影响从单一来源信息素活动可能是一种化合物或化合物的混合物。因此,有必要分析个别挥发性化合物的生物活性鉴定牛阴道分泌物。然而,识别牛阴道分泌物和知识的挥发性化合物生物活性可能如何影响性行为仍然是迄今为止。本调查旨在分析阴道分泌物的化学和评估其生物活性。

2。材料和方法

2.1。样品收集

阴道分泌物收集从十二个健康的牛,牛在异国情调的牛饲养中心,Tanjore,印度。他们人工繁殖,雌性大约20到30个月大的时候,和男性30 - 36个月大。吃普通食物的同类动物的化学物质的存在已完全不同于确认化合物从阴道分泌物。相同的饮食提供了整个研究。检查/直肠定期执行的每个小母牛一或两周的间隔来验证正常子宫的内部器官形态变化。自阴道分泌物检测信息素的公牛更重要的是成功的发情检测在自然条件下,样本收集的基础上牛舔等行为,嗅探,flehmen,在自然条件下安装在发情和nonoestrus阶段。生殖系统的技术涉及直肠按摩或灌注管放置在阴道前我。样本筛选通过纱布或尼龙网(60 - 120μ米)的集合。筛选后,样本存储冻结在−20°C和分析了气相色谱质谱(gc - ms)。

2.2。样品分析

从特殊阶段收集的样品按照实验协议集中个体变异的影响降至最低。在初步研究中,九个有机溶剂,即正己烷、丙酮、甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、二氯甲烷、苯被用来从阴道分泌物样本中提取的化合物。使用不同的溶剂中,公牛最大响应(即展出。Flehmen)暴露在样品溶于乙醚。因此,这在整个研究溶剂使用。一式三份15毫升集中样本的采集标本,分别与15毫升的乙醚混合。上层清液过滤是硅胶柱(60 - 120目)在室温下30分钟。过滤提取体积减少到原来的1/5用液氮冷却凝结。

样本分馏和化学化合物,并用gc - ms鉴定(qp - 5050,日本岛津公司)。两毫升提取被注入到一个30米的玻璃毛细管柱气相系统膜厚度为0.25μ米(30×0.2毫米身份证涂UCON HB 2000)使用以下温度程序:最初的烤箱温度40°C 4分钟,增加到250°C在15°C / min,然后举行250°C 10分钟。气相是在计算机控制下运行70 eV。溶剂(乙醚)峰值为4.0分钟。阴道液体六次反复进行了分析,并进行反复核对和确认。然后确定化合物相比,标准在相同条件下运行。这些数据已经存储在一个紧凑的图书馆的化学物质(NIST 6221 b)。

2.3。行为分析

合成化合物分别采购和应用手动到nonoestrus动物的生殖器官区域(假牛)。公牛被允许嗅实验母牛的生殖器区域30分钟的一段时间。合成化合物与乙醚浸泡在用。乙醚是用于气相分析以及溶解合成化合物在不同浓度为例,0.5%,1.0%,2.0%,5.0%。因为1%的浓度oestrus-specific化合物被发现有效地诱发阴茎勃起的flehmen和其他行为越来越多,同一浓度的比率是1:1:1,在整个实验过程中用于评估生物活性。公牛Flehmen行为表现出的持续时间的假牛接受合成反应(发情和nonoestrus)化合物被记录。随后,其他的行为反应,如阴茎勃起,安装,和交配行为也记录下来。

2.4。统计分析

编译的数据使用SPSS统计软件10版本和受到方差分析(方差分析)与事后比较(单向)使用邓肯的多个范围测试(DMRT)。

3所示。结果

所示的gc - ms概要文件数据1和2是阴道分泌物的代表获得发情和nonoestrus时期。发情的阴道分泌物显示五个山峰和nonoestrus展出三峰。八个不同的山峰被发现在两个不同阶段的阴道分泌物(图1)。一个波动,3-hexanol,被发现在这两个阶段,而其他两个挥发物,环己烷3,3,5三甲基膦酸,发现只有在nonoestrus阴道分泌物(表1)。其中,三甲胺、乙酸和丙酸是独特的在发情阶段但nonoestrus缺席。5和6之间的峰值和峰值后7在nonoestrus称为污染物和不匹配任何相关化合物。阴道分泌物中标识的挥发性化合物分子量范围59至174道尔顿(表1)。

公牛的统计分析表明,flehmen行为极大地影响了三个合成化合物的混合物(比单个化合物)和控制(表样例3)。越来越多的活动和flehmen(表的数量3)是针对这三个化合物的混合物高于个人和组合。

结果表2总结了flehmen和越来越多的行为由男性响应者在合成化合物。个人合成化合物测试中乙酸和丙酸的组合显示比个人更高的性行为和醋酸和三甲胺的结合;丙酸和三甲胺。

4所示。讨论

目前的结果显示,乙酸,丙酸,三甲胺在发情阶段,但并没有发现出现在nonoestrus阶段。在化合物中确定发情阴道分泌物,乙酸和丙酸属于脂肪酸,和三甲胺的胺组。识别牛阴道分泌物挥发性脂肪酸的主要的报告是一致的短链脂肪酸,醋酸,道具,等渗,阴道分泌的恒河猴(18]。等挥发性脂肪族化合物也被证明在范围内的阴道分泌的灵长类动物,包括人类女性(19]。此外,(20.)报道,乙酸、丙酸和异丁酸在黑猩猩可以作为信息素。

在目前研究flehmen的公牛表现出高频响应暴露在发情样本以及合成化合物的混合测试。它清楚地表明,这三种oestrus-specific化合物可能充当性引诱剂(表1)。已经证明了嗅觉化学信号产生发情的雌性通过犁鼻器(VNO)促进席子flehmen反应在许多物种的行为通过表达式(20.,21]。目前发现进一步证实,确定化合物在发情和激活公牛山性引诱剂。

据报道,在一些哺乳动物,但混合物(信息素并不是单一的化合物22]。文献[23oestrus-specific]报道,三种成分,即乙酸,丙酸,1-iodo牛十一烷(牛)参与异性的吸引力。Oestrus-specific牛尿信号,1-iodo十一烷,成功识别出在我们实验室气相色谱与质谱(7]。同样,在目前研究乙酸的混合物,丙,三甲胺透露precopulatory行为的高发病率。发情迹象可能是通过阴道分泌物,尿液之后发起的,因此公牛回应道。因此,可能产生的化学信号从尿液和阴道分泌物可能共同行动的起始precopulatory行为和成功的性交。

5。结论

化学信号不太可能是基于独特的化合物的存在比浓度的相对比率在一个复杂的混合物(24]。这个概念通常被称为“束效应”(25,26),还提出,在特定的比率和挥发性化合物独特的组件可能带来pheromonal效应的存在。符合这个建议,目前的研究还揭示了,发情阴道分泌物包含三个特定的化合物,这可能是发情气味的基础。值得注意的是目前的研究行为反应显示出类似的结果使用合成化合物的混合物的发情阴道分泌物。我们得出这样的结论:特定的挥发性脂肪酸存在于牛发情期间阴道分泌物似乎参与沟通性。

确认

本文部分支持的UGC和DST -拳头,新德里。作者感谢纺织品委员会,班加罗尔,gc - ms分析。

引用

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