效果的ORF7 SARS-CoV-2单核细胞和中性粒细胞的趋化性体外

文摘

冠状病毒疾病2019 (COVID-19)造成的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)是目前全球最重要的公共卫生威胁。严重COVID-19通常有肺炎患者伴发炎症,有时细胞因子风暴。特定组件的SARS-CoV-2病毒引发肺部炎症,免疫细胞到肺部和招聘,加重了这个过程,尽管COVID-19的发病机制仍然不太清楚。我们研究肺二型(A549)证明ORF7 pneumocyte细胞,一个开放阅读框(ORF)的基因组SARS-CoV-2,诱导生产CCL2,趋化因子,促进单核细胞的趋化性,和减少引发的表达,一个招募中性粒细胞的趋化因子。A549细胞的il - 6水平也明显增加。趋化性结果Transwell试验表明ORF7增强单核细胞浸润和减少中性粒细胞的数量。我们得出这样的结论:ORF7 SARS-CoV-2可能有特定的对在感染后免疫组织的变化的影响。这些结果表明,其他SARS-CoV-2 orf的功能也应全面检查。

1。介绍

冠状病毒疾病2019 (COVID-19)是一种传染性疾病造成的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2),已成为世界范围内大流行1- - - - - -3]。确认病人感染的数量每天SARS-CoV-2继续增加。截至2021年4月,有01.4亿多人SARS-CoV-2感染和300万人死于COVID-19报道世界范围内(https://coronavirus.jhu.edu/map.html)。这个全球大流行仍然没有得到控制,虽然有令人鼓舞的趋势在一些地区。其他冠状病毒,即和SARS等,有很高的遗传性,但流行仅限于某些地区和人群。因此,SARS病毒感染导致超过8000例和700例死亡,26个国家,即在27个国家对2500例和858例死亡(4- - - - - -6]。相比之下,出现了一个巨大的疾病负担与SARS-CoV-2感染有关。许多疫苗是目前在许多地区,和临床试验已经表明他们是有效的和安全的7,8]。

SARS-CoV-2感染肺上皮细胞,II型肺泡细胞(ATII),通过绑定到膜相关血管紧张素转换酶2 (ACE2)在细胞表面9- - - - - -12]。一旦进入宿主细胞,SARS-CoV-2开始产生病毒RNA聚合酶,然后复制基因组RNA互补,使双链RNA (13]。随后,细胞转化的结构和非结构蛋白(NSPs) SARS-CoV-2在胞质13,14]。结构蛋白包括核衣壳(N)、(S),膜(M),信封(E)的蛋白质,NSPs包括16 NSPs ORF1ab [15]。至少有10个开放阅读框(orf)的基因组SARS-CoV-2: ORF1ab, ORF2蛋白(S), ORF3、ORF4 (E蛋白),ORF5 (M蛋白),ORF6, ORF7, ORF8, ORF9 (N蛋白)和ORF1015,16]。病毒聚合酶和16个NSPs翻译从ORF1ab subgenome [16]。S、N E和M蛋白结构蛋白,16 NSPs函数在病毒基因组的复制和转录(15]。

新兴的证据表明,几乎所有这些ORF蛋白质SARS-CoV-2的生命周期中所扮演的重要角色。作为RNA病毒,SARS-CoV-2感染刺激细胞的先天免疫细胞溶质的RNA传感器蛋白质,如视黄酸诱导基因(rig - i),黑素瘤differentiation-associated gene-5 (mda - 5)和toll样受体(TLR 3/7/8),诱导干扰素的表达(干扰素)17]。ORF6、ORF8 SARS-CoV-2的N蛋白抑制这些IFN-activated抗病毒通路,这抑制了IFN-stimulated响应元件(ISRE) [18]。此外,ORF3移植标记的细胞凋亡在293 t,维罗E6 HepG2, (19]。尽管一些羊痘疮的功能不完全理解,所有子和NSPs SARS-CoV-2生命周期中有特定的功能。

目前的在体外研究了函数的ORF7 SARS-CoV-2通过关注监管众多细胞因子和趋化因子(il - 6, TNF-a,引发、CXCL2和CXCL7)这个函数在体外单核细胞和中性粒细胞的趋化作用。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和向量ORF7建设

肺腺癌细胞系(A549)购买从中国科学院(中国上海)和细胞培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;美国Hyclone,洛根,UT)与10%胎牛血清(的边后卫;美国纽约康宁)和1%的青霉素和链霉素湿润孵化器有限公司为5%₂在37°C。慢病毒转染的向量窝藏FLAG-tagged ORF7 SARS-CoV-2的构造使用特定SARS-CoV-2应变(Wuhan-Hu-1毒株,NC_045512)。转染是执行,ORF7-expressing A549细胞。控制细胞转染与控制向量。

2.2。定量实时聚合酶链反应(存在)

