文摘
脊髓损伤(SCI)能引起一系列的组织学、生化和功能变化。针灸对SCI病人常用的。使用雄性小鼠脊髓损伤与纽约大学(NYU)撞击器,我们研究电针刺激的反应(EA),手动针灸(MA)和经皮穴位电刺激(tae) Shuigou另(DU26)和(DU16)穴位了解针灸的效果和机制在SCI后神经保护和神经功能恢复。组织学研究显示恢复神经形态和EA后神经元的数量增加,MA, tae政府。针灸的post-SCI减轻抗氧化效果证明了超氧化物歧化酶(SOD)活性增加,丙二醛(MDA)水平降低。针灸的抗炎效应表现为炎性细胞因子的表达包括interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)当科学治疗。通过TUNEL染色和antiapoptosis作用。我们的数据证实,针灸在神经保护的作用和背侧神经功能恢复鼠SCI后,尤其是EA刺激在Shuigou (DU26)和发生(DU16)可以极大地促进神经功能恢复,这可能源于抗氧化作用,抗炎,antiapoptosis针灸的效果。
1。介绍
脊髓损伤(SCI)是一种致命的事件导致生理、心理、和社会对个人的影响,家庭,和世界各地的社会1]。然而,目前,目前仍缺乏有效的治疗脊髓损伤(2,3]。一些研究表明,治疗期间中小学损伤之间的时间有可能防止或减少最后神经赤字(4]。针灸是一种治疗技术用于中药和包括与薄无菌针头刺穿皮肤在定义良好的穴位可能容易激动的肌肉/皮肤神经复合体高密度的神经末梢。针主要是刺激了手动或电动。在手动针灸(MA)针来回扭曲。除了传统的手工针灸,针灸新模式,如电针刺激(EA)和经皮穴位电刺激(tae),正在日渐普及。在EA,在各种参数应用于穴位刺激电流通过针(5]。与此同时,在tae,电脉冲交付通过电极对穴位的皮肤(6]。与马相比,EA是更有效地缓解疼痛7在人类和动物模型,tae已被证明是有效的EA镇痛(8]。先前的研究表明,应用EA治疗神经科学已经证明要帮忙在SCI和功能恢复9- - - - - -11]。是合理的研究不同形式的针灸是否会引起不同的反应。
另Shuigou (DU26)和(DU16)是重要的穴位位于杜船后沿着脊柱的内部和与脊髓的功能根据传统理论在中医12]。先前的研究表明,针灸应用在Shuigou (DU26)和Yanglingquan (GB34)穴位同时发挥神经保护这部分是通过抑制炎症和小胶质激活介导;此外,针灸缓解神经性疼痛引起的SCI (13,14]。然而,没有之前实验的EA SCI后应用于同时DU26和DU16。
这项研究的目的是评估两个穴位的功效(DU26和DU16)引起的三个普遍运用针灸方法,即马,EA, tae,通过比较他们的抗氧化作用,抗炎,和antiapoptosis效果和减少神经元凋亡细胞死亡,从而导致改善SCI后神经功能恢复。
2。实验程序
2.1。动物和实验组织
所有实验机构的动物保健和使用委员会批准温州医科大学。所有的110只老鼠(Sprague-Dawley,男,180年到220年g)被随机分为五组。虚假的组(),只收到了一个椎板切除术。其余四组在T10接受脊髓损伤脊髓段撞击器。对照组()没有得到治疗脊髓损伤后,EA组()接受了EA治疗DU26 DU16穴位,和马(马)组接受治疗的穴位,而tae集团()收到皮电刺激在同一穴位。所有的动物被关在笼子里分离自由获取食物和水。室温设定在°C。
2.2。脊髓损伤
温和的脊髓损伤是引起使用纽约大学撞击器。老鼠与水合氯醛麻醉(500毫克/公斤),和一个椎板切除术在T10级别进行公开而不扰乱硬脑膜下绳。T9和T11的尖尖的过程被夹紧稳定脊柱,和裸露的背线表面受到挫伤受伤(10 g×25毫米)使用纽约大学撞击器[15,16除了虚假的集团。所有的动物模型中研究符合以下标准:绕的脊髓缺血,水肿,尾巴左右反射的形成,移动身体和腿,和缓慢的瘫痪。
