文摘

在印度传统医学,Boerhaavia diffusa(punarnava)的根已经被广泛用于治疗消化不良,黄疸,脾肿大、腹痛和作为抗应激剂。原油ethanolic提取物的药理评价b . diffusa根已被证明具有抗增殖和免疫调节特性。的提取b . diffusa研究了anti-proliferative影响海拉细胞的增长和对细胞周期的影响。Bio-assays的摘录b . diffusa根表明甲醇:氯仿部分(快速公车提供5)对海拉细胞有抗增殖的影响。经过48小时的曝光,这个分数在200集中μ克毫升⁻¹显著降低细胞增殖与可见海拉细胞形态学变化。细胞周期分析显示,抗增殖效果快速公车提供5可能是由于抑制DNA合成s阶段的海拉细胞细胞周期,而没有显著的变化在控制细胞细胞周期检测。快速公车提供5通过细胞凋亡引起的细胞死亡比例从DNA碎片和caspase-9明显激活。因此,提取有潜力评估详细评估这种植物的分子mechanism-mediated抗癌活动。

1。介绍

宫颈癌是女性最常见的癌症在印度一些地区1]。500年全球000例宫颈癌的报告,每年印度占的总发病率(五分之一2]。天然产物是药物活性化合物的最成功的来源在植物材料应有一个重要的位置。Boerhaavia diffusal .(紫茉莉科),俗称“punarnava”在印度的医学体系,是一种多年生匍匐草发现大量在印度。在古印度医学书籍等查拉卡Samhita和Sushrita Samhita,它是提到的阿育吠陀制剂punarnava题,punarnavastaka kvath,punarnava kshar和punarnava taila都是用于治疗各种疾病(3]。在印度传统医学的根源b . diffusa已经被广泛用于治疗消化不良,黄疸,脾肿大、腹痛和作为抗应激剂(4,5]。药理研究表明punarnava拥有punarnavoside,展品范围广泛的properties-diuretic [6),纤溶7],抗惊厥的[8),抗菌9]。科学研究使用这种植物的提取表明它有镇痛和抗炎性质10,11[],hepato-protective活动12,13),免疫调节活动(14- - - - - -16)和anti-proliferative属性(17]。Liriodendrin孤立的甲醇提取物的根源b . diffusa发现表现出显著的钙通道拮抗活性(18]。同样,甲醇提取物也表现出显著的解痉药豚鼠回肠的活动,通过直接影响平滑肌(19]。甲醇溶液(3:7)提取的b . diffusa被发现有效地减少B16F10黑素瘤细胞的转移形成(20.]。Punarnavine,一种生物碱b . diffusa可以增强免疫应答对转移的进展B16F-10小鼠黑色素瘤细胞(21]。Eupalitin-3-O -β- - - - - -D-galactopyranoside (Bd-1) ethanolic叶提取液的分离和纯化b . diffusa表明选择性免疫抑制活性(22]。全植物提取的b . diffusa有放射防护作用(23]。两个鱼藤酮与b . diffusaboeravinones G和H,强有力地抑制药物流出活动发现了乳腺癌耐药蛋白(BCRP / ABCG2),耐多药转运体负责癌症细胞抵抗化疗(24]。这些研究大多是用植物粗提物或与一些已知的孤立的化合物。为了隔离小说主要从铅/活跃b . diffusa,我们想要探索其对宫颈癌抗增殖作用。到目前为止,这个工厂没有这样的报告显示其影响宫颈癌。调查植物的化学成分表示几个鱼藤酮的发生即boeravinone j [24- - - - - -28)和两个生物碱,Punarnavine-1 Punarnavine-2,属于集团quinolizidine [29日]。尽管复合的根、种子和叶子b . diffusa、隔离的β谷甾醇,β谷甾醇,β- - - - - -D葡萄糖苷、tetracosanoic hexacosanoic硬脂,棕榈,hextriacantane, urosolic酸已被报道,花生酸(7,30.];然而,尚不清楚是否这些化合物的抗增殖和细胞毒性的活动。尽管各种治疗的影响b . diffusa,对植物的根中提取的抗增殖作用及其具体的作用机制。这促使我们研究这种植物的生长抑制作用在宫颈癌细胞系。

