文摘

目标。我们旨在确定姜黄素的影响在棕榈酸- (PA)诱导人类osteoblast-like Saos-2细胞凋亡和探索潜在的分子机制在体外的水平。方法。Saos-2细胞培养与PA或没有姜黄素,防治(南京、抗氧化剂),3-methyladenine (3-MA,自噬抑制剂)ay - 22989(自噬受体激动剂)或H₂O₂。然后,爸爸单独或结合姜黄素对生存能力的影响,细胞凋亡,氧化应激,和自噬被CCK-8发现,流式细胞术测定和免疫印迹。结果。我们发现自噬诱导氧化应激激活,细胞凋亡被提升在PA-induced Saos-2细胞。姜黄素抑制PA-induced氧化应激,在Saos-2细胞自噬和细胞凋亡。南京成功减毒氧化应激和细胞凋亡,3-MA减毒氧化应激和细胞凋亡在palmitate-induced Saos-2细胞。有趣的是,南汽抑制PA-induced自噬,但3-MA没有明显的氧化应激的影响在PA-treated Saos-2细胞。此外,姜黄素抑制H₂O₂(氧化应激受体激动剂)全身的氧化应激,自噬和凋亡,但姜黄素没有明显影响全身的ay - 22989(自噬受体激动剂)自噬和凋亡。结论。目前的研究表明,氧化应激是一个自噬的诱导物,姜黄素可以减弱过度自噬抑制氧化应激和细胞凋亡的PA-induced Saos-2细胞。

1。介绍

糖尿病是一种流行的代谢疾病,在世界范围内分布。糖尿病患者有不同的骨骼疾病,包括骨质疏松或骨质疏松症1]。饮食中富含高脂肪的食物,特别是饱和脂肪,通常导致代谢综合征的临床症状,如肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病,最终增加骨质疏松症的可能性2]。此外,肥胖和2型糖尿病引发长期循环游离脂肪酸水平的高度(远期运费协议)特别是饱和远期运费协议,如棕榈酸酯(PA),导致lipotoxicity在许多细胞类型,包括人类osteoblast-like Saos-2细胞(3]。此外,PA-induced lipotoxicity起着至关重要的作用在骨质疏松的开发和发展4,5]。许多研究都集中在因素参与的机制PA-induced lipotoxicity,如氧化应激和自噬(5]。

氧化应激之间本质上是一个不平衡的生成活性氧(ROS)和身体的能力来抵消或解毒有害影响通过中和抗氧化剂(6]。ROS产生在所有细胞间的接触有毒代理人和线粒体呼吸的自然副产品,扰乱正常的细胞信号机制和功能,导致DNA损伤和细胞凋亡7]。先前的研究已经报道,氧化应激中起着重要的作用在许多疾病的病理生理学,包括骨质疏松症(6]。

自噬是一个复杂的真核生物中的分解过程,使细胞通过溶酶体的降解回收细胞质组件。在压力条件下,营养不足和氧化应激等,激活自噬途径促进细胞存活,保持能源和减少有毒物质(8]。此外,有越来越多的证据表明,过度或不受控制的水平的自噬可能是必不可少的细胞凋亡在某些设置(9]。此外,有研究表明,自噬与糖尿病性骨质疏松症(8)和氧化应激据报道是一个新颖的自噬诱导物(10]。

姜黄素,non-flavonoid多酚植物姜黄中进行了广泛的调查,因为其抗炎、氧化和cytoprotective属性(11]。先前的研究已经报道,姜黄素是一种很有前途的药物预防和治疗糖尿病和糖尿病引起的疾病,包括骨质疏松症(12]。此外,氧化应激和自噬相关糖尿病骨质疏松症(13]。此外,以往的研究报道,姜黄素可以调节氧化应激和自噬在体内和体外14]。

在这项研究中,我们旨在确定姜黄素的影响在人类osteoblast-like PA-induced Saos-2细胞凋亡和探索潜在的分子机制在体外的水平。在此,我们研究了氧化应激的参与和关系和自噬和评估的作用和分子机制姜黄素在PA-induced Saos-2细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

Saos-2细胞在DMEM培养补充10%的边后卫,50μ青霉素g / mL, 50μg / mL庆大霉素在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。当细胞达到70% -80%融合,他们对待不同浓度(1.25 -20μ姜黄素和200 M)µM PA来确定其对细胞活性的影响。与此同时,这些细胞被暴露于200年µ10 M PA的存在与否µ姜黄素,5毫米3-MA, 10µ100 ay - 22989,µM H₂O₂或2毫米NAC 24 h。

