文摘
众所周知,抗氧化剂对健康是有益的。本文评估潜在chemopreventive和酚类化合物的抗癌属性出现在葡萄汁从秋天皇家提取(GJE)和莱比品种。这些GJE生存能力的影响(SRB天试验)和转移的潜在(迁移和入侵参数)结肠癌细胞系HT-29和sw - 480进行了评估。GJE的影响在两个基质金属蛋白酶基因表达式(MMP2和MMP9)也通过存在评估。在前,GJE减少细胞细胞株剂量依赖性的方式生存。GJE治疗也减少了细胞迁移和入侵。此外,MMP-2和MMP-9基因表达减少取决于提取和细胞类型。结论。这些结果提供新颖的信息关于抗癌的特性选择GJE揭示选择性细胞毒性和减少结肠癌细胞侵袭性的能力。
1。介绍
流行病学数据和研究在动物模型建立了定期进行膳食摄入的水果和蔬菜是预防癌症1]。具体来说,葡萄(葡萄l .)归因于促进健康的影响与多酚含量升高(2]。报告的好处包括抗炎、抗癌的,immune-stimulatory效果,这被认为是由polyphenol-induced改变信号通路(3]。最丰富的葡萄多酚存在于包括羟基酸、没食子酸等;hydroxycinnamic酸(咖啡酸);对称二苯代乙烯(白藜芦醇);儿茶素和黄酮类化合物,如花青素,其他人(4,5]。这些化合物的生物活性已被归因于他们的抗氧化和自由基清除属性6]。
结肠癌是第三个最常见癌症在成年人群,负责全球癌症相关死亡的9% (7,8]。然而,结肠癌,在某种程度上,可预防(9]。例如,饮食和生活方式产生重大影响的变化减少患结直肠癌的风险(10]。尤其是茶多酚来自不同饮食的食物或饮料,如葡萄、茶、姜黄、显示chemopreventive治疗属性对结肠癌和其他癌症类型(11,12]。在这方面,白藜芦醇(RSV) (3、5、4′-trihydroxytrans-stilbene),其中一个最丰富的葡萄多酚,展品的结肠癌预防潜在的有趣的属性。此外,RSV是公认的抗氧化分子(13)据报道,干涉发生过程的不同阶段,例如,起始,推广和发展。这是发表在众多实验模型,包括癌症细胞系,动物模型和临床试验14]。在相关的在体外和在活的有机体内研究,RSV已被证实对多种癌症类型具有抗癌潜力,包括前列腺癌、肝、乳腺、皮肤、大肠癌、胰腺癌(15- - - - - -18]。类似的观察描述了花青素和儿茶素19]。重要的是,这三种植物化学的化合物构成近50%的葡萄多酚(19]
肿瘤转移是癌症患者发病的主要原因之一(20.]。不幸的是,没有疗法已成功开发目标在任何人类癌症转移相关流程(21]。转移过程中,肿瘤细胞从原发肿瘤站点迁移到遥远的组织,在那里形成继发性肿瘤(21]。最初,这需要超然从最初的肿瘤,细胞外基质(ECM)退化、移民和肿瘤细胞内渗(22]。重要的是,迁移和降解ECM似乎代表关键步骤在转移(22]。例如,MMP-2和MMP-9(也称为IV型胶原酶或明胶酶)能够降解大多数ECM组件形成基底膜,促进肿瘤细胞逃避和转移(23]。
在这项研究中,GJE得到来自两个广泛生产的葡萄品种在智利(蓝色葡萄秋天(AR)和皇家莱比(RB)),和他们的抗癌特性进行了分析。调查认为在体外GJE对可行性和转移性参数的影响在sw - 480和HT-29人类结直肠癌细胞系。结果表明,GJE减少细胞细胞株剂量依赖性的方式生存。重要的是,这种效果是有选择性的,人类皮肤成纤维细胞(HDF)没有影响。此外,GJE敞口减少转移性结肠癌细胞的潜力减少这些细胞的迁移和入侵。此外,GJE减少基质金属蛋白酶基因的表达MMP-2 MMP-9。结论讨论了证据表明,AR和RB GJE选择性减少结肠癌细胞增殖和,更重要的是,抑制结肠癌细胞的转移潜能。
2。材料和方法
2.1。植物材料
蓝色的葡萄的简历。皇家和莱比秋天收获来自南美洲的山谷,瓦尔帕莱索,智利,在夏天。他们被安置在聚乙烯袋和运输在4°C到实验室。茎是手动删除,而损坏和质量差的水果被淘汰。样本用聚乙烯袋包装,储存在-32°C,直到被使用。
2.2。葡萄汁提取物(GJE)
大约200葡萄被解冻,用蒸馏水洗净,压在一个不锈钢手动在室温下葡萄压碎机。果汁是由手工收集和均质搅拌,在聚丙烯瓶,密封,并存储在冷室在-32°C,直到分析。随后,GJE冻干,随着4毫升蒸馏水,过滤(孔隙大小0.2μ米)。