RNA提取细胞使用试剂盒试剂(豆类、大连),然后使用PrimeScript反向转录成cDNA RT大师混合(豆类、大连)。mrna的表达(IL-1a,IL-1b,IFN-α,IFN-β,il - 6,引发,CCL2,TNF-α)使用中存在量化结核病绿色主人混合(豆类、日本)。表达式是归一化GAPDH,和相对表达式计算使用方法(底漆表中列出1)。执行中存在与QuantStudio™Dx系统(ABI、热、美国)使用下列程序:变性在95°C 5分钟,40个周期95°C的5 s和60°C 30年代,紧随其后的是95°C的熔化曲线步骤1分钟15秒和60°C,并最终增加到95°C。

2.3。免疫荧光

ORF7-expressing A549细胞培养与幻灯片6-well板块。24小时之后,当这些细胞被坚持盖玻片,细胞与4%多聚甲醛固定15分钟和permeabilized tritonx - 100的0.5%。阻塞了30分钟后在室温下使用3% BSA,这些细胞被孵化用鼠标anti-FLAG抗体(美国σ)在4°C过夜,然后被沾染了异硫氰酸荧光素(FITC)——共轭山羊anti-mouse抗体(ProteinTech)在室温下1 h。细胞核与DAPI染色(Abcam ab104139)的细胞分布ORF7用共焦显微镜观察。

2.4。免疫印迹分析

西方墨点法进行了如前所述[20.]。短暂,细胞细胞溶解与SDS样品缓冲(1 x),煮10分钟,用4 - 20% SDS - page分离(美国GenScript),然后转移到一个0.22μm聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国微孔)。后阻塞1 h与3% BSA在室温下,膜与稀释孵化主要抗体在一夜之间在4°C。二次抗体被添加在室温下2 h。蛋白质乐队被发现使用清晰西方ECL衬底(美国Bio-Rad)。

2.5。人类嗜中性粒细胞和单核细胞的隔离

中性粒细胞分离使用PolymorphPrep从人类健康捐献者的血液样本(Alere技术,奥斯陆,挪威)如前所述[21,22]。短暂,5毫升的血液分层到5毫升PolymorphPrep和离心机在室温下35分钟(500克)。嗜中性粒细胞层被转移到一个新的管,与ddH洗与PBS稀释50%₂啊,然后离心10分钟(400克),其次是红细胞裂解裂解缓冲(Solarbio,中国)。

外周血单核细胞(PBMCs)与健康的捐赠者的血液样本使用聚蔗糖密度梯度(23]。然后,CD14微(Miltenyi研究,德国)被用于人类单核细胞从这些细胞的积极的选择24]。CD14的纯度⁺细胞是评估使用APC-conjugated反CD14分子抗体(eBioscience, CatNo: 17-0149-42)与流式细胞术。机构浙江大学第一附属医院伦理委员会批准了这项研究。

2.6。Transwell化验

Transwell进行了分析使用一个12毫米Transwell 3.0μ米孔隙聚碳酸酯膜插入(美国康宁CatNo: CLS3402) (25]。A549细胞与慢病毒转染被播种在众议院和培养24小时的DMEM包含10%的边后卫。来自人体的单核细胞和中性粒细胞在无血清DMEM被添加到参议院。孵化后1 h,细胞的另一面上院和4%多聚甲醛固定,然后在结晶紫染色和显微镜观察。细胞在下院被流式细胞仪收集和统计,并计算不同样本的珠子被用于定量(26]。

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

ORF7-expressing A549细胞和控制细胞被镀成6-well盘子。上层清液收集,用于测量CCL2 (MultiSciences CatNo: 70 - ek187 - 96), CCL7 (Cloud-Clone Corp .)、CatNo: SEA089Hu)和il - 6 (MultiSciences CatNo: 70 - ek206/3 - 96)使用ELISA包根据每个制造商的指示。

2.8。统计分析

使用学生的差异决定的意义 - - - - - -7.0版本测试GraphPad棱镜(GraphPad软件,CA)。一个值低于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。建设ORF7-Expressing A549细胞

ACE2表面发生pneumocytes和绑定期间SARS-CoV-2感染(27]。因此,我们首先检查ACE2在A549细胞的表达,II型pneumocyte细胞系(28]。西方墨点法和定量PCR结果证实这些细胞ACE2表达(数字1(一)和1 (b))。然后我们使用的顺序SARS-CoV-2隔离(Wuhan-Hu-1 NC_045512.2)构建慢病毒载体表达了FLAG-tagged ORF7 subgenomic序列(Lenti-ORF7-FLAG)和转染A549细胞Lenti-ORF7-FLAG建立ORF7-expressing细胞。我们确认的表达和细胞分布ORF7使用免疫印迹和免疫荧光。结果表明表达ORF7(图1 (c)),这种蛋白质存在于胞质(图1 (d))。这些数据从而证明成功建立ORF7-expressing A549细胞,可用于进一步研究ORF7的功能。

