一种新型革兰阴性球菌引起的三匹年轻纯种马骨关节感染

摘要

我们在年轻的纯种马，其中致病微生物的鉴定通过MALDI-TOF作为描述3箱子骨关节感染（OAI）的Kingella物种．oai的模式类似于报告Kingella.人类感染。16S rRNA PCR的分析使能构建的系统发育树放置近距离的分离物Simonsiella.和Alysiella物种,而不是Kingella物种．新分离株与新分离株的平均核苷酸同源性(ANI)比较Kingella kingae和Alysiella菌但是发现概率低，新菌株属于这两种物种。该初步分析表明分离的生物体是先前未认识到的物种。

1.介绍

尽管进行了治疗，马的败血性关节炎仍有很高的死亡率(22-58%)[1-3.］.在存活者，残留损伤引起持续的骨关节炎和跛行是常见的并发症[4.那5.］.对于纯种马匹，与对照相比，脓肠梗关节炎与比赛中开始的可能性降低有关[6.］.败血症性关节炎发生在创伤后，特别是关节穿透性损伤，由连续的感染焦点传播，并通过血源性微生物播种[1那4.那7.］.后者可以是从感染的远程站点，但有可能通过有症状或无症状的菌血症发生在许多个体[1那3.那4.那8.］.细菌引起的确认是通过正显微镜，与滑液（SF）的培养物或滑膜组织[一起9.］.33-60%的病例SF细菌培养阴性[1那3.那10那11］.

未检测到的细菌可能会造成马OAI但是，如果感染的病因是原因，非细菌性原因也可以解释这些案件与细菌培养阴性和PCR结果的百分比。或者，非感染性病因可能为感染剂负面研究的原因。我们提出三（3）情况下的OAI在年轻马科动物，其中细菌，先前未描述，由骨，滑膜组织和提交培养滑液（SF）中分离，并讨论马科动物的相关性，OAI。

2.情况下

三种情况的详细情况见补充表1．具体的附加信息如下。对于所有病例，微生物检测和结果将分别进行讨论，并在补充表中列出1．在发生案例1和3的农场之间存在超过80公里的距离。案例2和其他两个农场的位置之间有超过300公里的距离。任何农场的任何马匹和人员都没有已知的联系。

案例1是一匹纯种小母马，15个月大，居住在澳大利亚新南威尔士州猎人谷，2012年11月右前腿进行性跛行，持续时间为2周。到达时，马明亮而机敏，右前腿严重跛行，除发热(38.9°C)外，生命体征正常，没有其他确定的感染焦点。直接触诊右前肩区肿胀及明显疼痛，包括二头囊。肩部x线检查未见明显异常。超声检查显示二头囊内有大量回声肿块，很可能是纤维性物质，但仅有少量滑膜液。肱骨中间结节的远端不正常，失去了正常的平滑轮廓。尝试从二头囊抽吸滑膜液失败，但从肩关节成功抽吸滑膜液。结果在补充表中列出1．

马进行了全身麻醉，并对右肩关节和二头囊进行了内窥镜观察。从滑囊和关节收集滑膜液并送去培养。内窥镜检查显示肩关节滑膜外观正常，但二头囊中有大量游离粘连的纤维蛋白，取下进行培养。中间结节远端有一区域(12mm × 15mm)，无纤维软骨，探查时柔软。将该区域清除为正常软骨下组织，并将该组织送去进行培养。二头粘液囊的滑膜活检组织病理学诊断为亚急性化脓性增生性滑膜炎，显微镜下未发现细菌。抗菌素治疗列于补充表1．6周后在术后该驹的声音在小跑。马比赛之后（和放置）为两岁，是，随后在三四肢岁，在省维多利亚多个分站冠军，并在大都市维多利亚置于多次。从这个马的母亲外的其他后代已经多次赌注的赢家。

