缺血再灌注损伤后急性心肌梗死Spp1表达降低

摘要

背景．随着休克治疗的进展和血栓培训和经皮冠状动脉介入（PCI）的建立和促进（PCI），许多组织和器官已在缺血后再熔化，这可能导致含缺血再灌注损伤（IRI）的更差的障碍。已发现MRNA对通过各种机制进行缺血再灌注产生显着影响。鉴于MRNA从血液的可访问性，我们旨在发现mRNA和缺血再灌注之间的关联。方法．我们使用基因表达综合数据库(GEO)中的GSE83472数据集来寻找缺血-再灌注组织和对照组样本之间的差异RNA表达。此外，通过基因本体(GO)注释和京都基因和基因组百科全书(KEGG)路径分析，通过注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)，找到来自GSE83472的449个rna的生物学特性。此外，我们还利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)工具，对四个最重要的KEGG通路进行了进一步研究。此外，我们还构建了蛋白质相互作用(PPI)网络。最后，我们采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和western blotting检测并比较经皮冠状动脉介入治疗患者Spp1的表达。结果．生物信息学分析表明，SPP1是在缺血后再灌注的集线基因。QRT-PCR结果表明，与正常样品相比，PCI后，PCI在缺血再灌注细胞中，SPP1表达明显下调，如蛋白质印迹。结论．Spp1可能在缺血再灌注损伤后的急性心肌梗死中起重要作用。

1.介绍

心肌梗塞（MI）在世界各地的心脏血管事件中排名第一;冠状动脉血流的及时有效地回收是治疗缺血性心脏病的有效方法[1］.然而，血液再灌注过程可能导致心肌组织结构，能量代谢，电生理学和心功能损坏;这种现象称为心肌缺血再灌注[2］.潜在的机制是多种多样的。缺血组织中乳酸、质子和NAD+的积累导致ph值降低。H+离子被挤出，通过Na交换Na+⁺/小时⁺换热器。因此，细胞挤出Na⁺作为交换Ca²⁺的钠⁺/ Ca²⁺换热器。盈余Ca²⁺流入线粒体，可能激活CA.²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶病于病理学[3.］.最近的一项研究认为，IRI促进了促炎细胞因子的生产，并诱导展开蛋白质反应的促凋亡途径（UPR）[4.］.分泌的磷蛋白-1（SPP1）也称为骨桥蛋白（OPN），是由编码在人染色体4Q221上的SPPL基因分泌的蛋白质，其与包括C末端CD44V6结构域的许多粘附受体结合基序相互作用，并且凝血酶切割的N末端整合曲线结构域[5.］.最近的研究表明，SPP1是与肿瘤密切相关的细胞外基质蛋白，其在许多肿瘤中的高水平表达并参与调节肿瘤侵袭，转移，凋亡抑制和血管生成[6.］.在我们的研究中，我们从GSE83472数据集中鉴定了差异表达rna (de - rna)，我们发现Spp1是与IRI相关的候选rna。然后通过DAVID分析了特定生物过程的功能富集。为寻找与IRI相关的中枢基因，生成并测量了一个PPI网络。最后，我们验证了Spp1在PCI术后缺血-再灌注患者中的表达下调。

2.方法

2.1。数据下载和临床样本

GSE83472数据集http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[7.］.使用GSE83472数据集，包括8只小鼠SHAM (4 WT和4 AKIP_TG)和8只小鼠IR (4 WT和4 AKIP1_TG)，其中缺血/再灌注损伤，用于识别I/R损伤小鼠的差异基因表达。同时，我们收集了2018 - 2020年因急性心肌梗死接受经皮冠状动脉介入治疗的临床样本，其中男性9例，女性7例，平均年龄53.6±8.4岁。采集患者和健康人的全血样本。遵守中山大学、中山纪念医院(SYSEC-KY-KS-2021-070)伦理委员会的指导方针。

2.2。数据处理

我们使用R语言，应用R包“limma”处理GSE83472 RAW数据集( )．然后，我们根据标准基因表达值筛选出除RNA。此外，我们制造了对差异表达基因的火山曲线和热图和分析结果。

2.3。Go功能注释和Kegg途径浓缩分析

为了分析de - rna的GO项和在KEGG通路中的富集，我们使用DAVID揭示了de - rna的潜在功能和生物学特性 [8.］.