2。方法

2.1。植物材料和提取过程

草b . diffusa收集来自瓜廖尔、印度,在2004年6月,被Gurcharan辛格博士,植物学,斯里兰卡大师的羊毛阁下节日学院,德里大学德里。这种植物的根干切成小块和磨成粉。粉(110克)浸渍醚(1升)和允许在室温下站了大约24小时。有过滤后收集和提取的过程是重复六次。移除醚提取物后,残渣和95%乙醇浸渍(1升)水(1升),每个六次。提取是过滤减压下蒸发干燥之前用旋转蒸发器在45°C。原油的产量比例提取计算:(粗提物的重量/体重的新鲜植物)×100%。

2.2。Bioactivity-Guided净化

所有从三种不同的提取溶剂提取获得(醚、乙醇和水)受到细胞增殖试验。ethanolic提取的生物测定结果显示,显著抑制作用进一步受到使用柱层析法进行纯化。固定相是由玻璃列挤满了硅胶60 - 200网格的大小。组合的流动相由石油醚、氯仿和甲醇(甲醇),和溶剂的洗脱强度逐渐增加,增加更多的极性溶剂的组成。ethanolic提取纯化的,最初的溶剂成分是石油醚(100% v;300毫升),然后是改变了石油醚:氯仿(4:1 v / v;500毫升),其次是石油醚:氯仿(3:2 v / v;300毫升),石油醚:氯仿(2:3 v / v;200毫升),石油醚:氯仿(1:4 v / v;400毫升)、氯仿(100% v; 1500 mL), chloroform : MeOH (98 : 2 v/v; 800 mL), chloroform : MeOH (95 : 5 v/v; 1100 mL), chloroform : MeOH (9 : 1 v/v; 1500 mL), chloroform : MeOH (4 : 1 v/v; 800 mL), chloroform : MeOH (7 : 3 v/v; 500 mL), chloroform : MeOH (1 : 1 v/v; 300 mL) and finally to MeOH (100% v; 500 mL). The eluent was collected in fractions of 100 mL each. The chemical composition of each fraction was evaluated by using thin-layer chromatography (TLC) and visualized with UV (254 and 365 nm) and iodine vapors. Based on the TLC profiles, fractions with similar compositions were pooled together and concentrated under reduced pressure. A total of seven major combined fractions were obtained from the ethanol extract. A diagram of the purification process is illustrated in Figure1(一)。

通过柱层析法获得的分数受到海拉细胞的抗分析线和后一个最活跃的样本(快速公车提供5)被选为评价其抗增殖效果的海拉细胞线。的高效液相色谱法b . diffusa分数5(快速公车提供5)进行了岛津制作所使用反向高效液相色谱系统相C-18柱和紫外检测器(254海里)。甲醇:水(50:50;v / v)作为流动相、流速保持在1毫升分钟⁻¹。

2.3。样品制备的b . diffus提取

Boerhaavia diffusa乙醇根提取物及其不同分数溶解在二甲亚砜(DMSO,σ,圣路易斯,美国)。对所有实验,最终测试化合物的浓度由与培养基稀释股票。

2.4。细胞系和培养基

海拉(宫颈癌)和其他像u - 87细胞系(人类神经胶质瘤),消息灵通的3 b(肝癌)HCT-15(结肠癌),NIH 3 t3(小鼠胚胎成纤维细胞)从国立购买普纳,在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(美国圣路易斯σ)补充10%热灭活胎牛血清(penicillin-streptomycin GIBCO)和1%(美国圣路易斯σ)。5%的细胞在湿润的气氛中孵化有限公司₂在37°C。所有的细胞系的研究中使用通道数量之间的5和10。

2.5。在体外细胞毒性试验

细胞存活率测定使用MTT微量培养四唑试验,根据Mosmann[描述的方法31日用细微的修改。简单,细胞在指数增长阶段使胰蛋白酶化,在完全培养基resuspended人口0.25×10⁵细胞毫升⁻¹。每口井的总共5000个细胞被播种在96孔板。24小时孵化后湿润有限公司5%₂孵化器在37°C,不同浓度的BD根提取物添加到最终成交量为200μl标准每口井的生长介质。DMSO溶液的浓度用于溶解提取不超过0.3% (v / v),因此使用相同的DMSO浓度控制井。甲氨蝶呤(浓度的10、20、50、100和200海里)被用来作为一个积极的控制。在37°C 72 h孵化后,20L (MTT [3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5 -二苯溴化四唑)(表达载体)5毫克毫升⁻¹在磷酸缓冲盐(PBS)被添加到每个和孵化4 h在37°C。中被删除,因此甲瓒晶体形成在DMSO溶液溶解。板块在微型板块立即读读者(Tecan、Genios-Pro、奥地利)操作在540海里。