案例2是一匹7个月大的纯种马，居住在新南威尔士州南部高地地区，2013年8月出现左前腿跛行，持续时间不确定。尽管用强力霉素治疗了72小时，跛行继续，马被转到进一步评估和可能的手术。到达时，这匹马明亮而机敏，左前腿严重跛行，生命体征正常，没有其他确定的感染焦点。内侧夹板骨近轴向触诊有肿胀和剧烈疼痛。x线投影显示左侧第三掌骨掌内侧中近端骨干皮质的皮质骨吸收灶。第二和第三掌骨间骨内韧带附着区域出现骨透明(2mm × 14mm)。超声显示McIII浅层皮质明显骨缺损，与x线片所见的透析度相当。血液异常轻微(见补充表)1）。在手术探查McIII骨的小坏死脱落碎片升高，然后取出并提交微生物。抗微生物处理用阿米卡星放置在骨缺损，头孢曲松（区域肢体灌注），普鲁卡因青霉素G，庆大霉素，并由此口服甲氧苄啶/七天硫珠。6周后手术，跛行及疼痛消失。菲伊屏障试用一次在国家维多利亚和被卖和澳大利亚的出口出来。

案例3是一只未断奶的纯种马，三个月大，居住在澳大利亚新南威尔士州猎人谷，2016年12月出现严重跛行和左后指屈肌腱鞘积液。很少有其他临床细节可用。左后卵球和黏液的x光片正常。在全身麻醉下，关节镜下灌洗肌腱鞘并去除大量纤维蛋白。滑膜液混浊，蛋白和细胞计数异常。抗菌素治疗见补充表1．在手术后的第6天，这匹马被送回了它的家庭农场，散步时声音很好，但没有其他的临床细节。这匹马随后在两岁时参加了比赛，在新南威尔士州(NSW)进行了障碍测试，但随后在新南威尔士州和昆士兰州地区的16场比赛中被淘汰。这匹马的母亲的其他后代要么是没有比赛的，要么是没有位置的。

3.方法

病例1和3在手术采集时，滑膜液可接种到Oxoid Signal血液培养瓶(BCB) (Provet Vi, Sydney, NSW, Australia)，但病例2无法接种。其他可用于培养的样本包括病例1和病例3的灌洗液中的纤维蛋白和病例2的碎骨。病例1和3的所有采集样本，包括接种的bcb，均在采集后30分钟内于同一天送到实验室，病例2的样本在采集后6小时内送到实验室。根据制造商的建议(澳大利亚阿德莱德的赛默费雪科学公司)，所有采集后的样品一到达实验室，就立即接种哥伦比亚羊血琼脂和巧克力琼脂(均为bioMerieux公司，澳大利亚)和熟肉浓缩培养基(CMM)。培养基培养条件为需氧(35°C±2°C, 5%二氧化碳气氛)和厌氧(35°C±2°C, 10%二氧化碳气氛)。在36小时读取培养皿，然后重新孵育5天，每24小时检查一次生长，除了厌氧培养皿，每48小时检查一次，持续5天。CMM孵育至阳性，并每天检查浊度的视觉迹象，然后传代，如果浊度，采用与初始样品上的培养相同的方式。为进行鉴定，分离菌株被视为该菌株的成员奈瑟氏菌科和HACEK组的基于初始形态特征。HACEK代表一组是正常的人类菌群的一部分革兰氏阴性菌（GNB）的：嗜血杆菌属，放线菌聚集菌属，人心杆菌属，艾肯菌属,Kingella物种．这些生物体可以很容易地被商业系统识别，如API NH和VITEK 2 (bioMérieux, Marcy-l 'Etoile，法国)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱[12-15］.最初分离株(病例1分离株1)在重复传代培养后未能繁殖，但分离株2和分离株3(分别来自病例2和病例3)在添加的哥伦比亚马血琼脂上重复传代培养后存活[16在5%的二氧化碳大气中。这些分离菌被送到圣伦纳德的实验室进行了比最初分离细菌的实验室更广泛的测试。分离株2和3(来自病例2和3)储存在−70℃的15%甘油培养基中，在那里他们被回收以进行更广泛的测试。