3.2。ORF7改变在A549细胞细胞因子和趋化因子的表达

先天免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞,是第一个细胞反应时肺部感染(29日]。特别是,感染pneumocytes导致大量单核细胞浸润到肺组织(30.),虽然似乎是有限的中性粒细胞的浸润在SARS-CoV-2感染(31日- - - - - -33]。在病毒感染的早期阶段,细胞因子(il - 1、- 2、引发,il - 10, CCL2, CCL7,干扰素-α干扰素-β和肿瘤坏死因子-α)招聘的基本功能的免疫细胞,抵御感染,促进炎症(34]。因此我们使用qPCR确定细胞因子和趋化因子的表达ORF7-expressing A549细胞相比,控制细胞(图2(一个))。结果表明,il - 6,CCL2,IFN-β有较高表达A549-ORF7细胞( );IL-1α,引发,TNF-α较低表达的细胞A549-ORF7 ( );两组没有水平的差异IL-1-β和IFN-α(包括 );和CCL7和il - 10是无法觉察的。

CCL-2 (MCP-1)和引发(CXCL8)函数在单核细胞和中性粒细胞的趋化作用,分别为(35,36]。仙台病毒(股票)和水泡性口炎病毒(VSV)感染刺激细胞内的先天免疫和可用于模型RNA病毒感染(37]。因此我们使用qPCR测量CCL2和引发表达A549-ORF7和控制细胞感染这些病毒(图2 (b))。结果表明,A549-ORF7细胞的表达CCL2和减少的表达引发而控制细胞(包括 )。我们也用ELISA测定引发的水平和CCL2 A549-ORF7上层清液的控制细胞(图2 (c))。这些结果证实,A549-ORF7细胞增加了表达CCL2和减少引发的表达有或没有水疱性口炎病毒感染/签订或受体激动剂的转导,流明瓦和高分子量rna(两者都是 )。

3.3。ORF7影响单核细胞和中性粒细胞的趋化作用

我们下一个检查ORF7的影响单核细胞和中性粒细胞的趋化作用。流式细胞术提供中性粒细胞CD11b +细胞(数字的识别3(一个)和3 (b))和单核细胞CD14 +阳性细胞(数字3 (c)和3 (d))。接下来,我们植入A549-ORF7低和控制细胞的12-well盘子,单核细胞和中性粒细胞在参议院,并记录趋化作用后6 h(单核细胞)和3 h(中性粒细胞)25,38]。结果表明,单核细胞趋化性增加,中性粒细胞趋化性降低(数字3 (g)- - - - - -3 (n))。

在这些实验中,我们发现了许多跨膜细胞、单核细胞和中性粒细胞降低井A549-ORF7细胞。因此,我们使用流式细胞术对细胞计数。结果表明,更多的单核细胞和中性粒细胞减少室A549-ORF7细胞迁移到低于控制A549细胞(所有 ;数据3 (e)和3 (f))。这些结果表明,ORF7吸引单核细胞和中性粒细胞体外排斥。

4所示。讨论

前后期检查表明COVID-19患者的肺,特别是免疫微环境,有显著的改变。这些变化包括改变T细胞、B细胞、巨噬细胞和中性粒细胞(39,40]。淋巴细胞、T细胞和B细胞不太丰富,分散在这些患者的肺30.,32,39,41),但增加了单核细胞浸润,巨噬细胞和中性粒细胞(42]。肺部感染后,巨噬细胞和中性粒细胞功能先天免疫系统的第一道防线,而这些细胞吞噬病原体和产生细胞因子和趋化因子,吸引其他免疫细胞(29日]。免疫细胞的早期招聘决定了当地的免疫反应,甚至可以导致更广泛的炎症,如细胞因子风暴。我们目前的工作检查的SARS-CoV-2 ORF7先天免疫的影响。我们的主要结果是,表达式的ORF7 II型pneumocytes (A549细胞)CCL2水平增加,减少引发的水平,增加基本单核细胞迁移,但减少中性粒细胞在体外的迁移。

ORF7基因位于基因组区域的SARS-CoV-2 SARS-CoV-1,即有高频突变的病毒(1]。我们的研究结果表明,ORF7具有特定功能的冠状病毒感染的免疫反应。单核细胞产生il - 1、il - 6、地震、IL-33, TNF -α、进一步推动和VEGF,这些分子的关键角色在细胞因子释放和招聘其他免疫细胞(43]。il - 6和il - 1的促炎细胞因子和细胞因子风暴的主要诱发者43,44]。另外,il - 6可以激活巨噬细胞,产生更多的细胞因子和趋化因子43]。在应对感染早期中性粒细胞也产生,和在人类中性粒细胞趋化性通常是由等因素引发,il - 1、TNF -α,补充C5a [45]。中性粒细胞、巨噬细胞等产生一系列细胞因子(TNF -α、图书馆、GCSF MCSF,刺激因子和趋化因子(引发,CXCL10 CXCL9, CCL2, CCL3,和亚兰)(43,46]。因此,中性粒细胞直接antipathogen效应(吞噬作用)和间接antipathogen效应(由细胞因子刺激)。巨噬细胞和中性粒细胞从而扮演关键角色在肺炎病毒感染后的急性期。

