文摘

客观的。Huannao Yicong汤(海德拉巴还脑益聪方)可以提高学习和记忆能力的阿尔茨海默病(AD)科目。然而,这种现象的潜在机制仍有待确定。方法。六十Sprague-Dawley老鼠同样和随机分为五个不同的组包括控制,积极控制,和海德拉巴颗粒低剂量,中剂量和高剂量每日填喂法。给出的sham-treated老鼠也同样体积的无菌水填喂法。十二SD大鼠服用等量的生理盐水。12周后,学习和记忆能力,β右脑的内容和糖原合酶激酶3的表达β(GSK-3β),总τ蛋白激酶(TTBK1)和细胞周期蛋白依赖性kinase-5 (CDK-5)进行了测试。结果。我们的研究结果表明,高剂量海德拉巴治疗显著改善AD大鼠的学习和记忆能力和减少TTBK1的表达,GSK-3β,CDK-5海马CA1区。结论。海德拉巴治疗12周显著提高空间学习和记忆,有效地抑制β沉积,可能通过减少τ蛋白激酶的表达,因此τhyperphosphorylation和炎症损伤。总的来说,这些结果表明,海德拉巴可能是一种有效的治疗。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,表现为进行性记忆丧失和认知功能障碍。神经原纤维缠结细胞内(非功能性测试),细胞外老年斑(SP)和胆碱能发射机异常代谢中枢神经系统(CNS)的病理特征观察在AD患者尸检(1]。Hyperphosphorylation(τ)被认为占了大多数非功能性测试。在AD患者的大脑,τ蛋白总量远远大于一般是什么在影响个人,主要受到大幅增长的过度磷酸化τ(2]。目前我们认为细胞外沉积的淀粉样蛋白(Aβ)可能会触发广告3]。为τ磷酸化相关广告严重程度和认知障碍的程度,调查改善τ,特别是过度磷酸化τ的理解已经引起了极大的关注。目前,还没有有效的治疗。最近的研究强调了一个潜在的改善临床结果海德拉巴的老年轻度认知障碍(MCI)患者4]。海德拉巴的机制是基于deficiency-congestion-phlegm-toxic中药里,已改善自由基代谢紊乱,降低炎症免疫反应和调节胆固醇代谢(5]。此外,动物模型揭示了海德拉巴对认知障碍的影响减少β相关蛋白和炎症免疫反应和抑制海马神经元的凋亡维持正常脑功能(4]。

在目前的研究中,我们研究了海德拉巴对空间学习和记忆的影响β1-42广告诱导大鼠。提高我们对海德拉巴的机制的理解影响广告,我们也评估τ蛋白激酶表达的变化在海德拉巴治疗后的海马。

2。方法

2.1。动物

所有动物中所描述的工作综述了目前的研究和动物实验伦理委员会批准中国中医科学院西苑医院(许可证号码:2011 xla10-05)。72斯普拉格- Dawley (SD)大鼠(半男半女),在3个月的年龄,体重200 - 220克,从北京获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司,合格证:SCXK(北京)2006 - 0009。老鼠在特定的无菌环境的温度22 - 25°C,湿度的50 - 70%,12 h光周期。所有老鼠都使适应新环境适应性喂养7天。

建立动物模型和药物管理局。六十老鼠被随机选择一个β1-42治疗。其余12老鼠代表了虚假的组织和处理同等体积的水。在实验之前,β1-42是用无菌盐水稀释浓度的1μ克/μL和放置在37°C 72 h。为一个β1-42或虚假的治疗,老鼠被4%水合氯醛麻醉0.9 mL / 100克体重和固定的立体定位工具。囟门地区和周围的发型是用75%的酒精消毒。纵1.5厘米切口使用手术剪刀。指的是大鼠的脑立体定位仪地图诸葛Qichuan,在背侧海马CA1区齿状回被确认的一部分。精确定位和标记的立体定位仪(美国Stoelting BW-SAD902数字显式立体定位仪器):3毫米前囟门之后,旁边2毫米左右大脑的中线,头骨的表面下和4毫米。使用一个牙科压花球钻(10号),两个洞钻。5毫升的浓缩β1-42是慢慢注入每一方的海马CA1区1的速度μL / min微流量泵(TJ-2A / L0107-2A-Micro流量注射泵),由保定制造精密泵有限公司,有限公司,以确保一个适当的扩散、针一直在大脑中5分钟,慢慢退出。云南白药是应用于伤口防止感染和出血,皮肤缝合。虚假的组同样的但无菌生理盐水,而不是压缩β1-42被注入。老鼠接受了肌内注射青霉素40000 U /天3天预防感染和伤口是定期检查。