为隔离2和3.，运动性研究是按照已公开的方法进行[17.那18.］.细菌在营养肉汤中乳化，使其生长15-25℃和37℃和肉汤之间2-24小时的时间间隔（4，8，24小时）进行检查。细菌悬浮液一滴放置到盖上盖玻片的滑动和使用相差显微镜检查。使用，并且传播ATCC控制由ATCC细菌培养导向描述19.]，而Garitty等人。[20.)是:阴沟肠杆菌，铜绿假单胞菌写明ATCC 27853(正面);肺炎克雷伯菌ATCC 13882（负）;和Kingella kingaeATCC 23330（随着IV型Pilus的延伸和缩回而发生的抽搐运动）。

在哥伦比亚马血琼脂(Oxoid)上孵育36小时后对传代进行生化试验[16］.对分离株1进行了有限的试验，因为它不能在重复的传代培养中存活。对于分离株2和3，使用了以下几个版本:ID32 STAPH版本3,API STAPH版本5，快速ID32 STREP版本4,API 20 STREP版本8,API 20NE版本7,Vitek 2版本8 (bioMerieux, Marcy l 'Etoile，法国);和rapidnh系统(Thermo Fisher Scientific, Adelaide, Australia)，遵循制造商的说明。

MALDI-TOF分析是由bioMerieux MALDI-TOF v2.0在最初分离的实验室对所有三个分离株进行的。对于分离株2和3,Bruker MALDI Biotyper Compass IVD Version 3 (Bruker Daltonik，不莱梅，德国)对这两个分离株的检测与已知的ATCC生物平行，重复，以验证MALDI- tof和Vitek系统在属和种水平上的结果。这些都是淋球菌5239年(ACM),moraxella catarrhalis.（ATCC 25238），嗜血杆菌流感(ATCC 49766和NCTC 8468)，Aggregatibacter aphrophilus(写明ATCC 7901),Kingella denitrificans(写明ATCC 33394),Eikenella corrodens(写明ATCC BAA115),Kingella kingae(写明ATCC 23330)。

药敏测试执行(AST)根据盘CLSI指南方法使用穆勒辛顿血去纤维蛋白的马血琼脂(尼古拉斯)和5% (bioMerieux),孵化在5%二氧化碳35°C为24 - 48小时,按照CLSI AST细菌分离方法从动物(2013、2015)21.那22.]和人类[23.-25.］.在该琼脂上观察到的生长情况较差，但分离株在其他任何AST琼脂上都不能生长。MHA上没有生长，也没有血液。由于没有关于动物或马体内这种微生物的兽医指南，我们使用CLSI指南放线杆菌或Enterobacteriales[21.那22.］.beta -内酰胺酶检测使用青霉素(1单位)抗生素盘(Oxoid，澳大利亚)，Remel™硝基苯胺盘(Thermo Fisher, Adelaide，澳大利亚)，BD BBL™头孢酶盘进行检测淋病奈瑟菌，葡萄球菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌，肠球菌和厌氧细菌的生产β- 酰胺酶。我们还使用了内部TGA分类1 IVDβ-内酰胺酶培养方法，适应“GOTS测试”[26.］.它是一种的Mueller Hinton II琼脂平板（BBL）含有青霉素和悬架的S.金黄色葡萄球菌(1 - 2麦克法兰标准)。在培养皿中播种青霉素敏感菌S.金黄色葡萄球菌（ATCC 25992，青霉素MIC = 0.025mg / L）并含有在内部制备的MIC（0.028mg / L）上方的青霉素浓度。菌株生产β-内酰胺酶，当复制到平板上时，将使青霉素失活，并允许种子菌株作为接种物周围的一个区域生长。青霉素浓度≤0.028 mg/L时，任何生物均不能在培养皿上生长。用于“Gots测试”的质量控制有机体是金黄色葡萄球菌ATCC 29213(增长为正β-内酰胺酶产量)和ATCC 25993(无生长，为阴性ββ-内酰胺酶的生产）。