2.2。测量细胞的生存能力

在治疗后,10μl CCK-8被添加到每个好,2 h细胞被孵化的37°C。可行的细胞的数量为450 nm的标(Bio-Rad 680)。给出的结果是作为一个未经处理的控制测量细胞的百分比值。

2.3。细胞凋亡检测

治疗后,细胞凋亡是量化的膜联蛋白V-FITC /π凋亡分析工具根据制造商的指示。分析了细胞用流式细胞分析仪(Becton, Dickinson和公司,美国)在1 h。早期凋亡细胞计数测定膜联蛋白的百分比V-FITC + /π−细胞进行凋亡细胞计数得到的膜联蛋白的百分比V-FITC + / PI +细胞和坏死细胞被发现通过计算膜联蛋白的百分比V-FITC−/ PI +细胞和膜联蛋白V-FITC−/π−细胞。

2.4。免疫印迹

治疗后,收集细胞,用冰冷的PBS和细胞溶解里帕缓冲区,和总蛋白浓度测定用BCA化验。50微克的总蛋白从每个样本被加载到13% sds - page凝胶,然后,通过电泳分离蛋白质。蛋白质被转移到PVDF膜。阻塞后TBST 10%脱脂奶2 h,样本与孵化主要抗体b细胞lymphoma-2 (bcl - 2, 1: 1000)、bcl - 2 X相关蛋白(伯灵顿,1:500),glyceraldehyde-phosphate脱氢酶(GAPDH, 1: 2000),自噬蛋白5 (ATG5 1: 1000), polyubiquitin-binding蛋白质(P62, 1: 1000)和microtubule-associated蛋白轻链3 (LC3, 1: 1000)在一夜之间在4°C。洗后,膜与二次孵化抗体(1:4000)结合辣根过氧化物酶在37°C为30分钟。免疫反应性的乐队是可视化使用超级信号西方Pico装备根据制造商的指示,和蛋白质的密度乐队使用ImageJ被光密度测量分析软件1.48(马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院、美国)。

2.5。mCherry-GFP-LC3腺病毒转染和自噬检测

细胞培养在24-well板块(1×105个细胞/)与mCherry-GFP-LC3腺病毒转染40莫伊24 h。转染后细胞孵化用新鲜培养基再次24 h。GFP的数量和mCherry点每个细胞数在荧光显微镜下三个随机选择的字段(奥林巴斯公司(日本东京)。绿色荧光蛋白在酸性环境中降解,而mCherry不。因此,黄色斑点(由红色和绿色的重叠)表明自噬小体,而红点表示自噬溶酶体。如果激活自噬,红色的信号将在黄色占主导地位。如果自噬抑制,将会有更多的黄色信号比红色信号。

2.6。ROS测量

治疗后,细胞与DCFH-DA孵化(10µ在37°C M) 20分钟。然后,细胞与PBS随后被洗了三次,和细胞评估ROS-sensitive染料在倒置荧光显微镜下观察(奥林巴斯公司(日本东京)的激发波长488 nm和发射波长525 nm)。荧光强度使用ImageJ 1.48收购图像分析软件。

2.7。超氧化物歧化酶(SOD)的检测

治疗后,细胞收获和用PBS包含1.0毫米PMSF获得细胞匀浆。匀浆被离心机,享年15000岁15分钟和4°C,蛋白质含量是决定使用BCA蛋白质化验设备。然后,上层清液用于测量细胞SOD。SOD活性测定在使用标450海里(Bio-Rad 680)。

2.8。Caspase-3活动测量

治疗后,细胞被离心收获,在冰上裂解缓冲孵化了15分钟。溶菌产物被离心机,享年15000岁15分钟和4°C,蛋白质含量是决定使用BCA蛋白质化验设备根据制造商的指示。然后,每个样本与Caspase-3孵化基质在37°C的微型板块4 h。样本使用标仪测量405海里。

2.9。统计分析

所有的实验都为每组至少重复三次,和数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)。分析的数据是单向方差分析(方差分析)以及Fisher最小显著差学生的测试和独立样本t以及用SPSS软件,版本13.0(美国SPSS,芝加哥,IL)。时被认为是具有统计学意义的差异 。

