利用超声引导下细针穿刺所得标本诊断胰腺癌的分子生物学方法

抽象

我们回顾了内镜超声引导下细针穿刺(EUS-FNA)的应用，这是一种快速、安全、经济和准确的诊断方法，用于评估胰腺肿瘤。目前，EUS-FNA用于胰腺肿瘤的诊断和分期。在大多数研究中，EUS-FNA对胰腺恶性肿瘤的敏感性为75% ~ 94%，特异性接近100%。然而，EUS-FNA在诊断高分化或早期癌症方面有一定的局限性。最近的证据表明，使用EUS-FNA获得的标本进行分子生物学分析可以提高诊断的敏感性和特异性，特别是在边缘细胞学病例中。也有报道称，通过对EUS-FNA采集的标本进行遗传分析，可以获得关于患者对化疗反应、手术可切除性、转移时间和总体生存率的额外信息。其他研究表明，KRAS、MUC、p53、p16、S100P、SMAD4和microRNAs的分析有助于胰腺癌的诊断。在这篇文章中，我们描述了在胰腺疾病中使用EUS-FNA样本的遗传诊断技术的现状。我们还讨论了分子生物学分析在胰腺癌诊断中的作用。

1.简介

胰腺癌目前是日本癌症相关死亡的第五大原因，据估计每年死于胰腺癌的人数超过2万人。胰腺癌的5年生存率是5.5%,预后不良是由于疾病的检测困难在早期由于其高潜在恶性肿瘤,癌症转移的倾向,和癌症的高阻抗肿瘤药物水平。

内镜超声引导下的细针穿刺(EUS-FNA)于20世纪90年代初被引入临床，目前被认为是胰腺癌组织学诊断和分期中最有用的方法之一[1,2]。胰腺EUS-FNA是一种高效、微创的诊断和分期胰腺癌的方法。自2003年以来的各种研究发现EUS-FNA对胰腺实性肿物的敏感性为78%-95%;特异性,75% - -100%;阳性预测值98%-100%;阴性预测值46%-80%;准确性,78% - -95% (3.]。然而，EUS-FNA获得的标本是微小的和零散的，这样一个明确的诊断常常病理学家挑战。然而，重要的是要确定肿瘤的组织学亚型，特别是在不能切除的肿瘤，因为治疗方法的选择在很大程度上取决于亚型[1]。因此，需要提高EUS-FNA的诊断灵敏度和特异性。在本文中，我们描述的基因诊断技术的现状，并讨论了分子生物学分析的胰腺癌的诊断作用。

2.致癌基因

2.1。克尔斯顿大鼠肉瘤-2病毒

KRAS癌基因在人类恶性肿瘤如结肠癌、肺癌和卵巢癌中经常发生突变。在胰腺癌中，90%以上的患者样本中发现KRAS突变。最常见的突变是组成活跃的KRAS^G12D等位基因。有趣的是，KRAS突变经常在胰腺癌最常见的前体细胞病变——胰腺上皮内瘤变(PanIN)中检测到，这表明KRAS突变可能在早期胰腺癌中发挥潜在作用[4,5]。

多个研究组提出EUS-FNA获得的组织中存在KRAS基因突变，提高了胰腺癌诊断的准确性[3.,6- - - - - -8]。王等人。9评估了包括EUS-FNA在内的检测胰腺癌KRAS基因突变的新方法的有效性。他们对组织病理学和细胞病理学的活检进行了评估。胰腺癌患者中，88.9% (48/54;95%置信区间[CI]: 80.5%-97.2%)有KRAS基因突变(密码子12和13)，而61.1% (33/54;95% CI: 48.1%-74.1%)被组织病理学明确诊断。这些作者还报道，与血清CA19-9检测相比，KRAS突变检测的灵敏度(76.2%)和KRAS突变与血清CA19-9联合检测的灵敏度(81%)显著高于血清CA19-9单独检测的灵敏度(52.4%)。logistic回归模型显示KRAS突变显著(优势比= 5.830;置信区间:1.531—-22.199,)，而不是血清CA19-9。