2.3。细胞培养和葡萄汁提取物治疗
人类结肠癌细胞系sw - 480和HT-29和人类皮肤成纤维细胞(HDF)保持在高葡萄糖DMEM培养基(Gibco、圣地亚哥、钙、美国),补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫)37°C湿润有限公司5%2孵化器。
GJE治疗、适当的解决方案添加到工作介质达到表示浓度(0、10、25、50或100毫克/毫升)和细胞培养显示时间(24、48、72和144小时)。
2.4。细胞生存能力分析
细胞生存能力是由Sulforhodamine B (SRB)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)染料测定如前所述[24]。细胞被播种密度3×103细胞培养板/在96 - 24 h,然后处理GJE如上所述。通过添加25后治疗,细胞被固定μL冷(wt /卷)50%三氯乙酸(TCA)其次是孵化60分钟在4°C。盘子被去离子水清洗和干燥。然后,50μL (SRB的解决方案(wt /卷0.1% 1%乙酸)添加/好,在室温下培养30分钟。释放SRB与1%醋酸被洗涤。盘子被风干,蛋白结合的染料与100可溶性μL三基地(10毫米)。光学密度自动读取了分光光度计板读者在540海里。
2.5。细胞迁移和入侵检测
细胞迁移试验,细胞治疗GJE(25毫克/毫升)24 h,然后播种在Transwell室没有人工基底膜涂层。细胞(2×105细胞/在300μL无血清培养基)被播种到参议院,和0.5毫升中含有20%的边后卫是作为化学引诱物添加到众议院。孵化后24 h在5%二氧化碳的37°C,多孔膜的上表面是用棉球擦拭。细胞迁移到低表面多孔膜固定在50%甲醇结晶紫染色和0.1%。
细胞入侵检测是在类似的方式进行与基底膜基质涂层Transwell室(σ)48 h。人工基底膜和无血清培养基稀释的最终浓度2毫克/毫升,和8μ被涂上一层50 m-pore聚碳酸酯膜过滤器μL基底膜基质。在细胞迁移和入侵检测,人数统计在20个随机领域(×100)/过滤器,总共三个过滤器( )。%迁移=(治疗细胞/数量的控制细胞的数量)×100%入侵=(治疗细胞/数量的控制细胞的数量)×100
2.6。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),
总RNA分离试剂盒试剂,按制造商提供的说明(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA样本(2μg)治疗与RQ1 DNAse (Promega)和使用M-MLV reverse-transcribed逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国),使用益生元(dT) 15个引物(Promega)按照制造商的指示。MMP-2、MMP-9 GADPH mRNA表达测定定量实时PCR进行StepOne™实时PCR系统(应用生物系统,促进城市、钙、美国)。简单地说,每一个放大混合物(20μl)由10μl SYBR绿色PCR大师混合2 x(应用生物系统公司),2μl底漆组合(250海里每一个),6μl (nanopure水,2μl的互补。循环条件如下:96°C, 10分钟;40 96°C的周期,5 s;58°C, 30年代;72°C, s。反应是完成72°C 25 s的延伸。引物用于MMP-2、MMP-9 GAPDH放大如下:MMP-2(133个基点):5′-CCTCCCTGCCCCTCCCTTCA-3′(意义)和5′-GCTTCTGGCTGGGTCTGTGGC-3′(反义)MMP-9 M(174个基点):5′-GCCTTTGGACACGCACGACG-3′(意义)和5′-GCCAAAGCAGGACGGGAGCC-3′(反义)GAPDH(226个基点):5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(意义)和5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′(反义)(见表1)。
