胎儿大鼠外植体微观图像肺分支形态发生的自动图像分析

摘要

背景。调节胎儿肺大鼠外植体的分枝形态发生机制是分子研究的必要工具。这项工作提出了一种新的方法，可以在微观图像中准确地量化肺癌植物的上皮，外轮廓和外周气道芽。方法。使用基于熵最大化标准自动计算的自适应和多尺度阈值算法来定义外轮廓。内部肺上皮通过根据最小描述长度原理和局部统计特性组分组小图像区域的聚类程序定义。最后，将外周血芽的数量计数为骨骼分支从肺内膜骨骼上皮的骨架图像的末端。结果。与手动方法相比，肺部分支形态分析的时间较为降低98％。在细胞发育的前两天获得最佳结果，标准偏差较小。在所有培养日内，自动和手动之间发现了不显着的差异。结论。该方法具有直观、准确等优点，适用于不同光照特征的图像，可以对不同研究人员进行可靠的比较。

1.导言

分枝形态发生结果对体内的分支结构产生，是几种器官开发和生长的关键和基本特征，如肺，胰腺，唾液腺，乳腺，肾脏和前列腺[1-3.］．体外生长的胎儿大鼠外植体的肺部分枝形态发生（LBM）是分子和细胞发育机制研究的重要工具。这种方法已经广泛研究，在不同妊娠期和体外的不同妊娠期，由于其稳定性和多功能性，在许多研究中心中4.-7.］．

通常，LBM分析涉及肺癌的形态学分析，在5天期间，使用24小时间隔获得的立体显微镜图像。每天，通过量化分支周长，面积，外轮廓和外围气道芽的数量来综合对胚胎肺的分支模式。

尽管在过去的十年中，在了解肺发育的遗传控制方面取得了重大进展，但据我们所知，所有LBM研究仍然是通过使用通用2D曲线软件进行手动图像量化来完成的。LBM分析仍然是一个耗时的过程，取决于研究人员的专业知识和容易出错的因素。通常，由于测量的模糊性和不准确性，它会阻止不同研究者之间的生物学结果比较，从而推导出生物学验证和定理[8.］．因此，除了生物研究领域提出的不同图像处理方法外[9.-18]，这些工作都没有应用于LBM分析，这使得我们无法讨论处理相同问题的最先进技术。

考虑到文献陷阱，我们提出了一种能够自动执行LBM形态学分析的新方法，以便减少甚至消除研究人员的依赖，提供快速，强大，用户无关和准确的结果。

2.方法

所有方法都是使用C ++，ITK（分段和注册工具包）和VTK（可视化工具包）开发的。RGB图像是在葡萄牙Minho大学卫生科学学院的生命和健康科学研究所（ICVS）中获得的，使用立体声显微镜（Olympus SZX16）。每个CT切片都有像素，像素分辨率为40 μm。所有图像都被收购放大。

根据生物实验室试验，可以在不同颜色条件下获得LBM图像（图中的示例1（a）和1（b）)．在这项工作中提供的计算机应用程序进行了测试并验证了这两种图像。分割过程假设要分段的感兴趣区域是先前从输入图像计算的一个或多个小原始区域的联合。在这种程度上，自动计算不同的种子并置于肺上皮内，允许多线程簇生长。

2.1. 预处理滤波

RGB输入图像首先通过平均和规范化三色分量转换为灰度值。然后，将灰度图像输入各向异性扩散算法[19，以减少破坏图像的噪声点。

该算法取决于三个参数（经验定义）：迭代次数，边缘参数（)和边停止扩散函数，根据Tukey的功能：或那. 各向异性扩散算法作为低通滤波器用于降噪，但保留了更清晰的边界和图像轮廓，从而产生输出图像强度的均匀性（图2（a）和2（b）)．

该结果用于自动分割（1）肺外甲膜对象的外部轮廓，并通过根据图像分配合并不同的簇来通过合并不同的簇来进行（2）内膜内膜。

2.2。肺部外壳外轮廓

自适应和多尺度阈值技术用于从背景中完成整个肺部消除症物体的分割。

最初，自动计算最大化分段对象（肺部外植物）和其背景之间的图像熵的全局阈值。为此，考虑一个图像和像素,为图像在位置的强度（)， IMin和IMax分别为0和255。此外,考虑作为阈值算法的结果，阈值级别为那作为对象的熵那作为背景的熵,作为总熵()．从imin到imax，值由强度决定最大化．

