与Argatroban和肝素抗凝治疗粒细胞减少迁移:可能影响ECLS-Therapy吗?

文摘

介绍。抗凝血剂如argatroban和肝素钠(低分子量和依诺)发挥巨大的作用在预防血栓栓塞并发症在临床实践中。然而,他们也可以对免疫系统产生负面影响。本研究的目的是调查的影响多形核中性粒细胞(中性粒细胞),这些物质上的非特异性防御机制能促进血栓形成。方法。30名健康志愿者的血样进行调查,即中性粒细胞分离,密度梯度离心法和孵化0.8μargatroban g / mL, 1.0 U /毫升的低分子量肝素(LMWH), 1.0 U /毫升的依诺肝素钠(能),或没有药物(控制)。collagen-cell混合物制备并填充到3 dμ幻灯片趋化性室(IBIDI®GmbH,德国)。刺激是由使用趋化因子的梯度n-formyl-methionine-leucyl-phenylalanine (fMLP),并为4.5小时进行了显微观察。细胞的轨道长度和轨道直线度的数量,以及吸引了粒细胞,ROS水平(活性氧)生产,和净(中性粒细胞胞外陷阱)的形成,进行了分析和归类到迁移距离和时间。结果。所有三个抗凝血剂导致显著降低中性粒细胞轨道长度,能有最大的影响。跟踪观察到的数量能组比对照组显著降低。此外,超高频群表现出显著降低跟踪相比平直度控制。活性氧产量和净形成未受影响。结论。我们的数据提供了证据表明,抗凝血剂对中性粒细胞迁移的程度有抑制作用和趋化迁移效率,因此来显示他们的潜在的免疫调节和凝血效果。

1。介绍

危重病人经常需要抗凝治疗以防止深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)。患有器官衰竭,需要器官替代疗法,即。,receiving treatment with Extra Corporeal Life Support (ECLS) for respiratory or cardiocirculatory distress or hemodialysis for kidney failure, are—even under anticoagulation therapy—at high risk for thrombotic events due to activation of the coagulation system as mediated by the artificial surfaces involved [1- - - - - -3]。因此,抗凝优化是强制性的在这些病人4,5]。血栓形成在体外膜肺或电路是最常见的技术并发症,发病率高达22% (6]在宴请治疗导致高死亡率虽然技术进步和更复杂的抗凝治疗(7]。

近年来,一些研究提供的证据之间的交互多形核粒细胞(中性粒细胞)及凝血系统。而形成的第一道先天免疫,粒细胞激活不平衡会导致自身免疫性疾病及血栓性并发症(8- - - - - -10]。此外,白细胞存款可以在血栓形成膜肺的气体交换膜(11,12]。

依诺肝素钠(能)或低分子量肝素(LMWH)通常用于抗凝7]。选择性factor-IIa(凝血酶)抑制剂argatroban即将替代用于抗凝患者肝素诱发的血小板减少症(13]。尽管研究一再表明对素能剂量依赖性地抑制粒细胞功能和LMWH [14- - - - - -17),更不了解argatroban在粒细胞迁移的影响18,19]。

本研究的目的是探讨影响和时间的可行性超高频,LMWH,和argatroban孤立粒细胞的功能通过执行用于在体外实验中粒细胞迁移能力的比较分析,趋化性,活性氧(ROS)生产,和中性粒细胞胞外陷阱的形成(NETosis)。

2。材料和方法

2.1。粒细胞的准备

实验装置是基于我们之前的研究(20.,21]。简单地说,全血来自30健康献血者(表1)与他们的知情同意(经当地伦理委员会批准,投反对票。:15-101-0043)实际上使用乙二胺四乙酸(EDTA)最终浓度为1.6毫克/毫升血液。血液样本稀释与4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰)和Tyrode CaCl解决方案(修改为1毫米₂和1毫米MgCl₂)。中性粒细胞是由密度梯度离心法分离(756克)21°C的环境温度为20分钟Lympho旋转介质之上的白色旋转介质(pluriSelect生命科学、莱比锡、德国)根据制造商的指示。洗了两步后,中性粒细胞在resuspended RPMI 1640 (Aidenbach Pan-Biotech GmbH,德国)由10%胎牛血清(FCS, Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim,德国)。