对扫描电镜(SEM)，从肉汤中提取的细胞在PBS中洗涤两次，漩涡，并加入聚赖氨酸涂层玻璃盖，在室温下粘贴30分钟。然后在4°C的PBS中用5%戊二醛固定过夜。除去戊二醛，用PBS洗涤5次，然后用20%、30%、50%、70%、80%、90%和95%的分级乙醇系列脱水，各15分钟。随后在100%乙醇中进行两次20分钟的交换，在2:1乙醇:六甲基二硅氮烷(HMDS)中进行一次20分钟的交换，在1:2乙醇:HMDS中进行一次20分钟的交换，在100% HMDS中进行两次20分钟的交换。最后交换后，样品在干燥室中完全干燥至少48小时。将样品安装在样品根上，在约5 nm金/钯包覆，在5 kV加速电压下，在Zeiss Supra 55VP场发射扫描电子显微镜上进行成像。

16S rRNA基因分析最初分离上1，它可能不会传播，但材料是可从初始培养进行。因此，16S rRNA基因的片段使用两个重简并正向引物27F-CM（F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，其中M是A或C）和反向引物1492R（R 5'-TACCTTGTTACGACTT），描述进行扩增由Frank等人。[27.］.

隔离2和3.可以在传代培养中繁殖。从分离株的纯培养中提取DNA。每一分离物共2 ml液体培养液离心，并结合打珠(5.5 ms)提取DNA^-1for 30 s) and the Qiagen AllPrep kit (Qiagen, CA, USA). Two sets of primers were used to amplify segments of two domains of the 16S rRNA. Set A consisted of a universal 1020 base pair (bp) 16S rRNA bacterial primers (Domain III): F 5′-GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′ and R 5′-CTG ATC CGC GAT TAC TAG CGA TTC-3′ [28.］.Set B consisted of 490 bp partial sequence of the 16S rRNA gene (Domain I): F 5′-CCT AAC ACA TGC AAG TCG ARCG-3′ and R 5′-CGT ATT ACC GCG GCT GCT-3′ [29.］.这些都是used to amplify this gene using 10 ng of genomic DNA isolated from each strain. 16S rRNA phylogeny based classification was carried out by comparison of the highly conserved 16S rRNA which is part of a small subunit ubiquitously present in the ribosomes of all prokaryotes. Samples were extracted using Qiagen semi-automated BioRobot® (M48) system (Qiagen, CA, USA). Once amplification was complete, PCR products were quantified via electrophoresis (Biorad) and visualized on a Sigma 4% agarose gel stained with ethidium bromide using 1× TBE (0.089 M Tris borate, pH 8.3 containing 2 mN EDTA) buffer system against a molecular ruler. Gel loading buffer contains 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, and 40% sucrose. Ethidium bromide (0.5 µg/mL)，以方便在紫外光下观察条带，并确认1020碱基对(bp)和490 bp带的存在。利用QIAquick PCR纯化试剂盒协议从PCR和其他酶反应中纯化单链或双链DNA片段。从490到1020 bp的片段从引物、核苷酸、聚合酶和盐中纯化，制备用于测序的扩增产物。Sanger序列使用ABI Science PRISM/Hitachi(3135型)PRISM基因分析仪(Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, Foster City, Foster City, California, USA)的Bigdye终止序列仪生成。分离株2和3的Sanger序列在NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/）在针对识别其他的16S rRNA的参考数据库。进化分析在Mega X中进行[30.]，采用Tamura和Nei的最大综合似然法[31.］.分离株2和分离株3获得了相同的结果(补充图)5.）。

使用ANIb方法与JSpecies计算基因组平均核苷酸特性[32.那33.］.按照Varghese等人的描述，使用蛋白质编码基因计算全基因组平均核苷酸身份(gANI)、比对片段(AF)和种内概率[34.］.DNA-DNA杂交是利用来自基因组距离计算器(Genome-to-Genome Distance Calculator)的恒等/HSP长度公式估算的。33.］.