Bournet等报道66%的EUS-FNA胰腺腺癌样本中发现了密码子-12 KRAS点突变[10]。慢性胰腺炎无KRAS突变。在该研究中，仅通过细胞病理学诊断胰腺腺癌与慢性胰腺炎获得了以下值:敏感性为83%;特异性,100%;阳性预测值100%;阴性预测值为56%;整体精度86%。将KRAS突变分析与细胞病理学结合，分别达到88%、100%、100%、63%和90%。Bournet等人还指出，当慢性胰腺炎呈假瘤阴性(野生型KRAS)时，KRAS分析以及EUS-FNA活检有助于强烈提示良性病变。Reicher等人的研究表明，常规细胞学与荧光原位杂交(FISH)和KRAS分析相结合，可以提高EUS-FNA对胰腺固体肿物的诊断率[11]。

Takahashi等人。报道说，EUS-FNA与另外KRAS突变分析的细胞学和组织病理学分析是对的良性分化与恶性胰腺肿块，高度精确[7]。在本研究调查，对于细胞病理学诊断的62胰腺癌病例中，KRAS点突变在无恶性肿瘤的结果50％病例（2/4）中发现，在71％（5/7）的，其中恶性怀疑，并且在其中恶性被诊断的病例的76％（39/51）的情况下（表1)。相对于组织病理学诊断（表2), KRAS基因点突变检测在43%(3/7)的病例材料不足的结果,那些没有恶性肿瘤的64%(7/11),80%(4/5)的病例发现的异型性,在80%(12/15)的情况下,怀疑为恶性肿瘤,而在83%(20/24)的病例被诊断为恶性肿瘤。这些研究表明，通过EUS-FNA分析KRAS突变的样本可以提高胰腺癌的诊断水平。此外，这种分析方法比结合传统方法更有用。

3.肿瘤抑制基因

3.1。p53

p53抑癌基因失活在几乎所有人类癌症中都很常见[12]。在细胞周期调控正常p53蛋白的功能，在维持基因组稳定性，并在受控的细胞死亡（凋亡）。突变的p53蛋白是能够灭活p53的正常功能在细胞中，甚至在正常（野生型）蛋白的存在。p53基因最失活突变包括在该改变所得p53蛋白的氨基酸组成进化上保守的结构域的单点突变。大部分失活p53基因导致突变p53蛋白的稳定性增强。在正常条件下，在细胞核中的p53蛋白水平是不能通过标准的蛋白质免疫组织化学检测的，但是与p53基因表达的细胞，p53蛋白的积累是很容易检测的。p53肿瘤抑制基因的失活是胰腺癌常见，在50％-70发现例[％的13- - - - - -15]。

Itoi等对取自慢性胰腺炎和胰腺癌的FNA活检标本进行了p53免疫组化分析[16]。观察他们报告说,p53蛋白超表达与胰腺癌67%的样品,但不是与慢性胰腺炎样本,他们发现通过使用p53蛋白进行靶向治疗和常规组织学检查,胰腺癌的诊断改进如下:敏感性90%,特异性91%,和92%的准确率,而常规组织学EUS-FNA胰腺肿块的诊断测试统计数据如下:76%的敏感性，91%的特异性，79%的准确性。

Jahng等报道，p53与细胞学联合检测恶性肿瘤的敏感性为51%，特异度为100%，而单独细胞学检测的敏感性为41%，特异度为100% [17]。

3.2。p16 (CDKN2A INK4)

编码细胞周期调控蛋白p16的基因定位于染色体9p21带。p16基因的突变与多种癌症的风险增加有关，该基因的改变经常在癌细胞系中出现。胰腺腺癌常与p16基因突变有关[18,19]。

在EUS-FNA标本中，p16突变对胰腺癌诊断的敏感性和特异性分别为13%和100%。然而，当通过监测杂合性损失(LOH)进行检测时，9p位点等位基因损失的灵敏度提高到85% [20.]。

3.3。SMAD4 (DPC4)

SMAD4经常在许多癌症中被发现突变。它作为肿瘤抑制因子，参与TGF-的调控β信号转导通路，负向调节上皮细胞和细胞外基质的生长。SMAD4在大约55%的胰腺癌中失活，可能是纯合缺失(30%)，也可能是基因内突变和第二等位基因缺失(25%)[21]。