细胞从一个捐赠者孵化在平行37°C 0.8为30分钟μargatroban g / mL (AGATRA、三菱田边制药GmbH,杜塞尔多夫,德国),1.0的国际单位/毫升anti-Xa-activity LMWH伊诺肝素(Clexane,赛诺菲-安万特GmbH,法兰克福,德国),和1.0国际单位/毫升anti-Xa-activity超高频(肝素ROTEXMEDICA、ROTEXMEDICA GmbH Arzneimittelwerk Trittau,德国)或没有药物作为对照。

2.2。显微镜和活细胞成像

可视化的生产ROS 1μM di-hydro-rhodamine (DHR英杰公司D632, Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim,德国),因此,它的荧光,活跃的氧化罗丹明123年使用的产品。净形成被染色检测细胞外释放DNA为0.5μ4 g / mL ,6-diamidin-2-phenylindol (DAPI D9542 Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim,德国)。光和荧光显微镜是用来检查所有四组的细胞(argatroban, LMWH、超高频和控制),而悬浮在I型胶原凝胶(1.5毫克/毫升的PureCol 1.67% FCS,先进BioMatrix Inc .,圣地亚哥,美国)和填充μ幻灯片趋化性室(Martinsried IBIDI GmbH,德国)按照制造商的协议。有一个水库两岸的商会的凝胶渠道;一个充满了n-formyl-methionine-leucyl-phenylalanine (fMLP 10海里;Steinheim Sigma-Aldrich GmbH,德国)与RPMI / 10% FCS和其他与RPMI 10% FCS建立化学引诱物的线性渐变。每个通道充满cell-gel悬浮液preincubated要么argatroban, LMWH,超高频或上述(控制)为了排除interdonor可变性。

徕卡的中性粒细胞的观察进行了DMi8(徕卡GmbH是一家位于德国)和一个自动调节显微镜阶段,相机(DFC9000、徕卡GmbH是一家位于德国)。以确保稳定的测试条件(37°C, 5%的公司₂),一个舞台前孵化器(IBIDI)使用。在观察期内的4.5小时,荧光和相衬图片都被徕卡每30秒自动应用程序套件X (X 3.0.4.16529拉斯维加斯,徕卡GmbH是一家,位于德国)。

2.3。图像数据分析

图像数据分析是基于先前的实验(20.,21]。短暂,总共540张图片每室进行了分析使用伊万里瓷器软件(版本9.0.0 Bitplane、苏黎世、瑞士)。评估细胞迁移,软件识别和追踪细胞迁移半自动地在一个预定的时期。监控迁移后在整个观测时间,4.5小时时期分为块每小时120图像和计算点跟踪在这些街区进行了分析。数据被导出到Excel(美国雷德蒙的微软公司(Microsoft Corp .),佤邦),包括总轨道长度(μ米)(每个细胞的迁徙路线的长度)和轨道直线度(欧几里得的轨道长度和总轨道长度直接显示细胞迁移的倾向;更高的每个因素指直线)。之间的轨道直线度高于0.2和轨道长度11μ米和200μ米被要求识别和追踪粒细胞和排除文物。此外,跟踪分析了中性粒细胞的数量分类迁移距离(总轨道长度的块11-50,51 - 100,101 - 150,151 - 200,201 - 250年,250年及以上μ米)。

通过应变关系进行分析,交叉表创建的比较观察到的和预期的正态分布值。

皮尔逊卡方检验是用来测试变量之间的差异的重要性。轨道的直线度比较,轨道长度在50以上μm是必需的。

调查时间点最大ROS生产(达峰时间),图像被每2.5分钟4.5小时观察期间,与人力资源总监或罗丹明表面积之和123染色进行了计算。这些表面区域也认出了半自动地伊万里瓷器和导出到Excel文件。第三个多项式趋势线被安装到抛物线课程(时间比压之和)确定ROS的达峰时间(分钟)。达峰时间值120分钟以上”指的是难以置信的。

DAPI接触的反应细胞外DNA(净形成)也分析了每个时间点总结单一的表面区域,导致s形曲线。的时间点half-maximal(等影响₅₀)是由人口达到计算分析凤凰64软件(s形基线E_马克斯模型;Certara Inc .)、普林斯顿,纽约,美国)。等₅₀值超出了观测期间”指的是难以置信的。