结果

三例均为阳性培养，仅从CMM获得。培养至阳性时间为4-5天(见补充表)1）。

在这里，我们报告的特点隔离1(来自案例1)分开，因为它无法在重复的传代培养中存活，无法进行更详细的测试。分离株1的革兰氏染色形态为革兰氏阴性球菌(GNCB)，呈短链、成对和长链出现。菌落形态小，呈灰色至透明菌落，在羊血琼脂上显示-溶血。API NH Version 3 (bioMerieux，法国)对葡萄糖、果糖、蔗糖和碱性磷酸酶(Code 3120)产生了阳性反应，并鉴定了一种嗜血杆菌paragallinarum (Hp)．未对分离株1进行Vitek检测，因其不能在重复继代培养中繁殖。bioMerieux MALDI-TOF v2.0获得了分离株1Kingella kingae信心水平为99.9%。

克染色形态隔离2和3.是相同的存在革兰氏阴性COCCO杆菌（GNCB）出现在短，对和长链，但没有的典型形态学特征金氏，Simonsiella,Alysiella(补充图1）。马分离株的个体细胞宽（6.9-7.3 µ米），中等长度（1.0-1.2 µM)，相对卵形，附着形成8-12个或更多细胞长的花丝。这些长链与常见的特征链有相似之处Simonsiella.和Alysiella品种，以及偶尔看到一些莫拉物种，但都不像典型的革兰氏染色外观Kingella kingae[13］.

菌落形态的隔离2和3.是相同的存在细小的灰色到清晰的菌落，表现出对羊的β-溶血并补充哥伦比亚马血琼脂[16］.盘子有一种独特的“漂白剂”气味，类似于HACEK组的其他生物。孵育24小时，菌落外观光滑，琼脂轻度麻点，48小时出现扩散区(“煎蛋”样)(附图)2）。Optimal growth was at 37 ± 2°C, with 5% CO₂在有氧条件下，也有生长，尽管不那么丰富，在10-15%二氧化碳富集的厌氧条件下。麦康凯琼脂上无生长(补充表)2）。分离株2和3都表现出抽搐的运动。

这两个隔离2和3.被氧化酶阳性，与过氧化氢酶，superoxol阴性结果（3％，10％，和30％）和硝酸盐还原成亚硝酸盐。对于这两种菌株2分3的结果为专有的测试是：ID32葡萄球菌版本3（ARGA和PAL阳性），API葡萄球菌版本5（葡萄糖，果糖和PAL阳性），快速ID 32 STREP版本4（ADH，PAL，RIB，SAC正），API 20 STREP版本8（PAL＆LAP阳性）;API 20NE版本7和RapidID NH系统既产生仅用于葡萄糖和氧化酶为阳性反应。对于这两种菌株2和3，维特克2系统（梅里埃，马西l'Etoile广场，法国），得到低辨别标识（“禁忌biopatterns”）。生物体测试了正面对ARGA和的leuA。标识如甲基杆菌种，灰奈瑟菌(ProA 99%)和莫拉（奈瑟菌）绵羊(没有_3.99%， PheA 92%， ArgA 1%)也属于低歧视。

补充表2显示所选择的表型结果隔离2和3.（相同的结果）与其他革兰氏阴性生物的结果相比，包括Kingella kingae．

不同设备的MALDI-TOF鉴定结果不一致。bioMerieux MALDI-TOF v2.0产生了鉴定隔离2和3.的Kingella kingae信心水平为99.9%。从Bruker MALDI-TOF检测结果为2株和3株克雷伯氏菌aerogenes（得分1.62）随后Kingella kingae为下一个最高等级分数（1.55），在三次重复测试。

对于SEM，从补充图3，可以看出，隔离2和3.从不同Kingella kingae控制 （Kingella kingae， ATCC 23330)，更像球茎而不是杆状。突出的外膜泡(OMVs)清晰可见。图像与发表的SEM图像不相似Simonsiella.或Alysiella[13］.