2.6。细胞增殖动力学

治疗后,细胞生长培养基中培养不同时间间隔的时间,收获的胰蛋白酶化和计算血细胞计数器(附着和漂浮细胞汇集在一起)32]。细胞增殖是通过计算计算的增加细胞数量和细胞增殖指数P,计算 在哪里:细胞的数量t和:细胞的数量的治疗。

2.7。形态分析

海拉细胞指数增长阶段被镀在2×10⁴细胞培养皿40毫米。经过24小时增长,细胞处理快速公车提供5 (200μ克毫升⁻¹对不同时期)和车辆控制。的治疗,效果快速公车提供5海拉细胞的形态学变化评估相差显微镜(日本尼康)100×放大。

2.8。分析的DNA碎片

中含有10%的边后卫,0.5×10⁶细胞培养24小时。24小时后,细胞治疗快速公车提供200的浓度克毫升⁻¹。对于每个实验时间点,收集细胞通过胰蛋白酶化和冲洗两次在寒冷的磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.4)。基因组DNA提取从海拉细胞如前所述33]。简单细胞re-suspended两次裂解缓冲Nonidet-P40含有1%,20毫米EDTA和50毫米Tris-HCl, pH值8。细胞在1600 g离心10分钟,恢复浮在表面的结合和孵化0.5% SDS和0.5毫克毫升⁻¹美国圣路易斯核糖核酸酶A(σ)56岁°C 2 h和其后处理1毫克毫升⁻¹蛋白酶K(印度班加罗尔Genei) 37°C 4 h。1/10的DNA被添加沉淀卷7.5醋酸铵和两卷的乙醇和琼脂糖凝胶电泳分析。

2.9。细胞周期分析

细胞的分布在细胞周期的不同阶段被流仪DNA分析估计。流仪测量细胞DNA含量进行乙醇(70%)固定细胞使用插入DNA荧光染料,propidium碘所描述的Dwarakanath et al。34]。简单地说,5×10⁵细胞培养在60毫米菜中含有10%的边后卫。24小时后,细胞治疗快速公车提供5在200年最终的浓度克毫升⁻¹。细胞收获在不同的时间间隔,洗两次冷PBS (pH值7.4)和70%乙醇固定在4°C / 30% PBS。固定细胞用PBS去除乙醇和孵化0.2毫升PBS含有核糖核酸酶(200克毫升⁻¹美国圣路易斯)(σ)和孵化在37°C为30分钟,然后沾50克毫升⁻¹propidium碘(π,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟在黑暗中在室温下,最后在流式细胞仪分析血细胞计数器(美国正欲石中剑)。至少1×10⁴每样本评估细胞,每个细胞周期阶段细胞的百分比计算使用CELLQUEST和Modfit软件(正)。

2.10。BrdU标记脉冲

快速公车提供5细胞治疗脉冲BrdU(胸苷类似物)(美国圣路易斯σ)的浓度为10米,在每个时间点之前10分钟。在每个时间点细胞使胰蛋白酶化和冷PBS洗两次,固定与70%乙醇和储存在4°C到使用。流仪分析的免疫荧光染色被Zolzer et al。35]。细胞被洗冷盐水(0.9%氯化钠),细胞颗粒与胃蛋白酶孵化(0.5%在0.055 N HCl, pH值1.8)10分钟37°C。解除的DNA是在室温下为2 n HCl 30分钟和PBS洗。细胞被孵化与第一抗体(PBS-Tween anti-BrdU 1: 300)(圣克鲁斯生物技术有限公司)在4°C 45分钟。非特异性染色是预防首先阻止PBS-Tween 20 (0.05%) bsa(1%),其次是孵化与二次抗体(PBS-Tween-BSA 1: 500)(圣克鲁斯生物技术有限公司)为45分钟,在4°C。细胞被沾propidium碘(50μ克毫升⁻¹)。细胞终于收购FACScalibur流式细胞分析仪(美国正欲石中剑),分析了使用ModFit软件;000事件收集,纠正碎片和总数量。