２.４.GESA

为了进一步研究，使用在线工具进行了GESA，该工具用于学习特定功能基因集的富集http://software.broadinstitute.org/gsea．C2（抑制）Kegg，C5（GO）细胞组分，C5（GO）生物过程和C5（GO）分子函数的基因组用于通过R包集群分析器找到DE-RNA的功能[9.］.

2．5．PPI网络建设

为了探索de - rna之间的关联，我们随后生成了PPI生物网络，并通过STRING数据库(https://string-db.org/)．此外，利用Cytoscape软件可视化交互作用，寻找功能网络中的hub基因[10.］.最后，通过MCODE方法验证了轮毂基因，使用细胞凋亡申请对基因进行评分并通过其得分构建网络[11.］.

2.6。存在分析

通过使用RNA转录试剂盒（中国生物技术，中国生物技术），通过逆转转录RNA来合成cDNA。表格中列入了前底漆和反向引物1．然后，我们使用SYBR Green Mix (Yeasen Biotech Co.， Ltd)对罗氏Real-Time PCR系统进行qRT-PCR。我们用2来计算RNA表达的倍数变化^-Δct.（2^{- [（基因的CT） - （U6的CT）]}）如前所述的方法[12.］.

2.7。Western Blotting Assay.

收集细胞，用RIPA缓冲液冰溶。然后，蛋白样品在10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE中分离，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上[13.］.转移后，我们用5%牛血清白蛋白(BSA)阻断PVDF膜。我们使用骨桥蛋白(osteopontin, Abcam, ab166709)和GAPDH (Cell Signaling Technology)作为一抗，在4℃下过夜孵育阻断膜，在室温下以山根过氧化物酶作为二抗。最后使用ECL检测试剂盒(Yeasen Biotech Co.， Ltd.)对样品进行检测[14.］.

2.8。统计分析

对于临床样本中的QRT-PCR，学生T.- 使用GraphPad 7.0执行。我们使用了R软件（https://www.r-project.org/）进行生物信息学分析。该值显示为平均值±标准偏差，然后使用双尾学生分析T.测试。一个认为<0.05的值表示统计学上显着差异。

结果

3.1。GSE83472数据集的生物信息分析

我们根据|Log2FC| > 1筛选de - rna，其中FC代表fold change，和值<0.05。随后，鉴定了221个上调的DE-RNA和318下调的DE-RNA。结果分别显示在火山图和热图中（图1（a）和1（b）)．为了识别目的基因的功能，我们利用DAVID进行GO注释和KEGG通路分析。前4个显著的GO项和KEGG通路如图所示1（c）-1（f）．生物学过程中显著富集的条目是凋亡过程的负调控(图)1（c）-1（f）)．最丰富的细胞成分是细胞质中的功能(图)1（d）)，蛋白质结合在分子功能中占主导地位(图1（e）)．

3.2。GSEA的丰富分析

进行GSEA以评估IR和NIR之间的GO基因集和Kegg信号通路基因集。Twenty signaling pathways were differentially enriched, among which the largest enrichment score (ES) was propanoate metabolism, valine, leucine, and isoleucine degradation, Parkinson’s disease, citrate cycle (TCA cycle), mitochondrial respiratory chain complex 1 biogenesis, mitochondrial respiratory chain complex assembly, fatty acid beta oxidation using acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial ATP synthesis coupled proton transport, NADH dehydrogenase complex, proton-transporting ATP synthase complex, respiratory chain, inner mitochondrial membrane protein complex, oxidoreductase activity acting on NADPH quinone or similar compound as the acceptor, acyl-CoA dehydrogenase activity, NAD-ADP ribosyl transferase activity, and oxidoreductase activity acting on NADPH (Figures2（a）和2（c）-2 (e))，负富集评分(NES)最大的是核糖体、nod样受体信号通路、DNA传感通路和致病途径大肠杆菌感染（图2（b）)．

3.3。SPP1被鉴定为与缺血，细胞损伤和炎症相关的枢纽基因

构建包括400个节点和具有关联置信度分数> 0.4的400个节点和2085个边缘的PPI网络，以通过串数据库区分539 de-RNA之间的连接。在由MCODE应用鉴定的26个基因内，SPP1基因具有高分（图3(一个))．如图所示，集线器基因网络和功能聚类指示SPP1作为与IRI相关的集线基因（图3 (b)和3 (c))．