抗微生物易感性测试结果是在补充表中提供的1．值得注意的是，一个分离物β-内酰胺酶阳性（分离2）。隔离2，检测呈阳性β-内酰胺酶使用Remel™Nitrocefin和Cefinase™光盘以及方法中描述的“Gots测试”方法。隔离1，在上述所有上述测试中测试了负面β内酰胺酶的方法。

的16S rRNA分析，隔离1(M12-17630)，使用引物如Frank et al. [27.，尽管在属水平上有极好的分辨率(100%同源性)，但不能分离Kingella kingae和Kingella denitrificans，在隔离1和这些之间注意到一些分歧（96％的同源性）Kingella.物种。该菌株的Genbank登录号为KR494280(见补充图)4.）。

的16S rRNA分析，分离出1、2、和3.，使用引物按照参考文献[28.那29.[生成在补充图中提供的系统发育树5.．分离株1、2和3似乎是相同的。

全基因组比较隔离2和3.亲缘关系密切的类型菌株Alysiella菌和Kingella kingae使用ANIb方法揭示的76.60和76.44％，平均核苷酸同一性分别[35.］.这些数值远低于普遍接受的物种阈值95-96% ANI [36.］.进一步使用全基因组平均核苷酸识别(ANI)方法进行分析，得到的最大gANI/AF值为77.77%/0.54Alysiella菌/ 0.52和77.61%Kingella kingae．在这两种比较中，这等于新分离的马属于这两个物种中的任何一个的概率<1.0e-06 [34.］.最后，计算在硅DNA-DNA杂交(dDDH)中产生的基因组-基因组距离(Genome-to-Genome Distance)值远低于用于区分物种的>70%阈值[35.］.分离物3与Alysiella菌和Kingella kingae基因组dDDH值分别为25.3%±2.4%和23.4%±2.4%。同样，这些值等同于非常低的概率(≤0.01%)，实验DNA-DNA杂交比较将超过70%的物种阈值。

5.讨论

我们描述了来自于澳大利亚新南威尔士州不同地区的三位年轻的纯种马一种新型细菌的分离。革兰氏染色形态呈革兰氏阴性COCCO杆菌（GNCB）出现在对和在链，但没有的典型形态学特征金氏，Simonsiella,Alysiella．

表型试验提供了相互矛盾的结果。我们的孤立体表现出独特的特征，但大多数都很相似Kingella物种,而不是Simonsiella.，虽然我们的分离株对过氧化氢酶和过氧酚(3%、10%和30%)呈阴性，但硝酸盐还原为亚硝酸盐(Simonsiella.和Alysiella对过氧化度酶呈阳性，Alysiella为硝酸盐/亚硝酸盐阴性)，麦芽糖(Simonsiella.和Kingella kingae为阳性)，碱性磷酸酶(Simonsiella.是消极的，Kingella kingae是积极的)。就像我们的马一样，Kingella kingae也是非含量的，并且表现出阳性氧化酶活性，阴性过氧化氢酶反应，并从葡萄糖和麦芽糖中产生酸，而不是来自其他糖，参见补充表2．

不同设备的MALDI-TOF也给出了相互矛盾的结果。细菌的鉴定为Kingella kingae通过生物梅里埃公司MALDI-TOF至99.9％的所有3株的水平。然而，在分离物2和3使用布鲁克MALDI Biotyper指南针IVD版本3，用1.55最佳匹配得分值没有获得可靠的识别。

基于16S rRNA分析，系统进化树显示分离出1、2、和3.是最密切相关的Kingella kingae但平均核特征（ANI）低于89％。通过进一步的16S rRNA基因序列分析，使用Mega-x相邻的接合方法使用来自1000棵树的Kimura相关性和自举加法值的Mega-x相邻的接合方法构建系统和动物来源的系统。任何一个奈瑟氏种或邻近的Simonsiella Muelleri，Alysiella Crassa或Kingella kingae(补充数据4.和5.）。