伤口覆盖棉花浸泡在盐水,以避免与空气直接接触的脊髓。机构温州医科大学动物保健和使用委员会批准所有外科手术和术后动物保健。
2.3。针灸的应用程序
DU26和DU16穴位被利用在EA,妈,或tae治疗。的DU26穴位位于前中线和鼻子下面的抑郁。DU16坐落在大萧条后中线和低于第二颈椎的棘突在卧姿(图1)。老鼠一直在一个固定装置设计的实验室(中国专利申请号:201110021482.5,国家知识产权局)没有麻醉。系统设计既方便针灸研究和舒适的实验老鼠来减少压力(图2)。
(一)
(b)
在EA或马集团,一双直径0.25毫米的不锈钢针插入到DU26(震源深度5毫米)和DU16(7.5毫米)的深度。在EA组,针是EA的连接到输出终端装置(hans - 200 e,扛鼎之作医疗器械)和刺激的连续波2赫兹频率和0.2 mA强度30分钟。马集团的针了两个旋转的速度每秒10秒钟每十分钟30分钟期间。tae组,这两个穴位是修补用相同的经皮的装置和刺激参数连续波,2赫兹频率和1 mA强度30分钟。EA, MA, tae管理2小时和8小时的参与。
2.4。他染色和尼氏小染色
在损伤手术后8小时,我们管理的第二次EA,马,tae治疗。每组八22大鼠灌注和时间均在第8.5小时牺牲transcardially 0.9%氯化钠,然后用4%多聚甲醛在1 x磷酸缓冲盐(4% PFA) 30分钟。脊髓是切割出来,保存在一夜之间4%的PFA后缀。脱水后,脊髓与石蜡、嵌入式和串行日冕部分的厚度5μm。评估的组织病理学变化,每一个五部分获得受到他和尼氏小染色。
2.5。TUNEL染色
检测细胞凋亡,每一个五冠部分获得上述实验过程中进一步受到末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色。凋亡细胞的特点是深棕色染色细胞核核膜。定量是由计数阳性细胞的数量在5个随机选择的领域内每个幻灯片在400 x奥林巴斯光学显微镜(CH30、日本)。细胞凋亡指数计算整体凋亡细胞的比例。
2.6。生物化学分析
额外6 22老鼠在每组都牺牲了8.5小时的参与。脊髓受伤的组织解剖和均质浓度的100 g / L,在3500转离心20分钟−10°C,并存储在−20°C。评价针灸的效果,生化试剂盒(Beyotime生物技术研究所、中国)被用来衡量脂质过氧化反应终产物丙二醛(MDA)和生化试剂盒(Dojindo分子技术,Inc .)、日本)被用来测量超氧化物歧化酶(SOD)。所有程序完全符合制造商的指示。SOD活性的测定是基于其有能力抑制oxymine通过超氧化物阴离子的氧化产生xanthine-xanthine氧化酶系统。一个单位的SOD活性被定义为的550 nm的吸光度降低了50%。
2.7。西方墨点法
其余8 22老鼠每组深感与4%水合氯醛麻醉和牺牲了8.5小时的参与。为中心的1厘米脊髓损伤中心很快就被切割,然后组织沿着中线纵向切成两个同质的部分,以确保每个一半包含伤口网站。一半的受伤脊髓样本进行调查il - 1的表达β、il - 6和TNF -α蛋白质免疫印迹分析。蛋白质脊髓匀浆是由快速均质化10卷的裂解缓冲(2 mM EDTA, 10毫米EGTA, 0.4%氟化钠,和20毫米Tris-HCl, pH值7.5)。样本离心机在17000×g 1 h和可溶性蛋白质含量的材料是由Coomassie G250绑定的方法。蛋白溶解产物准备在12μg /巷为每个样本然后SDS-polyacrylamide凝胶分数在12%。