2.11。免疫印迹分析

收集的适当治疗后,细胞分离和离心(600克,5分钟,4°C)。完整的细胞蛋白提取如前所述[36]。丸是用1毫升的冰冷的PBS,再次通过离心收集(600克,5分钟,4°C)和resuspended裂解缓冲包含消息灵通的25毫米,5毫米MgCl₂德勤,EDTA 2毫米,2毫米,1毫米PMSF, 1毫米原钒酸钠,1% SDS, 1% Triton x - 100和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ,圣路易斯,美国)。溶菌产物的5×10⁶细胞用然后离心机(18 000 g, 10分钟,4°C)。声波降解法后,溶解产物离心如上所述,上层的收集。

等量的蛋白质(50g),确定使用布拉德福德蛋白质评估工具包(GeNei、班加罗尔GeNei、印度),加载并解析使用12% sds - page和转移到PVDF膜(Mdi、安巴拉、印度)。屁股在一夜之间被封锁在4°C PBS-Tween 20 (0.05%) bsa(3%)然后孵化主要抗体阻断缓冲区(一夜之间,4°C)。在这项研究中使用的抗体包括caspase-3, caspase-9和反β肌动蛋白。使用的所有主要的抗体得到从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。洗后用PBS含有0.05%渐变(PBS-T),墨迹图与二次孵化抗体;goat-anti-mouse IgG-HRP caspase-9和donkey-anti-goat IgG-HRP caspase-3和β肌动蛋白(美国圣克鲁斯,CA)在4°C 2 h。连续洗后,屁股是使用少量系统开发(GeNei、班加罗尔GeNei、印度)。照片拍摄使用GeneSnap采集软件(Syngene,剑桥,英国)。GeneTools分析软件是用于量化的乐队。

2.12。统计分析

实验进行了一式三份,所有的实验数据都表示为平均数±标准差。统计学意义的差异控制和BD extract-treated团体由单向方差分析Dunnett的紧随其后t为多个比较和测试学生的t以及为双重比较。结果被认为是重要的P< . 05。

3所示。结果

3.1。人类癌症细胞株的生长抑制的摘录b . diffusa

不同来源的细胞系可能表现出不同的敏感性对相同的化合物。因此,有必要考虑多个细胞系在最初的筛选实验。轴承这一点,四个细胞系的人类起源,即海拉(宫颈癌),u - 87(神经胶质瘤),消息灵通的3 b(肝癌)HCT-15(结肠癌)和一个鼠标NIH 3 t3(小鼠胚胎成纤维细胞),被用于本研究。在体外筛选的提取b . diffusa表明ethanolic原油根提取细胞毒性对海拉细胞线。而其他细胞系即u - 87、HCT-15,消息灵通的3 b和发生NIH 3 t3对治疗不敏感的BD EtOH原油根提取物(数据未显示)。在300年的浓度克毫升⁻¹,粗根提取30%的海拉细胞死亡引起的细胞系。原油提取通过柱色谱法提纯使用硅胶作为固定相,增加溶剂极性的示意图如图1(一)。通过柱层析法获得的分数受到抗测定海拉细胞线后,一个最活跃的样本(快速公车提供5)被选为进一步评价其antiprolirerative影响这个细胞系。分数5(快速公车提供5)显示,最大的细胞毒性和细胞死亡在300年的85%克毫升⁻¹在72 h。用流动相的高效液相色谱法快速公车提供5(50% 50%甲醇:水)显示两个峰(图1 (b))。这两个峰的特征目前正在接受调查。所有其他分数并没有显示出明显的抗增殖效果(图2(一个))。部分根提取纯化柱分数快速公车提供5测试时间——以及剂量依赖性的方式对海拉细胞系细胞毒性的影响。快速公车提供5原因55%浓度的细胞死亡300人μ克毫升⁻¹曝光后24小时,没有发现显著的影响在一个100的浓度μ克毫升⁻¹。长期治疗(72 h)与快速公车提供5显示300浓度的细胞死亡的85%μ克毫升⁻¹甚至细胞死亡64%在100年μ克毫升⁻¹浓度(图2 (b))。

3.2。细胞增殖

快速公车提供5的影响的扩散指数增长的海拉细胞被监测细胞生长的动力学研究。减少时间的观察细胞增殖率(图3),滞后期紧随其后12 h和增长的抑制细胞生长的作用抑制24 h后治疗。然而,几乎> 50%浓度的细胞死亡或退化200μ克毫升⁻¹在48 h。