利用特异性PCR诊断人类OAI，Kingella kingae被发现是6个月至5岁儿童感染性关节炎的最常见原因，导致83例已证实的OAI病例的53% [37.］.在马中，尽管努力改进感染性关节炎中细菌病原体的检测，优化培养和使用16S rRNA实时PCR，但在近60%的病例中，没有发现病原体[38.］.在该研究中，SF收集到无菌的血清收集管和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。血琼脂平板上直接接种，并在35℃温育48小时（两个有氧和无氧）。对于富集，TSB是在有氧条件下在35下温育℃下72小时，然后传代培养到血琼脂24,48，72小时进一步孵育后。38个样品中，18（38％）培养阳性。一（1）样品，得到混合生长。18个阳性培养物，从该富集培养物获得7（39％）。细菌从7/28（25％）SF样品中分离来自已知具有比5/13（38％）样品收集之前接收到的抗菌治疗21只马匹没有收到抗微生物剂。两（2）大多数公共从SF样品培养的生物体是放线杆菌equuli(6)隔离,金黄色葡萄球菌（5），其余部分由凝固酶阴性组成葡萄球菌sp。（2），和一（1）下列各：沙门氏菌属，阴沟肠杆菌，肠杆菌，肠球菌sp。铜绿假单胞菌，动物链球菌．RT-PCR未能检测到3/18（17％）培养阳性，但在4/30（13％）培养阴性样品阳性。作者没有注意，但是，这产生了一些扩增子都不在他们的参考数据库。

流行病学，微生物学，临床表现或管理没有数据Kingella.感染的马匹。唯一的其他动物隔离Kingella.是金氏POTUS因动物园管理员被金龟咬伤而被隔离(POTUS黄曲霉) [39.］.分类学上,Kingella.物种属于这一目neisseriales.和被修补的家庭奈瑟氏菌科，它包括属阿利氏菌，伯格氏菌，孔虫菌，艾肯氏菌，金氏菌，奈瑟氏菌，西蒙氏菌，Stenoxybacter, Uruburuella和透明颤菌、奈瑟氏菌属作为科的模式属的[40］.所有的物种都是专性的与宿主相关的生物透明颤，这可能是自由生活。革兰氏染色显示该家族大多数成员呈球菌状、球菌状或杆状，呈单细胞、成对、团块或短链，Alysiella和Simonsiella.可形成8个或更多细胞链。鞭毛没有，但可能有滑行或抽搐运动[40］.革兰氏染色外观(补充图)1)更类似于一些莫拉菌种，而不是Kingella, Alysiella或Simonsiella.中，具有后两个特性的形态。

从羊的口腔中分离了一种新的物种形成革兰氏阴性球菌的长链和，虽然最初分类为Alysiella后来被重新分类为一新种莫拉克斯氏菌属（莫拉矩），基于16S rRNA基因序列，脂肪酸组成，醌系统的分析和生化试验[41］.虽然SEM外观相似，但没有生化检查(补充表)1）NOR 16S RRNA基因序列分析（补充数据4.和5.)表明我们的孤立与莫拉克斯氏菌属包括莫拉矩．

Simonsiella.物种是各种温血脊椎动物的正常口腔菌群，但是Simonsiella.物种仅从有限数量的动物中分离出来：人类（美国muelleri）， 猫 （Simonsiella sp。)、狗(美国steedae)、豚鼠、兔子及绵羊(美国菌) [42］.然而，只有三(3)种被有效描述(S. muelleri，S. steedae,美国菌)以致伯吉在《古生菌与细菌分类学手册》中建议:Alysiella已从许多动物的口腔中的报道，但该生物体只被从牛，豚鼠和羊的嘴分离，用已经详细描述从绵羊仅仅是几个分离物” [13］.属Alysiella最初只包含一个物种从羊口（隔离Alysiella filiformis)，但之前命名Simonsiella菌（来自绵羊）已被重新分类给属Alysiella菌基于16S rRNA测序[43］.虽然没有任何的隔离报告Simonsiella.或Alysiella从马的物种，几乎在一百年前，西蒙斯报告了出现Simonsiella.从马[口服样品的显微镜样生物体44］.Simonsiella.和Alysiella被视为在免疫活性宿主非致病性[42］.我们的分离株不表现出典型的Alysiella或Simonsiella.．

骑士团成员neisseriales.（包含一个家庭 -奈瑟氏菌科)没有特定的可区分的生化、表型或分子特征。成员可以通过比较一些广泛分布的蛋白的保守签名索引(CSIs)来区分奈瑟氏菌科[40］.枝1包含属Eikenella Kingella,脑膜炎,Simonsiella.-专性宿主相关生物，没有鞭毛，形态各异[40］.