60 AD模型大鼠分为5组(控制、DPG回龙观,HYD-mid HYD-high)基于初始莫里斯水迷宫测试的结果和他们的体重使用分层随机法和SPSS软件。12周的五组收到每日填喂法与蒸馏水(水),盐酸多奈哌齐片悬挂(0.49毫克/公斤)(多奈哌齐),和海德拉巴三剂(g药材/公斤):3.78 (HYD-L), 7.56 (HYD-M)和18.90 (HYD-H),分别。虚假的组(控制)收到了胃内的政府与蒸馏水。所有六组收到相同的总量。twelve-week期间,一个老鼠从HYD-M组死于意外,因此被撤。

2.2。制备海德拉巴提取和多奈哌齐悬挂

海德拉巴颗粒组成的首乌,人参,根状茎当归wallichii,菖蒲Graminei,根状茎黄连重量比为2.4:2:1.8:1.2:1用乙醇和水提取。提取集中在减压,然后混合挥发油菖蒲属tatarinowii Schott石脑油。粗提取,由毒品制造工厂在北京中医药大学,包含天然药浓度为3.2克/公斤。提取与蒸馏水稀释在设计比率被填喂法给老鼠。盐酸多奈哌齐片(Aricept 5毫克,国家药品许可证:H20050978,批号:100609),由中国卫材公司,被压碎,与蒸馏水混合悬浮。

其他试剂。一个β1-42(批号bs - 0107 b)从Sigma-Aldrich购买,美国。β淀粉样蛋白(β- ap)工具包(批号:20111015)是来自北京华英生物技术研究所。脑源性τ蛋白激酶抗体(TTBK1 / BDTK,磷酸化,批号:909902 w),葡萄糖合成酶激酶3β(GSK-3β5,批号110267),和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK5,批号:110218)来自北京生物合成生物技术有限公司有限公司Polink-2 +聚合物合检测系统(nonbiotinylated)(批号:K116616D)和3,3′-diaminobenzidine (DAB)显色工具包(批号:K116610D)购自北京中山金桥生物技术有限公司有限公司

2.3。行为测试

莫里斯水迷宫(DMS-2类型,产生的药物学研究所、中国医学科学院)使用药物治疗前后检测认知功能的变化(6]。测试包括两个部分:一个地方导航和空间探测试验。导航是评估每天4.5天的地方。迷宫里的水是30厘米深,约1厘米以上平台表面,位于第四象限,温度 °C。在测试期间,适量的墨水在水混合,把不透明的黑色。这个测试是在一个隔音的房间里进行的。这种测试的过程涉及到以下几点:(1)选择和标记的池壁从1/2第二象限的弧度,(2)把老鼠在池的水墙的标记点,和(3)记录找到并爬上平台所需的时间(这样四肢都是平台)。在这个过程被称为platform-locating延迟(锁相环)。如果在180年代,老鼠找不到平台指挥引导适当的老鼠。第一次4天,只有锁相环被记录。第五天,锁相环和游泳距离都记录下来。此外,在第五天(下午),平台被执行空间探测试验。在这个测试中,研究人员让老鼠脸池壁,进入第二象限的水从一个随机的点。 The camera system automatically recorded the location where the platform was located as well as the time and distance of swimming to evaluate their learning and memory ability.