Electroblotting被转移到蛋白质硝化纤维素膜(Abcam生物技术有限公司)。这些墨迹与山羊多克隆抗体anti-IL-1被孵化β(1:500年研发生物技术有限公司),鼠单克隆抗体anti-IL-6(1: 1000),和兔多克隆抗体anti-TNF -α(1:2000;Abcam生物技术有限公司)。il - 1β、il - 6和TNF -α乐队使用增强化学发光免疫印迹的可视化(ECL工具包,圣克鲁斯生物技术有限公司)。的il - 1β、il - 6和TNF -α蛋白质乐队和β肌动蛋白乐队使用ChemiImager 5500 V2.03软件进行扫描,和价值的计算是通过萤石陈2.0软件和规范化的β肌动蛋白。
2.8。实时聚合酶链反应
使用试剂盒试剂(英杰公司15596 - 026年),总RNA与另一半的一部分1厘米脊髓片段上面描述的过程。互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA使用恢复援助合成装备(Fermentas K1622)和RT-qPCR是使用特定的引物,如前所述。相对量化,感兴趣的每个基因最初是受到一个串行稀释试验确定最佳检测范围的Ct值,与Ct阈值35中检测不到表达。使用10 ng reverse-transcribed总RNA, 20 pmol /毫升的感觉和反义引物,和快速SYBR预混料TaqTM交货(豆类代码:DRR420A)最后一个反应20卷μL, 7900快速反应是ABI棱镜上运行序列检测系统仪器和软件(应用生物系统)根据制造商的协议。肿瘤坏死因子-使用的引物α,il - 1β,il - 6的合成Genotech(大田、韩国)。序列的引物5′CCC AGA CCC柠檬酸CAC柠檬酸GAT-3′(意义)和5′ttg太极拳CTT棉酚GAG AAC CTG-3′(反义)TNF -α;5′-GCAGCT ACC答GTC TTG CCC GTG-3′(意义)和5′GTC GTT GCT TGTCTC太极拳TTG TA-3 il - 1′β;5′亚美大陆煤层气有限公司TTT CTC太极拳GCA AGA TAC TTCCAG CCA-3′(意义)和5′gg CAA ATT太极拳TGG TTA答CCA GTT条t - 3′(反义)il - 6;5′太极拳CTC亚美大陆煤层气有限公司ATT GTC AGC AA-3′(意义)和5′aga太极拳ACA ACGGAT ACA TT-3′(反义)GAPDH,作为内部控制。
2.9。数据分析
使用单向方差分析数据进行了分析。如果发现平等的方差,费舍尔最显著差异进行测试。否则,克鲁斯卡尔-沃利斯检验和Dunnett T3。是统计显著性水平。
3所示。结果
3.1。不同效果的电、手动针灸和经皮穴位电刺激对SCI后组织学变化
评估保护作用,我们比较组织病理学改变脊髓刺激EA之后,马,tae DU26 DU16。他染色(图3(一个))表明,脊髓在虚假的组集成基础设施和清晰的灰色和白色之间的界限问题。血管和中央管也表现出正常的形态。没有观察到虚假的组神经细胞凋亡。边界在对照组变得模糊和广泛出血被发现在灰色和白色很重要。补丁的坏死的灰质以及液化破坏周围的组织。此外,细胞和血管之间的差距变得相对更大。部分神经元被发现与凝聚核和黑色红点的细胞质。大量的凋亡尸体还指出。神经损害的程度在EA,马和tae组之间的虚假的组和对照组。脊髓缺乏明确的基础设施和细胞边界,而出血,坏死,周围组织水肿轻微与对照组相比。 However, dim histological staining indicated blurring structures in some remaining neurons.