2.7。统计分析
所有数据都表示为±SEM手段从至少三个独立的实验。数据处理使用INSTAT v3.05 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国、https://www.graphpad.com/)。方差分析(方差分析)为多个比较被用作指出。在所有情况下, 被认为是显著的。所有统计与统计分析软件进行了测试。
3所示。结果与讨论
自在体外细胞毒性筛选模型提供重要的初步数据,帮助选择葡萄提取物具有潜在的抗肿瘤药的特性在未来的研究中,英国皇家的细胞毒性效应和莱比葡萄汁提取物对人类结肠癌细胞系sw - 480和HT-29被Sulforhodamine评估B (SRB)测定。结果表明,提取物表现出显著的抑制效应在sw - 480和HT-29(图48 h的治疗1)。此外,提取了在实验条件下所述没有细胞毒性效应与正常的人类皮肤成纤维细胞(类似结果结肠上皮细胞(CCD841 CoN),数据未显示)。
(一)
(b)
3.1。细胞生存能力和细胞迁移
3.1.1。由GJE抑制结肠癌细胞的可行性
评估GJE治疗对细胞活力的影响,sw - 480和HT-29结肠癌细胞系暴露在AR和RB GJE的浓度增加,和可行性确定使用国储局染料测定(图1)。在这些剂量反应实验,GJE最低剂量(10毫克/毫升)显著降低细胞生存能力在sw - 480和72 h后HT-29细胞治疗,而乙醇控制(图1)。GJE 25毫克/毫升的浓度导致显著的细胞生存能力减少sw - 480, AR(图的40%和34%1(一))和RB(图1 (b)),分别在HT-29细胞,分别为43%和58% ( )(图1)。GJE最高浓度(100毫克/毫升)最显著减少可行性诱导结肠癌细胞系sw - 480(82%和84% AR和RB resp)和HT29(84%和90%,分别地。 )(数据1(一)和1 (b))。有趣的是,GJE在这些相同的浓度没有影响nontumoral细胞系来源于人类皮肤成纤维细胞(HDF)。这些数据表明,AR和RB GJE抑制HT-29和sw - 480的生长存在剂量依赖的相关性结肠癌细胞的方式,没有这样的不利影响观察是非控制细胞系(HDF)。
3.1.2。由GJE抑制结肠癌细胞的迁移
鉴于GJE正在研究降低结肠癌细胞,细胞生存能力研究转向GJE是否会有其他对迁移的影响。在Transwell化验,确定AR和RB葡萄汁提取物显著降低HT-29和sw - 480细胞的迁移(数据2(一个)和2 (b))。在图2(一个)在治疗后,代表HT-29迁移的照片与AR和RB GJE(25毫克/毫升)所示。HT-29细胞迁移(白色的酒吧)减少到35%和38%的控制水平治疗后AR和RB GJE(25毫克/毫升,时间),分别。在sw - 480细胞,移植细胞的比例降低到38%和44%的控制细胞后AR和RB GJE治疗(25毫克/毫升,24小时),分别为(图2 (b),黑色的列)。这种抑制作用显著( )在所有治疗相比,控制对sw - 480和HT-29细胞。
(一)
(b)
3.1.3。由GJE抑制结肠癌细胞的入侵
此外,GJE对入侵的影响确定使用Transwell室涂层与基底膜基质。作为显示在图3,基于“增大化现实”技术和RB GJE显著降低入侵sw - 480和HT-29细胞。在HT-29细胞的情况下,基于“增大化现实”技术和RB GJE显著降低入侵了64%和52%,分别控制条件(相比 )。同样,基于“增大化现实”技术治疗和RB GJE显著下降( )入侵sw - 480 63%和51%,分别。为了阐明潜在的分子机制负责观察GJE anti-invasive活动,改变在MMP-2通过存在和MMP-9 mRNA水平进行了分析。如表所示2,基于“增大化现实”技术和RB GJE治疗显著降低MMP-2细胞系和MMP-9 mRNA水平。MMP-2和差别,这些发现表明,对这些MMP-9可能负责减少HT-29和sw - 480细胞的侵袭性GJE治疗后观察。
3.2。讨论