2.4。大脑组织样本的准备

最后的莫里斯水迷宫测试后,每组六大鼠随机选择被斩首麻醉和牺牲。大脑组织立即被放在冰。左侧大脑的中性的多聚甲醛固定在4%。大脑的另一边被用来解剖出海马和皮层。海马组织重,0.3 g皮层均质2毫升的冰冷的缓冲和离心机在2000转10分钟。上层清液储存在−80°C,以供将来使用。

2.5。的决心β通过放射免疫检定法

等被用来确定的内容β右脑的老鼠(7]。简单来讲,β- ap抗体被添加到脑组织匀浆,贴上 。2小时后,二级抗体加入隔离抗原抗体复合物。样品的放射性(B)是使用自动测量的标准γ计数仪器(gc - 911,中国科技大学工业公司、有限公司)。

2.6。免疫组织化学

固定的脑组织石蜡包埋,切成5μ米的部分。他走时和刚果红染色8)进行评估组织病理学变化的老鼠大脑的海马CA1区。每组五大鼠随机选择的大脑部分。GSK-3 TTBK1的表达β在脑组织,CDK-5检查使用两步nonbiotinylated免疫组织化学,根据制造商的规格。简单地说,5μm大脑部分脱蜡,孵化H为3%2O2去离子水5 - 10分钟阻断内源性过氧化物酶活动,洗了三次磷酸缓冲盐(PBS)(2分钟),然后孵化主要抗体(TTBK1 GSK-3β,CDK-5;1:400稀释)37°C 1 h。幻灯片是在PBS再次洗3次(2分钟/洗)和孵化兔抗体免疫球蛋白二次抗体在室温下为30分钟。DAB显色试剂用于开发图像和反应时间由显微镜下观察组织决定。组织用蒸馏水洗净,与苏木精染色,ethanol-dehydrated,安装与中性树胶。彩色部分DpxView Pro成像(DeltaPix、丹麦)。三个不同的图像CA1区在每一个部分,从每一组,总共15图片收集。蛋白表达是决定通过测量集成光密度(IOD) Image-Pro + 6.0软件。

2.7。统计数据

使用SPSS13.0统计软件包进行数据录入和处理。数据被表示为平均数±标准差。组间比较采用单向方差分析。LSD和DunnettC测试是异质性的方差。被定义为一个统计意义 。

3所示。结果

3.1。海德拉巴对空间学习和记忆能力的影响β老鼠全身的广告

与假组相比,广告数量的老鼠明显降低大鼠通过平台和在第四象限游泳时间(数字1(一)和1 (b))。AD大鼠在第四象限的游泳距离也显示这一趋势减少虽然两组之间的差异没有统计学意义(图1 (c))。多奈哌齐治疗组显示改善的趋势(例如,传球的数量增加,游泳时间)但这样的改善并不显著(数字1(一)- - - - - -1 (c))。治疗较低或中等剂量的海德拉巴产生了类似的结果多奈哌齐;然而,高剂量治疗海德拉巴(18.9 g药材/公斤)优于多奈哌齐通过增加游泳时间明显在第四象限,在控制老鼠(数字1(一)- - - - - -1 (c))。这些数据表明,与高剂量海德拉巴AD大鼠的治疗可以改善这些动物的学习和记忆能力。

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图1
海德拉巴的影响治疗AD大鼠的学习和记忆能力。控制:虚假的对待;AD大鼠喂养与水、多奈哌齐和海德拉巴低(HYD-L),中等(HYD-M)和高剂量(HYD-H),分别为12周每日填喂法。
3.2。海德拉巴的组织病理学的影响在AD大鼠海马CA1区

控制老鼠,轻轻在海马CA1区细胞染色的细胞内结构和核(图2(一个))。这些细胞被安排在一个有组织的方式清晰的界限。相比之下,广告老鼠的细胞染色要暗许多扩展细胞质和深致密的核(图2 (b))。细胞被安排在一个不规则的随机模式比虚假的组有更多的细胞。海德拉巴12周的治疗后,组织病理学的AD大鼠海马CA1区显示不同程度的改善,类似于积极的多奈哌齐治疗组(数字2 (c)- - - - - -2 (f))。细胞质的面积和黑色染色细胞的数量减少大鼠与未经处理的广告。细胞似乎更有条理和深染细胞核出现打火机。