经过手术和抗生素治疗，所有的马似乎都完全康复了。由于影响跑道性能的变量很多，因此很难确定感染对跑道性能的影响。在儿童中，OAI是由Kingella kingae可能遵循一个相对良性的过程，通常在没有抗生素治疗或任何干预的情况下痊愈[45］.

需要进一步分析来确定这种潜在的新物种的分类。直到更多分离株和临床案例材料可用，AST的准则应遵循已发表的兽医CLSI指南，因为目前有关于AST的信息不足，则可从替代兽源获得的标牌孤立。

到所有三个分离物进行了测试，发现为敏感的唯一抗生素头孢噻呋和四环素。耐复方新诺明表现在隔离1，并且对青霉素，氨苄青霉素和在隔离2.庆大霉素事实上，接收情况2仅一个肠胃外抗生素，其分离2易患（由区域肢体灌注给出头孢曲松）。两个菌株进行了测试，以氟喹诺酮类，发现是敏感。虽然所有的情况下出现了全面复苏，在疑似马治疗OAI的经验性抗生素治疗由这种微生物引起的应该包括两种第三代头孢菌素，四环素，或氟喹诺酮类，直到进一步的数据可用。

感染这种微生物的流行病学意义尚待确定，但它在年轻马中的发生可能表明流行病学与Kingella kingae人类感染。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

概念，Bernard J. Hudson, Christopher B. O’sullivan, Angus R. Adkins, Ian G. Charles and Catherine Chicken Methodology, Kristen H. Todhunter, Angela P. Begg, Anna Blishen, Katerina Mitsakos, Leonie Chan Software, Bernard J. Hudson, Brendon A. O’rourke, Leonie Chan and Katerina Mitsakos Validation，调查，Bernard J. Hudson, Catherine Chicken, Angela P. Begg, Kristen H. Todhunter, Benjamin Raymond, Angus R. Adkins, Steven P. Djordjevic, Ian G. Charles, Christopher B. O 'Sullivan，Andrew Edgar and Katerina Mitsakos Resources, Bernard J. Hudson Data curser, Katerina Mitsakos and Leonie Chan Writing - Original Draft Preparation, Bernard J. Hudson Writing - Review & Editing, Bernard J. Hudson, Katerina Mitsakos Visualization, Bernard J. Hudson, Catherine ChickenBernard J. Hudson和Katerina Mitsakos项目管理，Bernard J. Hudson和Katerina Mitsakos资金获取，Bernard J. Hudson。

补充材料

表1：三例感染骨关节引起的可能的新种临床和实验室的功能。表2：表型和新分离物的生化特性（一个或多个）与金氏kingae，莫拉菌属矩，牛摩拉克氏菌，和丝状Alysiella相比（2＆3）。图1a：新颖马细菌分离的革兰氏染色。图1b：新颖马细菌分离的革兰氏染色。图2a：新颖马细菌分离株与β-溶血，灰色半透明菌落显示在马血琼脂[16]在5％28 CO中在36°C孵育24小时后₂．图2b:哥伦比亚马血琼脂上显示的具有“煎蛋”外观的新型马细菌分离物[16]后72小时的温育在36℃。图3a：扫描电子显微镜新颖马细菌分离株的（SEM）中，用金氏kingae比较。新颖马分离物比棒状更球菌。突出外膜囊泡（OMV的）被清楚地看到。图3b：在链新颖马细菌分离物。Figure 3c: novel equine bacterial isolate dimensions (1143 nm × 732.8 nm). Figure 3d: novel equine bacterial isolate dimensions (1143 nm × 732.8 nm). Figure 4: 16S rRNA analysis, for Isolates 1 [27.];分子系统树的最大似然Bootstrap方法概述基于田村-NEI模型进化史[31.那40］.图5分离株2和3的16S rRNA分析[28.那29.];分子系统树的最大似然Bootstrap方法概述基于田村-NEI模型进化史[31.那40］.（补充材料）

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