3.3。快速公车提供5引起可见的海拉细胞形态学变化

我们考察了细胞形态学的变化使用相差显微镜详细。细胞经历了明显的形态学变化,如收缩,舍入、超然和200年海拉细胞暴露于膜起泡μ克毫升⁻¹的快速公车提供针对不同时期(图54)。这些形态变化表明,快速公车提供5月5日在海拉细胞诱导凋亡细胞死亡。

3.4。快速公车提供5对DNA碎片

DNA分裂是细胞凋亡的特征(37]。因此,快速公车提供证实了5-induced细胞凋亡的DNA碎片试验。在海拉细胞DNA碎片是明显增加与200年治疗后μ克毫升⁻¹快速公车提供5 24、48和72 h。琼脂糖凝胶电泳的典型实验结果如图5的影响,快速公车提供5 72 h治疗产生DNA碎片。而治疗DMSO溶液(0.3%)(负控制)没有产生DNA片段梯子在海拉细胞72 h后。甲氨蝶呤治疗(积极控制)在200纳米浓度也产生了72 h后DNA片段梯子在海拉细胞治疗。

3.5。细胞周期扰动

部分纯化的影响分数的海拉细胞细胞周期进程是由流式细胞术。海拉细胞治疗快速公车提供200的最终浓度μ克毫升⁻¹显示,G1期细胞从52±1.4%减少至48±1.2%和G1期的降低伴随着人口的增加13±1.5%的G2 + M期控制在细胞治疗16±2.0%。快速公车提供5还显示,通过s阶段发展,适度抑制略微降低s阶段从30±0.5%的人口在48小时28±2.5%。这是伴随着人口的增加G2 + M期从10±2.0%,控制在对待文化18±2.0%。72 h,治疗后细胞得到积累在s阶段以及G2 + M细胞的人口的增加。这是伴随着细胞的比例减少,细胞周期G1期的(表1)。海拉细胞的代表直方图如图6。

从细胞周期分析我们观察到峰值对应的外观与sub-G1人口的细胞DNA含量48 h后治疗。DNA直方图显示hypo-diploid人口(图48 h后治疗6),提示凋亡细胞死亡在这些条件下。

3.6。细胞测定s阶段使用Bromodeoxy尿苷

探讨细胞周期的细胞s阶段BrdU脉冲标记了,分数5(快速公车提供5)的抑制作用在海拉细胞行进一步证实使用BrdU纳入治疗和治疗细胞体外。因此快速公车提供5对DNA合成的影响研究通过测量BrdU incorporaton通过流式细胞术anti-BrdU主要单克隆抗体。Biparametric直方图BrdU-FITC荧光诗句π荧光图所示7。BrdU-labeled细胞治疗海拉细胞为94.09±3.97%,而与200年48 h后治疗μ克毫升⁻¹BrdU-labeled细胞快速公车提供5日60.75±1.88%。这是17%的总28% s阶段细胞由细胞周期分析。统计意义被发现感染的细胞治疗和治疗(P< . 01)。

3.7。快速公车提供5-Induced差还在海拉细胞蛋白表达与细胞凋亡有关

为了评估机制快速公车提供5-induced凋亡,我们评估了表情还存在的免疫印迹分析。还存在胞质蛋白通常与高分子量活性前体(46岁,32 kDa)。他们是裂解proteolytically成低分子量(kDa 20 - 23日)当细胞凋亡(38]。在这项研究中,不活跃的表达式形式的caspase-3和caspase-9拒绝治疗后快速公车提供5 (200μ克毫升⁻¹在不同的时间段(图)8(一个))。procaspase-9的表达下降大约50%和25%的表达下降procaspase-3相比控制(图48 h后治疗8 (b)和8 (c))。