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图2
他走时染色(×600)骗局和广告的老鼠的大脑部分。(一)虚假的集团;(b-f)广告和水喂养的老鼠(b),多奈哌齐(c)和海德拉巴低(d)、中(e)和高剂量(f),分别为12周每日填喂法。
3.3。海德拉巴的影响β沉积在AD大鼠的海马CA1区

确定一个β淀积,我们执行刚果红染色法对大脑部分。橙色的淀粉样蛋白沉积在AD大鼠的数量似乎增加比虚假的控制和分散细胞观察组织模式(数据3(一个)和3 (b))。海德拉巴治疗后三个不同剂量或多奈哌齐治疗,这些细胞被染轻了清晰的细胞结构比未经处理的广告控件(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。细胞质和细胞核更明确更少和更轻的橙色淀粉样沉积物被观察到。一直,一个β内容在AD大鼠的海马显著增加而虚假的组(图4(一)),而所有治疗组(包括那些多奈哌齐治疗和所有3种不同剂量的海德拉巴)有显著降低β海马体(图中的内容4(一))。

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图3
海德拉巴的效果β沉积在AD大鼠海马CA1区(刚果红染色,×600)。(一)虚假的集团;(b-f)广告和水喂养的老鼠(b),多奈哌齐(c)和海德拉巴低(d)、中(e)和高剂量(f),分别为12周每日填喂法。
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图4
海德拉巴的效果β的内容和表达TTBK1、CDK-5 GSK-3β在AD大鼠的海马CA1区。
3.4。在海德拉巴TTBK1的表达的影响,CDK-5, GSK-3β在海马CA1区

测试海德拉巴治疗是否影响τ磷酸化激酶,我们进行了免疫组织化学量化τ磷酸化激酶的表达。与假组相比,TTBK1的表情,CDK-5, GSK - 3β染色的大脑的部分广告老鼠都显著增加( )(数据4 (b)- - - - - -4 (d))。重要的是,海德拉巴治疗显著降低这些蛋白质的表达,类似于积极的对照组与多奈哌齐治疗(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。

4所示。讨论

当前流行的假说的广告表明β的发生和发展中起关键作用的这种疾病。根据淀粉样蛋白级联假说,Aβ作为触发家族和零星的形式的广告(9]。因此,它可能是有效的治疗或抑制β在早期发病的广告。然而,越来越多的研究表明,一旦广告被触发,τ蛋白是与疾病的严重程度相关10]。这些发现使研究者描述τ蛋白和之间的关系β在广告。此外,它被发现β口供之前被清除和随后出现τ病理学,表明分层和直接的关系β和τ11]。

非功能性测试的过度磷酸化τ蛋白是一个主要组成部分。τ蛋白的磷酸化水平取决于相对蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性。增加了β可能诱发τ蛋白磷酸化通过扰乱激酶和磷酸酶的平衡。磷酸化的激酶参与τ蛋白包括GSK-3和CDK5 [12,13]。有趣的是,在一个果蝇模型的广告,GSK-3的异常表达和抑制GSK-3都可以显著提高β全身的神经毒性(14]。同样,τ缺陷果蝇与某种程度的改进有关。这些结果表明,GSK-3可能代表一个共同通路连接β和τ蛋白。GSK-3抑制可以因此减少的沉积β和τ蛋白磷酸化15]。其他的研究也表明,CDK-5可以灭活GSK-3β和加剧非功能性测试的病理过程16]。