LOH上18Q与SMAD4在EUS-FNA的43％检测到来自慢性胰腺炎标本和在EUS-FNA的78％的胰腺癌样本[20.]。在本研究中，使用用于胰腺癌的诊断测试LOH在与SMAD4，所述胰腺癌的敏感性和特异性的染色体位置18Q分别为78％和57％。

4.糖基化的蛋白质

4.1。民大

粘蛋白（MUCs）都是高度糖基化的高分子量的糖蛋白，在各种恶性肿瘤的异常表达谱[22]。据报道，目前已鉴定出至少14个不同的基因MUC基因。在正常情况下，粘蛋白对上皮组织起保护作用。黏液蛋白的表达和结构的改变已被报道在肿瘤前病变和肿瘤病变中[23,24]。在胰腺癌组织标本，MUC1（膜结合的泛上皮粘蛋白）和MUC6（胃幽门腺型分泌粘蛋白）和MUC5AC的从头表达（胃表面的分泌型粘蛋白）的过表达已经观察到早事件在PANIN和浸润性导管腺癌的所有阶段胰腺癌发生，而具有相关联MUC2（肠型分泌粘蛋白）杯状细胞化生表达在大多数研究的极其罕见的事件。

Giorgadze等检测了EUS-FNA样本细胞阻滞切片上MUC1、−2、−5AC和−6的上皮表达谱[25]。他们观察到MUC1的表达和-6但非肿瘤胰腺样品中不是MUC2或-5AC的。在鉴别良性条件导管腺癌MUC5AC表达证明更好的操作比任MUC1或MUC6特性。这些作者使用了三种抗体的面板，和MUC1的组合+ / MUC2- / MUC5AC +是在导管癌样品的70.0％注意到。

Wang等人免疫组化研究了MUC1、MUC2和MUC5AC在EUS-FNA胰腺占位性病变标本中的表达[26]：MUC1，MUC2，和胰腺癌中表达MUC5AC的患病率分别为77.5％（31/40），10.0％（4/40），和80.0％（32/40），以及在良性胰腺疾病的对应的值分别为25％（4/16），31.3％（5/16），和43.8％（7/16）。如表3.他们研究了MUC1+细胞学检查和MUC5AC+细胞学检查联合应用是否比单纯的细胞学检查更能提高胰腺癌诊断的敏感性和准确性。Carrara等发现，MUC7在导管腺癌中的患病率为73.0% [27];MUC7表达在腺癌中高度显著(），交界为导管内乳头状粘液性肿瘤（IPMN）（)。在检查的慢性胰腺炎病例中，有37.5%表达MUC7。

EUS-FNA活检标本中的MUC表达谱对胰腺癌及黏液性肿瘤的诊断有较高价值。在胰腺占位性病变的临床诊断中可发挥重要作用。

5.钙结合蛋白

5.1。S100P

钙结合蛋白S100家族的成员。S100P是一种95氨基酸蛋白质[28]。S100P表达在许多不同的癌症中描述，并且其表达与耐药性，转移，和不良临床结果相关联。S100P已经显示介导的肿瘤生长，耐药性，并转移通过RAGE（受体晚期糖化终产物）[29]。多项研究表明，S100P在胰腺导管腺癌中高度过表达[30.- - - - - -33]。几项研究使用EUS-FNA [审查胰腺癌的诊断S100P的有用性34- - - - - -36]。Deng等人[36提示S100P对6例组织学证实为胰腺腺癌的非典型可疑病例的敏感性为100%，特异度为92.8%，诊断准确率为100%。Daniel等报道S100P在EUS-FNA获得的细胞学标本中具有90%的敏感性和67%的特异性，可用于诊断胰腺腺癌。他们还研究了其他在胰腺腺癌中过表达的蛋白。,prostate stem cell antigen, fascin, 14-3-3 sigma, and mesothelin), and they confirmed that S100P was the best marker to diagnose pancreatic adenocarcinoma. These results suggest that the use of S100P in the molecular diagnosis of pancreatic adenocarcinoma using EUS-FNA can increase the diagnostic accuracy for pancreatic cancer.