COVID-19患者比健康对照组更高层次的外周单核细胞(47,48]。最近的证据显示大量已故COVID-19患者的肺巨噬细胞浸润,包括intra-alveolar CD68 +巨噬细胞(30.,31日,49]。在这些组织中单核细胞(巨噬细胞)可能正处于一个活跃的增殖阶段这些患者的肺肺泡空间(50]。

先前的研究报道,SARS患者的血液中性粒细胞计数与肺炎的严重程度(51]。相比之下,其他的研究报道,COVID-19患者的血液中性粒细胞计数与疾病严重程度呈负相关(47,52,53]。尽管病毒感染,如流行性感冒,诱发呼吸道嗜中性粒细胞浸润,COVID-19患者的中性粒细胞在肺的地位似乎矛盾的(30.- - - - - -33,54,55]。几个尸检报告没有发现COVID-19患者的肺中性粒细胞浸润,但有中性粒细胞浸润肝(31日]。一些报道发现小入渗的中性粒细胞在肺将此归因于继发感染33]。一份报告4 COVID-19发现只有1例患者中性粒细胞浸润的肺55]。另一份报告两例发现中性粒细胞浸润在1病人的肺间质(30.]。其他研究报告巨核细胞,树突状细胞和自然杀伤细胞在已故COVID-19患者的肺33,40]。

目前的在体外研究发现,过度的SARS-CoV-2 ORF7培养II型肺泡细胞(A549)调节CCL2的表达,一种趋化因子单核细胞趋化作用的功能。这表明ORF7可能加速病毒感染后炎症的进展。我们的在体外研究还发现,ORF7下调引发的表达。这表明ORF7可能阻止中性粒细胞迁移。更大的肺中性粒细胞浸润可能会加剧细胞激素风暴和病人的病情恶化由于淋巴细胞减少56]。

有证据表明一个特定的变体的SARS-CoV-2突变N501Y S蛋白和在伦敦首次报道57)现在是普遍的。因为这种突变在S蛋白的受体结合域,这变种可能改变了其ACE2受体的结合能力。尽管这突变的蛋白质,最近的研究报道中和抗体对小鼠的疗效[58]。重要的是要考虑到RNA病毒的突变频率,冠状病毒、流感病毒等,是高于DNA病毒。

我们的研究表明,ORF7 SARS-CoV-2有特定的对免疫的影响变化。ORF7可能因此导致的独特免疫学概要COVID-19患者的肺组织,尽管其他羊痘疮的功能也需要检查。可以目标ORF7 anti-COVID-19药物在未来的发展。肺的炎症环境对严重COVID-19病人的主要风险之一。此外,ORF7和其他基因,包括结构和nonstructure蛋白质,组合涉及炎性环境后的肺部感染。

然而,对我们的工作有局限性。其他许多生理和病理因素影响患者的肺部的炎症状态SARS-CoV-2感染。例如,基因组RNA传感器系统触发先天免疫反应,刺激其他蛋白质的翻译从病毒的基因组或subgenome,并可能因此增加肺损伤。因此,拨款动物模型可以用于ORF7的决心在活的有机体内在未来。此外,ORF7对肺的微环境的影响不应被视为孤单。相反,应该有一个系统的检查所有的影响因素及其交互作用对肺部炎症。

数据可用性

没有公开的存档数据集分析在这项研究。

伦理批准

我们的研究机构伦理委员会的批准,浙江大学第一附属医院。

同意

法定监护人的书面知情同意。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Z.C. H.Z.负责概念化;G.W.,J.G., F.W., C.H., J.S., L.X., Z.G., and Q.Z. for the methodology; G.W. and J.G. for the formal analysis; G.W. and J.G. for the data curation; G.W. and J.G. for writing original draft preparation; Z.C., H.Z., and G.L. for writing—review and editing; Z.C. and H.Z. for the supervision; Z.C. for the project administration; and Z.C. for the funding acquisition, and Gang Wang and Jun Guan contributed equally to this work.

确认

这项研究是由中国国家科技重大项目(2018 zx10302206 - 003、2017 zx10202203 - 007,和2017年zx10202203 - 008),浙江卫生和计划生育研究项目(2016 kya162和2015 kya046),为肝脏疾病和重大科技项目研究基金的宁波。

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