广告的老鼠表现出能力下降在莫里斯水迷宫,找到这个平台,作为与虚假的群体,广告组的脑组织部分显示明显的炎性病变,细胞质核比增加,核固缩,整个随机细胞组织。刚果红染色确定频率的增加暗橙色的淀粉样斑块沉积模型大鼠的海马CA1区(即。,一个β沉积),而虚假的集团。的一个β内容广告组也显著增加( ),由放射免疫检定法。海德拉巴治疗后,认知行为的表达显著改善和脑组织病理学的严重性已经改善。这些结果表明,海德拉巴修补了认知障碍和神经病理损害,可能抑制β形成和聚合。

通过免疫组织化学,我们评估TTBK1的表达,GSK-3β,CDK-5海马CA1区。所有三种蛋白质在AD大鼠显著增加而虚假的集团( )。这些数据表明β影响tau蛋白质磷酸化,可能通过诱导τ蛋白激酶的表达。这是符合Tokutake等人证明以前的工作β可以在细胞水平上诱导τ磷酸化,GSK-3-mediated通路可能是一个看门人连接这两个蛋白(17]。同样,Chabrier等人表明,通过注入应用程序与低剂量的转基因小鼠β,总τ蛋白和τ蛋白磷酸化水平增加(18]。在目前的研究中,我们表明,胃内的海德拉巴治疗显著减少的总量β以及τ蛋白激酶GSK-3 CDK-5表达式,表明中药处方海德拉巴不仅可以减少的数量β而且τ蛋白激酶的表达,从而抑制tau蛋白质的磷酸化。因此,中医海德拉巴治疗广告拥有巨大的潜力。

在传统中药,治疗老年痴呆症是基于deficiency-congestion-phlegm-toxic机制的理解。海德拉巴符合这对痴呆的发病机制的理解。高效液相色谱法用于确定海德拉巴提取的成分(参见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6840432),它被发现包含七个主要活性成分:大黄素,对称二苯代乙烯甙、人参皂苷,人参皂苷Rb1,人参皂苷Rg1,阿魏酸,和小檗碱浓度(毫克/毫升)的0.8045,0.8765,0.6932,0.5816,0.3993,2.4183,和1.0424,分别。最近的研究表明,大黄素,首乌的生物活性成分,能减少大鼠皮质神经元的细胞死亡上调bcl - 2通过雌激素受体(ER)和phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)途径19]。对称二苯代乙烯葡萄糖苷,首乌的另一个主要提取,可以改善认知障碍通过减少氧化应激和增加胆碱乙酰转移酶的活性(聊天)。的活性成分人参Rg1可能显著降低tau蛋白的磷酸化20.]。李等人建立了一个通过注射D-galactose和广告模型β1-42,发现Rgl影响τ蛋白磷酸化通过抑制CDK5在海马神经元的活动21]。根茎菖蒲属的活性成分可以抑制胆碱酯酶活性,延缓神经退化和改善认知障碍(22]。小檗碱(BR)的一个主要的根茎中提取黄连,可能改善AD大鼠的空间记忆(23]。Durairajan发现小檗碱调节τ磷酸化Akt / GSK-3从而发挥作用在保护神经元(24]。它被证实,海德拉巴改善空间学习和记忆能力的各型号的广告(25- - - - - -27]。尽管中医如何影响广告的具体机制模型大鼠没有完全阐明,我们的研究奠定了基础为未来的调查τ蛋白磷酸化的作用在广告的发展。总的来说,中药海德拉巴也有许多的生物效应,在一起可能代表发展的一个重要组成部分患者的有效治疗方案。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者参与研究设计、数据解释和重要和关键的修订手稿准备知识内容。于曹,果河贾,云,Meixia Liu和刘Jiangang进行组织病理学,生化,老鼠的功能分析和执行数据分析。果河贾导致数据分析和图准备。李郝的概念、设计和协调所有方面的实验,解释数据和手稿准备和提交。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81173383和81173383号)和北京市科技计划(没有。Z141100002214003)。

补充材料

图S1:化学成分分析高效液相色谱的忧郁。峰值数据显示1所示,大黄素;2、对称二苯代乙烯糖苷;3,人参皂苷;4,人参皂苷Rb1;5、人参皂苷Rg1;6、阿魏酸和7,小檗碱。

  1. 补充材料