AR和RB GJE显示chemoprotective属性对结肠癌,最常被诊断出的癌症之一,在西方国家。大量的研究表明,经常食用葡萄与某些癌症的风险降低有关,比如乳腺癌和结肠癌(25]。秋天的葡萄果汁皇家和酚醛树脂含量和医疗福利莱比表现出高于其他品种的葡萄26]。这些提取尤其富含花青素,提高抗氧化能力比其他多酚在GJE。这里,我们首次展示AR和RB GJE减少可行性,结肠癌细胞的迁移和入侵潜力。这些观察结果与之前的研究相一致,葡萄籽提取物降低生存能力和细胞生长在结肠癌细胞系(27,28]。有趣的是,基于“增大化现实”技术和RB GJE没有调节HDF细胞生存在同一浓度。类似的结果在研究由赵et al。29日),确定anthocyanin-rich葡萄提取物NCM460没有细胞毒性正常结肠细胞线。在一起,这些结果表明,这是局限于结肠癌细胞的抑制作用。
转移的两个重要方面是迁移和侵袭性肿瘤细胞的能力,这是关键的特点更激进的细胞表型(30.]。收购这些属性允许癌细胞逃避组织或器官(主要影响肿瘤)遥远的网站(生产二次肿瘤)30.]。在目前的研究中,一个Boyden室试验被用来量化GJE迁移和入侵的影响参数的结肠癌细胞株。正如所料,GJE抑制迁移HT-29和结肠癌细胞系sw - 480。另一项研究使用葡萄籽proanthocyanidin提取获得相似的结果对肺癌细胞株A549和H129。在这些细胞,影响归因于鸟苷酸环化酶和MAP激酶途径抑制(30.]。此外,GJE还显示有效的抑制结肠癌细胞的侵入性的潜在影响在基底膜基质化验。这些结果是一致的与其他研究发现葡萄籽提取物富含多酚通过MMP-2减少入侵和MMP-9表达减少,例如,在前列腺癌细胞系(31日]。事实上,观察对入侵和迁移的影响在结肠癌细胞相关的重大变化的金属蛋白酶表达GJE治疗的反应。转移是伴随着各种分子的改变,包括降解ECM的能力:这是与显示蛋白水解酶的过度活动有关,如基质金属蛋白酶(32]。因此,增强表达MMP-2和MMP-9证明发挥重要作用在降解基底膜细胞入侵和迁移。此外,巴贾杰et al。33]表明,过度MMP-9有关胃癌肿瘤浸润和转移。太阳et al。34)报道,MMP-2的表达和MMP-9具有显著预测淋巴结阴性患者无复发生存预后价值,而李et al。35)确定这些基质金属蛋白酶是标记在结肠癌转移。尽管以上的观察,到目前为止,基于“增大化现实”技术的可能性和RB GJE可能会改变在结肠癌细胞MMP的表达没有探索。事实上,减少侵入性能力后AR和RB GJE治疗与减少MMP-2和MMP-9基因的表达细胞系;然而,这些结果并不排除其他的可能参与金属蛋白酶参与侵略。例如,金属蛋白酶- 1和MMP-7也在结肠癌(36],urokinase-PA (u-PA)与结肠癌转移(37]。说,类似研究花青素支持我们的研究结果,发现MMP-2和结肠癌细胞系HT-29 MMP-9活动38]。此外,减少MMP-2表达式也观察到在前列腺癌细胞系du - 145 (30.]。其他纯化茶多酚存在于葡萄或姜黄,也就是说,杨梅酮或姜黄素,也减少MMP-2表达205年科罗拉多州结肠癌细胞系和HT-2939),以及MMP-9表达鼠结肠细胞模型(40]。
4所示。结论
总之,我们已经表明,可以减少暴露结肠癌细胞GJE motility-associated流程。这些结果表明,GJE的anti-invasive效应与MMP-mediated退化过程,有利于抑制肿瘤转移。然而,潜在的分子机制导致MMP-2和MMP-9抑制仍有待确定。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
琼Villena和马里奥Parraga设计研究;Manuel Valenzuela Alejandro马德里曾巴斯蒂亚,伊万黑山,和琼Villena进行研究和分析数据;伊凡黑山和琼Villena写道。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
作者感谢Centro de Investigaciones基于(CIB), DGI普拉粗,大学和医学院Obstetricia瓦尔帕莱索大学。