4所示。讨论

治疗癌症的可能受益于新的治疗方法的引入来自天然产物。自然产品服务提供一个基础的许多医药代理当前癌症治疗中使用(39]。根、叶和空中部分或整个植物b . diffusa曾在阿育吠陀治疗各种疾病的草药。证明,叶和根拥有antifibrinolitic和抗炎活动(11]。Ethanolic提取物通常用于抗癌筛选,因为间接证据与传统从业者认为,主要是极性化合物负责声称抗癌特性。Mehrotra等人的研究,报道了ethanolic提取的b . diffusa表现出显著的抗增殖和免疫抑制活性17]。将铅从这些我们已经开始与ethanolic提取工作。Leyon等人的抑制作用b . diffusa在实验性转移20.]。目前的研究是研究细胞毒性进行活动的BD EtOH根提取和纯化分数(快速公车提供5)在海拉细胞行提供一个入门方法评价的传统制备为了科学验证的治疗准备这种植物在控制癌症。我们所知,这是第一个报告,分析了抑制作用的快速公车提供5 s阶段希拉细胞系的细胞周期。细胞系的不同组织学起源对一种抗增殖化合物可能会表现出不同的敏感性。抗增殖细胞类型特异性中观察到b . diffusaethanolic粗根提取物。它显示细胞毒性在海拉细胞线和更少的有毒其他细胞系进行测试。这种特异性的植物提取物可能是由于存在不同的类化合物的提取,因为它已经被记载在已知的情况下类化合物(40]。植物ethanolic提取分离在硅胶柱层析法,根据化合物的极性。这些受到MTT测试抗增殖活动(图2(一个))。快速公车提供5显示对海拉细胞的细胞毒性与IC₅₀值250μ克毫升⁻¹在48 h(图2 (b))。这样的观察表明,一些活性成分的植物应该在氯仿:甲醇分数。然而,这种植物的抗增殖活动可能可能依赖于细胞类型包括文化条件。在这项研究中,细胞生存能力分析和形态分析的结果表明,快速公车提供5显著抑制海拉细胞扩散时间的方式(数字3和4)。海拉细胞的抗增殖活动快速公车提供5可能结果,至少在某种程度上,抑制DNA合成和增殖,诱导细胞凋亡(图6)。从流仪观察DNA分析表明,引起的细胞死亡方式快速公车提供5是主要通过细胞凋亡,最终继发坏死。这进一步加强了DNA碎片试验(染色质DNA碎片通过internucleosomal劈理),这被认为是细胞凋亡的一个特点。DNA梯的外观被琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA提取的DMSO溶液(0.3%)或者快速公车提供5 (200μ克毫升⁻¹)治疗海拉细胞。快速公车提供5-treated细胞表现出典型的internucleosomal DNA碎片或“梯子”形成时间点测试(图5)。细胞增殖动力学明显表明,200μ克毫升⁻¹迟钝的速度进展通过s阶段和诱导细胞G2 + M的积累(表1)。虽然迟钝,似乎s阶段的完成是可以实现的,但持续的病变可能阻止细胞进行有丝分裂,从而阻断细胞G2-M通过G2检查点控制过渡。抑制DNA合成,因此通过细胞周期的进展证实了海拉细胞减少BrdU合并与降低细胞增殖有关。BrdU胸苷模拟,纳入地方胸苷的合成积极增殖细胞的DNA链。整合BrdU因此用作DNA复制的证据。的能力快速公车提供5减少BrdU整合进DNA可以被解释为快速公车提供5抑制DNA合成的能力。治疗后与200年μ克毫升⁻¹快速公车提供5 48 h, BrdU-labeled扩散细胞显著减少(P< . 01)(图7),这表明,快速公车提供5提取影响宫颈癌细胞的增殖抑制DNA合成。尽管治疗快速公车提供5没有显著改变细胞的s阶段分析了DNA分析(表1),它不排除快速公车提供5的抑制作用DNA合成的进展(链伸长)作为分析的DNA含量并不能区分细胞S阶段(基于DNA内容)积极DNA合成(S + ve)细胞从静止S阶段(不参与DNA合成;−ve或年代₀细胞)。治疗某些化疗药物和高剂量的辐射是众所周知的逮捕,从而导致细胞的s阶段生长抑制。可以区分S + S−ve的帮助下已经只有积极合成DNA探针识别细胞;例如将放射性标记的胸苷(和放射性计数)或BrdU加上anti-BrdU抗体并通过流式细胞术分析。我们选择使用BrdU方法。BrdU脉冲标记实验措施积极参与的部分细胞DNA合成细胞总数的s阶段。细胞周期分析显示,治疗后48 h快速公车提供5 s阶段细胞总数的28%(比30%未经处理的文化)。近60%的这些s阶段细胞(例如,~细胞总数的17%)测试+ ve BrdU合并(S + ve细胞)表明他们积极参与DNA合成,而剩下的40%(即。总人口的11%)被静止在S阶段(S−ve)。