3.4。在PCI后，SPP1在缺血再灌注样品中下调

我们通过QRT-PCR在整个血细胞中量化SPP1的表达水平（图4(一))．与对照相比，PCI后PCI后，PCI在缺血再灌注样品中的表达显着降低。蛋白质印迹结果表明蛋白质水平在缺血再灌注样品中SPP1表达的下调（图4 (b))．

4。讨论

缺血引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因，如心肌梗死和中风[15.］.MI可导致心力衰竭的逐渐发展、慢性缺血性心脏病、心肌缺血持续或反复加重的结果、严重冠状动脉粥样硬化性狭窄引起的缺氧[16.］.在粗糙的外观中，心脏壁的厚度可能是正常的，具有多焦点的白色纤维条带或透气疤痕。心内膜造型并失去其正常光泽，有时用壁画血栓。此外，MI可以诱导多焦点心肌纤维化和心肌纤维肥大。在缺血性疾病的救援和治疗过程中，科学家逐渐发现，对组织的主要病变不是缺血本身，但在血液供应恢复后，过量的自由基攻击这部分组织。这种现象称为缺血/再灌注损伤[17.］.

SPP1，称为骨桥蛋白，是细胞外基质蛋白[18.］.Spp1与IRI之间关系的研究较少。最近的一项研究表明，抑制Spp1表达可以抑制细胞增殖，这是一种潜在的癌症治疗靶点。此外，科学家发现，出生后抑制Spp1可以通过促进TGF-，减少DMD (Duchenne muscle dystrophy)小鼠的纤维化，促进运动功能β[19.］.此外，通过缺血诱导的SPP1表达的降低可能会损害新生血管，而SPP1的过表达可以增加血管生成[20.］.此外，Spp1作为缺血后新生血管的关键介质，将成为诱导血管新生的新靶点。形成新的侧支循环的能力与降低AMI和稳定型CAD患者的长期心脏死亡率密切相关[21.］.这些研究提供了我们探索SPP1和IRI之间的关系。

在本研究中，我们下载了GSE83472数据库进行差异分析。然后，将539个RNA被识别为DE-RNA，并用于通过串数据库构建PPI网络。获得400个节点和2085个边缘的网络进行进一步研究。根据GO / Keeg分析和GSEA，表示这些蛋白质主要位于细胞质中，并参与凋亡过程的负调节和运输。此外，我们通过Cytoskape的MCODE施用了26个枢纽基因，其中SPP1基因达到了高分。此外，集线器基因网络和功能集群建议SPP1和IRI之间的强大连接。最后，我们在临床样本中核实了我们的发现。Western印迹和QRT-PCR分析均显示IRI后急性心肌梗死样品中SPP1的下调，这可能表明SPP1和IRI之间的负相关性。总的来说，由于血清中的可用性，我们认为SPP1可能被视为IRI中的潜在诊断生物标志物，并且可以避免几种侵入性测试。

我们的研究仍有几个限制，例如由于数据集的尺寸小分析DE-RNA的可能偏差。同样，来自不同中心的更多血液样本可以帮助我们获得更准确的结果在体外实验。另一个限制是动物模型;我们没有建立合适的动物模型来验证Spp1水平体内．而且，需要相关的信号通路来检测揭示分子机制。简而言之，对基因的调节和潜在途径的研究不够复杂。如果条件允许，我们将专注于下游靶基因的调节和SPP1的潜在信号通路。

5。结论

我们的研究旨在通过Geo数据库的生物信息分析，GO / Keeg分析和GSEA阐明SPP1与IRI协会。此外，我们发现了SPP1的表达下调在体外qRT-PCR和western blotting分析。在大鼠心肌IRI模型中，生物信息学和基因表达谱整合显示Spp1作为与心肌IRI密切相关的hub基因，支持其在心肌IRI中发挥潜在作用。

数据可用性

所有用于支持本研究发现的数据集均可从相应作者处获得。

信息披露

凌丽和金康黄是一首第一名作者。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

凌丽和金康黄同等贡献了这项工作。

致谢

来自中国国家自然科学基金的青年计划的补助金支持这项工作（第81702618号）。

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