3所示。结果

3.1。姜黄素减毒PA-Induced细胞生存能力降低Saos-2细胞和细胞凋亡

我们首先评估了姜黄素的细胞毒性(1.25、2.5、5、10、20μM) Saos-2细胞。CCK-8结果表明,-10 - 1.25μ姜黄素无明显的细胞毒性,但20μM姜黄素细胞生存能力降低(图24 h后的文化1(一))。此外,200年µM PA和1.25 -20μM姜黄素被添加到培养基24 h,以确定姜黄素的影响在PA-induced Saos-2细胞生存能力。结果表明,200年µM PA细胞生存能力减少了约50%,-10 - 1.25μM姜黄素预防以剂量依赖性的方式降低细胞生存能力。然而,20μM姜黄素对细胞生存能力没有明显的影响与控制治疗(图1 (b))。流式细胞仪分析显示,姜黄素预防细胞凋亡引起的PA剂量依赖性的方式。然而,20μM姜黄素PA-induced细胞凋亡(图没有明显的影响1 (c))。比色测定和免疫印迹结果表明,姜黄素的伯灵顿的表达和Caspase-3但bcl - 2的表达增加PA-treated Saos-2细胞(数字1 (d)和1 (e))。

3.2。姜黄素减少PA-Induced氧化应激和Saos-2细胞自噬

确定姜黄素对氧化应激的影响,自噬在PA-treated Saos-2细胞,这些细胞被处理200µ-10年1.25 M PA有或没有μM姜黄素24 h和氧化应激相关参数进行了分析。DCFH-DA试验表明PA细胞内ROS增加生产,但姜黄素治疗降低了PA-induced ROS生成dose-depend方式(图2(一个))。此外,PA的抗氧化剂酶SOD的活性降低,这是-10年1.25获救μ姜黄素在剂量依赖性的方式(图2 (b))。这些结果表明,姜黄素变弱PA-induced Saos-2细胞的细胞凋亡。免疫印迹结果表明,200年μM PA治疗增加了ATG5的蛋白表达和LC3II p62的退化。与此同时,我们发现的蛋白表达水平ATG5和LC3II PA-treated细胞明显减少,但p62姜黄素后添加不同剂量的增加(数据2 (c)- - - - - -2 (f))。

3.3。氧化应激和自噬的角色在姜黄素的保护作用PA-Induced Saos-2细胞凋亡

因为氧化应激和自噬Saos-2期间可以诱导细胞凋亡,我们设计了以下实验确定氧化应激和自噬是否参与PA-induced Saos-2细胞凋亡。氧化应激剂NAC和自噬抑制剂3-MA被添加到培养基中PA治疗。CCK-8测定结果表明,南汽和3-MA明显增加细胞生存能力PA-induced Saos-2细胞(图3(一个))。流式细胞术结果显示,南汽和3-MA减少细胞凋亡引起的PA(数字3 (b)和3 (c))。免疫印迹和比色测定结果表明,伯灵顿的减少和Caspase-3表达式和bcl - 2表达的增加也救出了南汽和3-MA PA-induced Saos-2细胞(数字3 (d)和3 (e))。此外,南汽和3-MA姜黄素一样的保护作用在PA-induced Saos-2细胞凋亡。因此,这些结果表明,巴勒斯坦权力机构通过刺激氧化应激和细胞凋亡Saos-2细胞激活自噬,姜黄素可能减弱细胞通过抑制氧化应激细胞凋亡和自噬。

3.4。氧化应激的关系和自噬姜黄素的保护作用PA-Induced Saos-2细胞

以确定是否存在氧化应激与自噬在PA-induced Saos-2细胞,我们评估了氧化应激参数和自噬制造商PA-induced Saos-2细胞有或没有南汽和3-MA。氧化压力参数的结果表明,南汽,但不是3-MA,抑制ROS的生成和(差别SOD对这些数字4(一)- - - - - -4 (c)),这表明南汽,但不是3-MA,废除PA-induced氧化应激。此外,南汽和3-MA明显减少了蛋白质含量ATG5和LC3II P62退化(数字4 (d)- - - - - -4 (g))。此外,南汽和3-MA治疗抑制PA-induced增加自噬体和自吞噬泡(数字4 (h)和4(我)),表明南汽和3-MA缓解PA-activated自噬。因此,南汽,但不是3-MA,同样的效果为姜黄素在Saos-2 PA-induced氧化应激和自噬细胞。这些结果表明,氧化应激是一个自噬的诱导物PA-induced Saos-2细胞,姜黄素可以减少氧化应激和氧化压力诱导自噬在PA-induced Saos-2细胞。

3.5。姜黄素对氧化应激的影响——或者Autophagy-Induced Saos-2细胞凋亡

进一步探讨了氧化应激的角色和自噬机制的姜黄素的保护作用PA-induced Saos-2细胞凋亡,我们增加了氧化应激诱导物H₂O₂或自噬兴奋剂ay - 22989培养基有或没有姜黄素。结果表明,H₂O₂和ay - 22989明显减少细胞生存能力和诱导细胞凋亡Saos-2细胞(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。姜黄素改善细胞活力,防止细胞凋亡,凋亡调控基因的表达改变(Caspase-3、伯灵顿和bcl - 2)在H₂O₂对待Saos-2细胞(数字5 (d)和5 (e))。然而,姜黄素没有保护作用ay - 22989诱导Saos-2细胞凋亡和细胞生存能力下降。这些结果表明,姜黄素抑制氧化应激细胞凋亡在Saos-2 autophagy-induced凋亡细胞。