(一)
(b)
尼氏小染色(图3 (b))表明,神经元的骗局组显示综合和granular-like形态。等离子体是人口与甲苯胺蓝染色,表明合成活性的神经营养和能量供应。然而,在对照组神经元的数量非常低和神经元出现不规则形态。胞内甲苯胺蓝染色也显著降低,朦胧在一个小区域。SCI诱导神经元坏死和凋亡导致神经元的损失。剩余的神经元有困难在能源综合导致神经功能障碍。三个治疗组,我们发现活性神经元,虽然数量减少。然而,组织形态是贴切地保持轻细胞质中的染色和granular-like形态。
3.2。电的影响,人工针灸和经皮穴位电刺激对SCI后抑制凋亡细胞死亡
神经元从虚假的组都是彩色蓝色和几乎没有TUNEL-positive细胞(棕色染色)被发现,而在对照组,TUNEL-positive细胞广泛分布在灰质和白质,多数在白质中找到。TUNEL-positive细胞的细胞核深棕色,而细胞质轻得多。此外,一些TUNEL-positive细胞被发现与深褐色小点。在治疗组与EA、马或tae刺激DU26和DU16 TUNEL-positive细胞的数量显著下降,这是符合不损伤脊髓结构(图4(一))。这个结果是指示性的保护作用EA, MA, tae在神经细胞凋亡。定量数据的染色是图所示4 (b)。EA组明显下降,细胞凋亡与马相比,tae组(马),而没有区别,tae组()。
(一)
(b)
3.3。抗氧化作用的电、手动针灸和经皮穴位电刺激
从虚假的脊髓组织的SOD活性组kU / g。虚假的组MDA水平μ摩尔/ g(图5)。在对照组,SCI导致SOD活性明显降低(kU / g,)和MDA水平的增加(μ摩尔/ g,)。与对照组相比,EA治疗后SCI的SOD活性显著增加kU / g ()和MDA水平下降μ摩尔/ g (马),治疗增加SOD活性kU / g ()和MDA水平下降μ摩尔/ g (),而tae治疗增加SOD活性kU / g ()和MDA水平下降μ摩尔/ g ()。同时,与tae和MA组相比,EA组诱导SOD和MDA的更明显的变化()。
(一)
(b)
3.4。电、手动针灸和经皮穴位电刺激不同调节蛋白表达的肿瘤坏死因子-α,il - 1βSCI后,il - 6
肿瘤坏死因子的蛋白表达α,il - 1β使用免疫印迹分析,il - 6是量化。如图6(一)基准面的TNF -α,il - 1β发现,il - 6表达脊髓的骗局。9个小时SCI后,TNF -α,il - 1β,il - 6表达显著降低与SCI大鼠的脊髓。治疗与EA、马或tae显著钝化SCI-induced激活TNF -α,il - 1β和il - 6表达()。如图6 (b)、集成密度值(价值)的TNF -α与β肌动蛋白在虚假的组,对照组,马集团tae组和EA组,,,,SCI后分别为8.5 h, il - 1的价值β与β肌动蛋白是,,,,分别和il - 6的价值β肌动蛋白是,,,,,分别。价值的肿瘤坏死因子-α,il - 1β,在EA组il - 6蛋白的表达低于马或tae集团()。
(一)
(b)
3.5。电、手动针灸和经皮穴位电刺激不同肿瘤坏死因子,调节基因的表达α,il - 1βSCI后,il - 6 mRNA
测试是否治疗与EA、马或tae的影响通过激活和炎症过程的促炎细胞因子的表达,我们分析了TNF -的水平α,il - 1β,il - 6 mRNA在SCI后脊髓组织。肿瘤坏死因子-的数量α,il - 1β,细胞因子il - 6,,分别在脊髓组织样本被发现(大幅度增加早上8 h后SCI(图)7)。肿瘤坏死因子的相对表达式-α,il - 1β,il - 6 mRNA的EA组,,分别MA组,,分别和tae组,,,减少肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6 mRNA相比对照组()。与此同时EA组与马相比相对较低表达组和tae集团()。
4所示。讨论