6.小分子核糖核酸(microrna)

MicroRNAs (miRNAs)是长度为17至27个核苷酸的小的非编码RNA分子。miRNAs在多种生物过程中发挥重要作用，如细胞发育和分化以及细胞增殖的控制。MiRNAs在几乎所有的人类癌症类型中都异常表达，据报道，MiRNAs可能作为肿瘤抑制子或癌基因发挥作用，而miRNA表达的改变可能在肿瘤发生和癌症进展中发挥关键作用。在我们最近的研究中，我们发现抗糖尿病药物二甲双胍在胃癌细胞中改变了多种mirna [37]。Preis等人在手术切除的胰腺癌组织和EUS-FNA样本中使用光强度分析研究细胞角蛋白19 (CK19)阳性上皮细胞中的miRNA表达[38]。在他们的研究中，与良性病变胰腺导管细胞相比，EUS-FNA样本中胰腺癌细胞中miR-10b的表达水平升高。他们还发现，癌细胞中较低水平的miR-10b与对基于吉西他滨的新辅助放化疗、手术切除、转移时间和总生存率的改善相关。

然而，mirna是使用EUS-FNA标本进行胰腺癌分子生物学分析的一个相对新的焦点。miRNAs可能最终成为诊断胰腺癌的有用因素，但还需要进一步的研究。

7.EUS-FNA的分子诊断

琼斯等人。报道的24名胰腺癌全面的遗传分析，2008年[39]。他们发现胰腺癌平均包含63个基因改变，其中大部分是点突变。这些改变定义了核心的12个细胞信号通路和过程(包括KRAS、TGF-)β在67%到100%的肿瘤中，信号传导和p16基因都发生了改变。这些发现不仅对胰腺癌的治疗有帮助，而且对胰腺癌的诊断方法也有帮助。有了上述基因，EUS-FNA对胰腺癌的诊断率可能会提高。

有许多基因被报道与胰腺癌相关，但关于EUS-FNA用于胰腺癌分子诊断的基因报道较少。GNAS基因编码α-刺激G蛋白的亚基(Gα或多个），其介导腺苷酸环化酶活性通过G蛋白 - 偶联受体的调节。正在激活GNAS的突变IPMN [据报道盛行40]。GNAS在大约60%的IPMN中发生突变，在一些与IPMN相关的侵袭性胰腺癌中发生突变[41]。

BRAF是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶Raf激酶家族的成员。该蛋白在MAP激酶/ERKs信号通路中起调节作用，影响细胞分裂、分化和分泌。BRAF基因被致癌RAS激活，导致细胞对生长因子信号做出反应的协同效应。Schonleben等人通过直接基因组测序对36例IPMN/IPMC(导管内乳头黏液癌)样本中BRAF的突变进行了评估[42]。外显子5，图11和15，用于BRAF进行了研究。一个错义突变（2.7％）被鉴定BRAF的外显子15内。突变似乎是体细胞，因为在相应的正常组织中没有检测到相同的改变。Schönleben等。认为BRAF的致癌特性有助于IPMN / IPMC的肿瘤发生。胰腺癌的EUS-FNA使用这些基因，值得进一步研究的诊断。

8.结论

EUS-FNA是一种快速、安全、经济、准确的胰腺肿瘤诊断方法。EUS-FNA对胰腺恶性肿瘤的敏感性为75% ~ 94%，在大多数研究中特异度接近100% [35,43,44]。然而，EUS-FNA在分化良好的腺癌和反应性改变之间进行区分，因为重叠的肿瘤和无功导管上皮之间细胞学特征的，有一些限制。因此，假阴性率和非典型的或可疑的诊断仍相对较高。

基于本文，我们可以构建一种反映EUS-FNA样本中胰腺癌与良性病变鉴别最有效方法的诊断算法。由于EUS-FNA仍具有最高的诊断相关性，其预测值可达100%，同时具有可接受的敏感性和特异性，因此仍应是胰腺局灶性肿块检查的首选方法。只有一部分EUS-FNA非结论性样本应进一步进行遗传分析，而使用各种标记进行分子诊断的阳性病例应进行治疗。未来对EUS-FNA和遗传分析的研究有望获得更多信息，以改善胰腺癌患者对化疗的反应、手术可切除性、转移时间和总体生存率[45- - - - - -47]。

如表4通过遗传分析胰腺癌诊断的总结报告，我们的纸指示基因诊断可能是提高EUS-FNA的诊断灵敏度和特异性是有用的，特别是在不能被肯定地通过形态学单独呈现那些临界病例。

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