的激活cystein aspartic-specific蛋白酶(还)通常被认为是最早的分不能回转的细胞凋亡途径。还大致分为上游监管还存在和下游效应还存在(41]。等还存在上游,caspase-8(死亡受体通路)和caspase-9(线粒体通路),通常有一个漫长的氨基端prodomain促进互动和招聘proapoptotic蛋白质,包括其他还42]。还存在下游,如caspase-3、6和7,有短而prodomains,主要是分裂的蛋白质,这是重要的细胞功能和导致细胞凋亡43,44]。我们的研究结果表明,凋亡信号触发快速公车提供5主要是线粒体相关通路。我们确定是否caspase-9和caspase-3中可能被激活细胞凋亡的诱导快速公车提供5因为caspase-3扮演着一个重要角色在细胞凋亡作为遗嘱执行人。我们观察到的表达水平下降46 kDa前体(procaspase-9)和32-kDa前体(procaspase-3)治疗后表明caspase-9和caspase-3激活快速公车提供5(图8)。这些结果决定性地表明,快速公车提供5海拉细胞发生凋亡,伴随引发caspase-9和caspase-3激活。

因此,可以得出结论,anti-proliferative活动快速公车提供5个可能的结果,至少在某种程度上,从抑制DNA合成,阻滞细胞增殖和诱导凋亡的肿瘤细胞的死亡。许多抗癌药物抑制细胞周期进程。这些以化合物(i)干扰核苷酸代谢,如甲氨蝶呤、抑制二氢叶酸还原酶;(2)损害DNA,例如,anthracyclins、拓扑异构酶抑制剂,或烷基化剂;或(3)防止功能有丝分裂纺锤体的形成,如紫杉烷或长春花生物碱。所有这些扰动造成某种损害细胞,导致特定的检查点的激活触发细胞死亡(45]。各种药物[1 -β- - - - - -D-arabinofuranosylcytosine (ara-C)、羟基脲(胡),5-hydroxy-2-formylpyridine thiosemicarbazone(5点)和喜树碱钠盐(喜树碱)]认为明显抑制DNA合成,并最大限度地细胞毒性细胞s阶段(46]。分阶段的代理将会最大限度地有效只有在它允许循环细胞进入细胞毒性的阶段。因此,S-phase-specific代理块G1细胞的发展只会杀死这些细胞的年代时药物补充道。辛克莱表明胡有这样一个效果,即细胞被杀死在s阶段,而non-S-phase细胞积聚在G1-S边界(47,48]。当胡锦涛被移除,积累细胞通过细胞周期同步进行。Ara-C已被证明有类似的效果49]。抑制DNA合成可能是由于分子的结合成DNA, Ara-C和dFdC一样。更有可能的是,很可能快速公车提供5直接抑制DNA聚合酶或DNA结合non-intercalative模式,从而干扰DNA链伸长。这些可能性是目前正在接受调查。

5。结论

总之,b . diffusa分数5(快速公车提供5)可以抑制人类宫颈癌细胞株的增殖,海拉。我们的研究结果表明,细胞周期抑制通过s阶段扮演一些角色b . diffusa -海拉细胞诱导抗增殖活动。综上所述,本研究的结果示意图呈现在图9。酒精和水提取的b . diffusa含有一些生物活性分子如还原糖、淀粉和木酚素liriodendrin syrigaresinol。几个Boeravionones (Boeravionones j等)也被隔绝b . diffusa。活动的部分纯化分数5所示(快速公车提供5)可能归因于这些不同的化合物。虽然科学研究已经完成大量的印度的植物,植物化学的实体的一个相对较小的畅销药物已经进入了以证据为基础的治疗(50]。作者想确定b . diffusa是一种很有前途的药物应该进入世界市场的实体以证据为基础的治疗研究。然而,在分子水平上进一步生化和调查工作正在进展在我们实验室来确定活性成分能够诱导生长抑制和建立可能的解释的草药提取DNA合成抑制的机制。

资金

这项工作是支持由印度医学研究理事会;新德里。

承认

作者感谢Gurcharan辛格博士(植物学、斯里兰卡大师的羊毛阁下节日学院,德里大学德里)的植物材料的识别。