3.6。姜黄素对氧化应激的影响或在Saos-2细胞自噬

此外,我们评估后氧化应激和自噬增加H₂O₂或ay - 22989培养基有或没有姜黄素。结果表明,H₂O₂增加活性氧的水平和抑制Saos-2中超氧化物歧化酶(SOD)的活性细胞(数字6(一)- - - - - -6 (c))。姜黄素减少活性氧的水平和提高SOD的活性在H₂O₂对待Saos-2细胞。ay - 22989并没有改变活性氧的水平或Saos-2中超氧化物歧化酶(SOD)的活性细胞。表达的免疫印迹分析表明,ATG5 LC3II和退化P62增加H₂O₂和ay - 22989治疗Saos-2细胞(数字6 (d)- - - - - -6 (g))。我们还发现,自噬小体的形成和自溶酶体增加,表明H₂O₂和ay - 22989激活自噬在Saos-2细胞(数字6 (h)和6(我))。姜黄素的表达减少ATG5 LC3II, P62退化,形成自噬体和自吞噬泡在H₂O₂治疗但不是ay - 22989治疗Saos-2细胞。这些结果表明,姜黄素抑制氧化应激和氧化压力诱导自噬,但没有对自噬在Saos-2细胞有直接影响。

4所示。讨论

在过去的几十年里,显著增加2型糖尿病的流行,我们对血脂异常的作用的理解和lipotoxicity在许多疾病有了显著的增长。高脂血症和骨质疏松症之间的关系建立了临床和实验模型(15]。棕榈酸酯是主要的饱和FFA等离子体激发ROS生产和自噬活动培养心肌细胞和内皮细胞16]。在我们之前的研究中,我们报道了PA触发Saos-2通过过度自噬细胞凋亡(3,几项研究已经报道,姜黄素保护细胞免受氧化stress-mediated凋亡[14,17]。然而,姜黄素对PA-treated细胞的冷冻保存效果和潜在的机制并没有被报道。首次在这里,我们表明,姜黄素可以减弱PA-induced Saos-2通过抑制氧化应激细胞凋亡和自噬(图7)。

姜黄素的药理作用,包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗氧化和防冷冻的活动(18,19]。在我们的研究中,姜黄素获救PA-induced细胞生存能力降低和细胞凋亡。我们的结果不同于先前的研究报道,姜黄素引发细胞凋亡在许多肿瘤细胞,包括HT29细胞(20.)和上层aerodigestive呼吸道癌症细胞(21),这表明姜黄素是一个潜在的抗癌药物。与此同时,我们的研究结果进一步支持这样的结论:姜黄素保护细胞免受各种伤害,如缺血性损伤(18,22)和糖尿病(23,24体内和体外。因此,姜黄素似乎有双向影响细胞增殖和细胞凋亡。一方面,它能促进细胞凋亡,尤其是在癌细胞;另一方面,它可以防止细胞凋亡。不同的结果的原因(细胞死亡或生活)由于姜黄素可能是由于细胞类型的差异,药物剂量,和实验方法。

我们进一步研究了凋亡调控基因,包括Caspase-3,伯灵顿,bcl - 2。结果表明,姜黄素pro-apoptotic分子伯灵顿的表达降低,增加抗凋亡分子bcl - 2的表达。我们的研究结果与以前的研究结果一致,报道,姜黄素改善细胞凋亡调节蛋白bcl - 2家族,可下调伯灵顿和上调bcl - 2表达25]。在Caspase-mediated凋亡Caspase-3充当刽子手,Caspase-3积极的表达与细胞的凋亡率(11]。在我们的研究中,我们发现,姜黄素可以抑制Caspase-3活动,表明姜黄素可以通过抑制Caspase-3维持细胞生存。因此,我们建议姜黄素影响细胞增殖和细胞凋亡在PA-treated细胞通过调节bcl - 2家族蛋白质和减轻Caspase-3活动。