尽管这个全局阈值在所有具有图像属性的肺物体中产生合适的轮廓，如图所示1（a），它在数字上失败1（b）由于违规，对比度变异性小，外轮廓歧义。

因此，对于这种图像，初始外部轮廓被重新定义为以下步骤：(一)计算初始二进制对象及其质心（在图中3（b）)完成；(b)用起源测定不同线（斜坡从0°递增到360°，完成45°）;(c)让为总行数(）;计算距离(那）在原始点和与初始轮廓相交的原点之间（那）;(d)确定距离平均值；它定义了半径的圆圈和中心；(e)每一点对应于半径的新圆的中心使用相同的熵最大化准则自动确定局部阈值水平；(f)不位于圆心为的任何圆内的所有像素的阈值，采用b样条逼近方法平滑插值[20.];（G）得到的二进制图像允许确定整个肺对象的ISO轮廓;此轮廓后来平滑，高斯分布产生缩小效果（图3（c）)．

２.３.上皮分割

2.3.1。图像分割

滤波图像的图像梯度幅度被输入到算法，该算法将输入图像划分为小区域。数字4(一)显示了不同区域如何通过起点进行标记（红色，图1）4(一))，并沿流线方向，流线方向为局部强度最小的梯度。最小梯度(绿色，图4(一)）每个像素的路径通过递归选择一个像素来跟踪输入图像在8连接的邻居（黄色，图4(一))．如果多个像素存在，发现的最后一个像素是考虑的作为参考像素。每个像素沿路径标记为梯度幅值的局部最小值，并指定一个不同的标签。

最后，将整个图像划分为原始区域。每个区域都有相同的统计性质，边界与梯度量级表面的脊重合(图)4(一)和4 (b))．

2.3.2。集群区域

创造种子．图像分区包含一组非传递区域。虽然具有对应于重要对象的边界的区域边界的概率随着过度划分而增加，但它也可以创造许多微不足道的边界。该阶段描述了如何处理该问题并且内部肺上皮的方式是如何自动确定的。简而言之，该过程包括类似原始区域的识别和聚类。

每个簇从不同的种子开始生长，初始化在肺上皮内，沿着不同的线(与(总行数)，图5(一个))．

首先,一个社区(与，图中白色圆圈5.）定义带有CentroID中心的内核，圆形，半径为8像素。每条线都有一个迭代过程和（图中的白色箭头5.），虽然它计算源自候选种子的内核邻域的平均分布。聚类生长的最终种子将是内核的平均分布最小的那个（图中的黑色圆圈5.定义种子）．

属于每个种子的区域用于计算用于聚类生长的上皮的初始统计特性(中心、平均分布、最小值和最大值、区域边缘、区域邻域和熵)。

集群增长．合并过程基于区域间的相似性，采用最小描述长度原则将其数学化为一个局部优化问题[21］．如果任何原始区域是群集的邻居，则在种子上初始化，一个决策规则将说明是否应该包括它。

让是表示二维输入图像的二维函数恒定区域和原始图像强度在地区。让属于具有圆形形状，包括最大数量的区域（，实验计算），位于新查询区域的外轮廓和​​中心内（测试是否包含在群集中是足够的)(图6(一)). 使用区域具有有限数量的原始区域减少了合并统计上异常区域的概率，提供了内膜内上皮的替补图片。

根据最小描述长度，对图像数据进行编码，以确定编码区域所需的总位数给予， 在哪里（1） 是描述给定的每个区域的图像强度所需的比特总数：(与作为像素数量和图像强度熵数）;（2） 编码区域边界信息所需要的比特数是多少(与作为地区的数量那分区的总边界长度，编码起点所需的位数，以及代码边界链代码的每个元素所需的比特数）。

作为一个局部优化问题，其中包含了新的区域在集群中旨在提供最大的正描述长度增益在在每个步骤都有本地优化。

如果一个新的区域被合并到集群中，集群将有更多的像素。因此，需要更多的比特来编码聚类图像强度。但是，两段之间的共同边界和消失，总描述长度可能会减小，因为编码新区域边界信息所需的比特数减少。

和的共同边界元素的数目和和由合并过程产生的新群集，描述长度增益的值与此合并相关的是 如果，图像强度之间和非常相似，因此这些区域属于同一对象。因此，通过消除公共边界来补偿熵的增加，然后这两个区域应该合并以最小化．

２.４.芽数

外周芽的数量是根据肺内上皮的骨架化来计算的[22］．通过去除上皮物体的边界和角点来执行骨架，直到只有骨架仍然是白色像素。

以外缘芽数为亲本数(蓝色圆圈，图)7 (c))骨架分支端的形状（红色圆圈，图7 (c))．只考虑位于外轮廓附近的分支端点(距离小于垂直横贯肺部物体的轴的25%)。

结果

该新计算机算法的性能进行了测试和验证，总共210张图片：90（培养日为18张图像），图像条件为图1（a）和120（培养每天24张图片），图像条件为图1（b）．所有图像之前都是由三位经验丰富的研究人员分割的:每个用户手动分割内上皮和外轮廓，并计数外周芽的数量。