除了损伤脊髓损伤的现场,继发性病变发生在下列顺序:水肿、缺血、钙超载、脂质过氧化反应,微循环障碍,细胞凋亡17,18]。这种炎症反应是成功治疗的关键19,20.]。SCI诱导神经元和少突胶质细胞的凋亡细胞死亡导致脊髓进行性变性,导致永久性功能缺陷(21]。坏死的神经元、反应性胶质细胞和内皮所有导致炎症的生产因素,包括il - 1β、il - 6和TNF -α(22]。这些细胞因子引起的激活内皮细胞产生细胞粘附因子介导白细胞和内皮细胞之间的粘附,从而诱导白细胞浸润的损伤。白细胞浸润分解blood-spinal绳障碍,进一步加剧了创伤性损伤。在我们的实验中,实时聚合酶链反应和免疫印迹显示il - 1的显著增加β、il - 6和TNF -α直接相关的脊髓损伤后,脊髓损伤的程度。这表明upregulation细胞因子参与科学。
之前的研究表明,EA DU26和DU16增加脑血流量和减少缺血性脑损伤,导致衰减的神经赤字,梗塞体积,和死亡率在缺血性动物模型的侮辱(23,24]。此外,蔡等人还报道,DU26被认定为神经穴位SCI后(14]。然而,没有研究这两个穴位的同时应用于科学。
在1920年,它是首先报道,电场发挥了作用在神经生长和减少受伤的神经变性。脊髓电刺激的经历可以促进内源性神经干细胞的增殖和分化,提高神经组织的修复能力(25- - - - - -27]。它生成一系列的脉冲通过脊髓到适当的周围神经尽管脊髓损伤。刺激脉冲是由以下参数:振幅(电流强度)、持续时间、频率、波形、工作周期。作为替代策略,电刺激针插入到传统的电刺激穴位或简单的应用程序通过导电垫在这些穴位的皮肤应用于临床。tae避免使用针,而是提供了一个温和的电流在传统穴位被病人接受。三种形式的针灸临床有效,但强调机制可能不同。
但随着医疗技术的发展,越来越多的患者接受心脏起搏器植入术,金属支架植入,这意味着EA或在局部穴位tae应该是有限的。MA组,旋转的基本操作方法。马产生强烈deqi感觉饱足感、沉重感和疼痛(28]。的deqi感觉被认为是有关中医的临床疗效。其他因素也可能影响的结果,包括数量和位置的针,针插入的深度和频率的刺激。手动的微分效应和电子针灸刺激在这项研究中可以反映出不同的刺激持续时间(29日]。据我们所知,EA、马和tae刺激没有直接利用SCI大鼠模型相比。
老鼠受到脊髓挫伤引起的损伤纽约撞击器(10 g×25毫米)在我们的研究中进行评估,没有可观察到的后肢骨骼的运动或轻微的运动一到两关节术后8 h内。匹配来自之前的测试结果(30.]。
我们的研究结果表明,大量的TUNEL-positive脊髓神经元板二世在EA,马,或者tae应用于DU26 DU16小于对照组显示部分恢复功能的神经元。我们的数据也表明,所有的三种不同形式的针灸可能促进损伤病变的恢复和反向SOD活性降低和MDA水平的增加不同程度引起的SCI,暗示反应损伤的抗氧化作用。此外,三种不同形式的治疗抑制免疫反应性和炎性细胞因子的表达包括TNF -α,il - 1βSCI后,il - 6,建议抗炎效果。
我们的研究结果表明,与马组和tae组相比,EA组可以显著促进神经功能的恢复。EA刺激SOD活性降低和MDA水平增加,以及推导出包括TNF -炎性细胞因子的表达α,il - 1β,il - 6相比其他两种类型的治疗方法。我们假设,在EA组,电脉冲是针插入到穴位,tae集团,只有轻微的电脉冲的皮肤穴位。EA已被证明是更有效的比马和tae。最近的研究报道,EA镇痛效果比马,马而产生的持续效果更好(31日]。江等人也报告说,不同的大脑机制可能招募了三个不同针灸方法(32]。这是表明,三种不同类型的针灸治疗可能在不同程度上有不同的治疗效果。然而,针灸的生理机制尚未完全了解。因此,还需要进一步的研究来支持这种猜测。
5。结论
总之,我们的数据表明,EA, MA, tae可以改善SCI后功能恢复减少凋亡细胞死亡。与此同时,上述三种形式的治疗的神经保护作用可能是介导的抗氧化作用,抗炎,antiapoptosis后损伤的影响。此外,目前的研究表明,刺激DU26和DU16尤其是电针刺激,是一种有效的治疗策略在急性脊髓损伤。
利益冲突
作者没有利益冲突披露。
确认
这项工作是支持的资助,没有。Y12H270010,从浙江省自然科学基金,中国;和赠款,不。Y20110069,从科学和技术基础的温州,中国。由于是由于罗斯·w·戴维斯史蒂夫·a·巴雷特和梅丽莎·a·沃尔什从太平洋大学,俄勒冈州,美国,在修改作者提供一些帮助的英语表达。此外,我们应感谢Wenjie魏博士,博士陈郝,力平高,博士和Dhanesh Boodhun优秀论文的语言进步。