在以前的研究中,发现氧化应激参与PA-mediated凋亡的过程(7,26]。此外,ROS生产氧化应激是一个特别破坏性的一面。过剩的自由基引起的细胞凋亡是当活性氧产量超过抗氧化防御系统的能力(7]。在我们的研究中,我们发现,PA增强ROS生成。SOD是一种抗氧化剂,保护细胞免受氧化损伤。然而,SOD的差别,对这些基因的进一步促进氧化应激和损伤细胞。先前的研究已经表明,姜黄素可以防止细胞损伤通过抑制氧化应激(27]。我们的数据表明,姜黄素减轻氧化应激方式存在剂量依赖的相关性,表明姜黄素的保护能力以防止PA-induced Saos-2细胞氧化应激。

自噬是一个重要的细胞内大量退化过程涉及lysosome-dependent受损的胞质蛋白和细胞器,周转率和至关重要的维护正常细胞表型和功能。然而,过度自噬引起细胞凋亡破坏大比例的细胞质和细胞器28]。在我们之前的研究中我们发现,PA剂量和时间的方式激活自噬在Saos-2细胞。此外,PA-induced过度自噬在Saos-2引起细胞凋亡细胞。此外,我们分析了姜黄素在PA-induced自噬的影响。结果表明,PA成功地诱导autophagy-related基因的表达和姜黄素剂量依赖性地抑制自噬,这表明姜黄素屏蔽。

阐明氧化应激和自噬是否触发PA-induced Saos-2细胞凋亡,我们使用了氧化应激剂NAC治疗和自噬抑制剂3-MA Saos-2细胞在治疗。细胞凋亡抑制了南汽和3-MA。这些结果进一步表明,PA-induced氧化应激和自噬引起Saos-2细胞凋亡。结果姜黄素抑制自噬,氧化应激和细胞凋亡表明姜黄素可能减弱细胞凋亡抑制氧化应激和自噬PA-induced Saos-2细胞。

之前的研究表明,氧化应激可以诱导自噬在饥饿条件下(29日]。与先前的研究一致,我们发现H₂O₂在Saos-2细胞激活自噬。此外,PA-induced NAC Saos-2细胞自噬活动抑制。此外,ay - 22989和3-MA没有影响Saos-2细胞有或没有治疗。这些结果表明,氧化应激是一个自噬的诱导物PA-induced Saos-2细胞。然而,目前尚不清楚是否姜黄素直接影响自噬在PA-induced Saos-2细胞。此外,一些研究也报道,姜黄素诱导自噬激活,如在骨肉瘤MG63细胞(30.和口腔癌细胞31日]。

进一步确定姜黄素在Saos-2细胞自噬的影响,我们使用ay - 22989激活自噬在治疗。结果表明,姜黄素对自噬和autophagy-induced凋亡没有明显的影响,表明姜黄素对细胞自噬在Saos-2没有影响。此外,我们发现,细胞凋亡,引起氧化应激,自噬H₂O₂获救的姜黄素,表明姜黄素可以抑制氧化应激在Saos-2细胞自噬和细胞凋亡。

总之,我们发现,姜黄素可以抑制PA-induced氧化应激,自噬和凋亡。此外,先前的研究已经报道,氧化应激可以激活这些流程在许多细胞和组织(7,32]。我们的研究结果表明,NAC可以抑制PA-induced自噬但3-MA没有明显的氧化应激的影响与PA Saos-2细胞治疗。因此,我们假设姜黄素间接抑制PA-induced自噬通过抑制氧化应激。为了进一步澄清这一假设,我们发现姜黄素抑制H₂O₂全身的氧化应激,自噬和凋亡,但姜黄素没有明显的对ay - 22989诱导自噬的影响。因此,姜黄素改善PA-induced人类Saos-2细胞凋亡通过抑制氧化stress-mediated自噬。然而,在我们的研究中仍有一个显著的限制。姜黄素的影响在lipotoxicity Saos-2细胞在我们目前的研究可能不代表人类糖尿病骨质疏松症的实际情况。因此,本研究的第一步是评估使用但是要治疗的时间里姜黄素作为的病原体糖尿病骨质疏松症。为此,我们打算建立一个动物模型,进一步证实了我们的结论一样。

5。结论

这是第一个研究报告,姜黄素预防PA-induced人类Saos-2通过抑制氧化应激细胞凋亡和自噬(图7)。我们的结果可能会提供新的见解lipotoxicity的分子机制和治疗糖尿病骨质疏松症。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

LY和QL设计工作;LY的构思和监督工作;BM和GG执行实验,进行了统计分析,并解释结果;LY GG和起草了这项研究。BM和GG了同样的工作。

确认

这项研究得到了江西省自然科学基金(没有。20192 bab215011),江西省卫生委员会的项目(20193010和20193010号),和项目江西省教育科学与技术系(GJJ180901)。