通过将结果与不同研究人员之间的结果进行比较来访问手动量化的性能。使用骰子相似度系数（DSC）评估内上皮和外计数器，该系数系数（DSC）定量不同分段之间的空间重叠，如下： 其中TP是真阳性数，FP是假阳性数，FN是假阴性数。DSC分数范围从0%到100%，表示二元分割结果集之间没有空间重叠，表示完全重叠。桌子1显示三位研究人员LBM Morphorical分析的平均DSC分数和误差差异。桌子2显示与每个手动结果进行自动方法时的平均差异。这外围味蕾错误表中用户间的差异是否为平均误差1表中手动和自动方法之间的差异平均误差2．

两种类型的图像在前两天获得了最好的结果，标准差更小。在最后两天的培养中，由于周围气道芽的数量增加和肺结构的复杂性，很难获得手动和自动程序之间的高度相似性。

统计分析采用方差分析检验(在SPSS Windows 17.0软件中值低于0.05为显著值)显示在所有培养天数中，自动和手动结果(内上皮和外计数器)之间没有显著差异。另一方面，仅在培养前3天，外周芽的误差不显著。研究人员之间没有发现显著差异。LBM形态学分析的时间减少到1-2秒/张，而手工(2-3分钟/张)。

关于具有不同照明条件的图像的不同图像的结果如图所示8.．

一个用户界面也被开发出来，允许用户在空间上理解显微镜图像，并迅速产生自动分割。如果有必要，可以使用手工编辑来校正自动分割结果。尽管这种手动编辑(用于消除虚假合并)提高了DSC分数(>98%)并降低了标准偏差，但它也增加了用户依赖性并减慢了形态分析(取决于编辑程度)。

该策略已在ICVS研究实验室中使用，研究和分析不同浓度特异性抑制剂在肺部分支形态发生的影响。

4.讨论

开发了一种计算机应用程序，提供自动过程以启用快速的LBM分析。在时间消耗，用户依赖性和主体性下降或甚至消除时，增加了形态学分析效率和鲁棒性。由于所有区域都被计算并自动合并，因此消除了观察者变异性。

分割率取决于需要合并的区域数量，以选择整个肺上皮区域。然而，处理时间总是比手工少98%左右。

合并过程对于实现良好的分割至关重要，因为大量区域最初是由分割算法创建的。自动种子选择适用于使用最小描述长度准则分割内上皮，该准则根据图像强度分布相似性选择性地对区域进行聚类。

由于肺内外植体轮廓的模糊和不明确，很少观察到集群合并不同的区域。最差的结果是在培养的最后两天2)，其图像细节和可感知性较低，分支分支急剧增加。然而，使用以查询区域为中心的局部图像区域，使用最小描述长度原则测试其包含是否合适。这使一个可靠的簇沿着上皮物体生长，并逐渐改变空间。

本地阈值有效，以便在图像中用高DSC分数自动描绘外部轮廓，其中图中提出的照明特性1（b）．

在分割过程中发现的主要困难是内部上皮的对比度模糊性和差异性、分支形状和大小的复杂性，以及具有相同密度的邻域区域的存在。此外，对药物、生物标记物和不同培养基的反应会导致图像强度变化和外部轮廓附近的阴影。

这些困难在最后两天的培养中更加明显，因为DSCs较低，即使在比较不同研究人员的结果时也是如此。然而，即使在最后两天培养时，上皮内分割也总是以90%左右的分数进行分割，说明分割成功。

然而，人们必须在这项工作中识别一些限制。所提出的算法估计具有手动计数的统计显着性的外围芽的数量。然而，外周芽计数是一个有争议的问题，没有任何陈述的方法。如表所示1，研究者之间的变异系数(定义为标准差与均值之比)在1左右，说明他们之间没有一致性。有了这个方法，一个人的目的是在不同的研究人员中扩大和概括这一程序。然而，还需要进一步的生物学研究来评估它对肺分支分析的适用性和可靠性。

5.结论

这项工作提出了一个自动分割程序和实现，为LBM形态计量分析提供了一种技术。该方法引入了一系列与直观使用和准确性相关的优点，使该技术适用于具有不同照明特征的图像。人工决策的总数、时间消耗和用户依赖性显著减少。

由于其自动化性质，本申请允许对不同研究人员的结果和多个研究人员进行相同的LBM学习的可能性可靠地进行可靠的比较。

结果表明，有关合并程序和图像增强技术的开发，需要进一步的工作，以改善内部肺上皮对比，主要是在培养的最后几天。此外，必须开发一种新的策略来计算外围气道芽的数量。最后，该方法具有在不同的研究环境中使用的可能性，以改善研究结果。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

承认

作者致谢应对科学技术（FCT），葡萄牙的基础，参考参考资料：SFRH / BD / 74276/2010和SFRH / BPD / 46851/2008。

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