2.4。流式细胞术

除了生活细胞成像,部分细胞准备流式细胞术(Becton & Dickinson FACSCalibur,海德堡,德国)与第二个分析活性氧的生产方法和比较四组之间的活力使用CellQuest Pro软件(版本5.2,正欲生物科学、圣何塞美国)和FlowJo(版本10.0.7 FlowJo LLC,亚什兰,美国)。碘化的细胞活力,propidium——(π)-细胞被认为是至关重要的。

量化ROS生产的材料和方法被详细描述之前的论文(22,23]。简单地说,500年preincubated细胞μL的消息灵通的缓冲区和Tyrode CaCl解决方案(修改为1毫米₂和1毫米MgCl₂),5μL (DHR (10μ米),5μL seminaphtharhodafluor(狼吞虎咽,10μ米,英杰公司)。刺激诱导是通过添加5μL fMLP (10μM)和5μ人类肿瘤坏死因子-α(TNF的Lα,1μg / mL, PeproTech Inc .,落基山,美国新泽西)或5μL phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA, 10μ米,Sigma-Aldrich GmbH)。最后,5μ1.5毫米L(π(33671年,美国赛瓦电泳GmbH,海德堡,德国)被添加到检测死细胞。

2.5。统计分析

所有Excel数据(Microsoft Excel 2016)随后被转移到SPSS统计(版本25,IBM公司,阿蒙克,纽约,美国),和Kolmogorov-Smirnov测试是用来证实为每组正态分布。那里有一个正态分布的平均值(MV)比较,指定标准偏差(±SD)。原始数据比较利用克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析(方差分析)。那里有方差同质性(列文),事后分析使用Bonferroni调整或执行,另外,Dunnett-T3测试。非参数的对比组,中位数和四分位范围(差)和绘制盒阴谋和低级和高级质量,以及最小值和最大值计算。应急分析、交叉表和皮尔逊卡方检验是用来检测重要的上下文。值低于或等于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

对照组( 跟踪)表现出的轨道长度中值66.3μ米( )在第一个60分钟的观察。在52.6μ米( ),中位数的argatroban集团( 跟踪)明显低于对照组( )。LMWH组( 跟踪)的中值66.9μ米( ),从控制并没有不同,而中值最低的37.0μ米( )( )被发现在超高频集团( 跟踪(图)1(一))。然而,它是可能的观察之间的显著差异argatroban LMWH组和超高频组( )。

分钟61年和120年之间,所有三个verum组显著不同的控制( 跟踪),平均为53.6μ米( )( )。argatroban集团( 跟踪)和LMWH组( 跟踪),中位数为47.3μ米( )和42.6μ米( ),分别。和之前一样,最低的价值被发现在超高频集团( 跟踪)平均值为19.3μ米( ),也不同于LMWH和argatroban组( )(图1 (b))。

从每分钟121到180年,控制(没有差异 跟踪),平均为38.8μ米( ),和argatroban集团( 跟踪),平均值为43.8μ米( ),或LMWH组( 跟踪)平均值为35.4μ米( )。只有能集团( 跟踪)不同于控制显著降低值为27.3μ米( )( )(图1 (c))。argatroban组的中值明显高于中位数LMWH和超高频组( )。

分钟181年和240年之间,argatroban集团( 跟踪)与中值40.8μ米( )——只有组证明中值显著高于控制。控制( 跟踪)的中值32.0μ米( )( )和LMWH组( 跟踪)的中值28.6μ米( )( )。其他组之间没有差异(超高频群( 跟踪)显示值为26.1μ米( ))(图1 (d))。没有进一步显著差异可以检测到的最后30分钟观察期间(数据没有显示)。

包含观察跟踪数量的交叉表定义长度类别,和预期的轨道计算基于一个假定的正态分布,揭示了药品的数量和跟踪(卡方之间显著相关 , , 跟踪)。比较显示无显著偏差的控制和argatroban组的相对偏差在-4.32%和-1.82的范围。对于所有类型的距离超过151μm(-22.1%和-7.77),高震级的偏差往往LMWH组,但没有达到意义。最高的观察和预期数量之间的差异被发现在超高频群。这里,偏差范围从-23.0到-72.9%超出了51的类别μ米总轨道长度,这表明nonmigrating粒细胞的相对数量(总 ; )升高,相对活跃粒细胞(总吗 ;意思是-44.3%)降低(表2)。

因此,只有平均粒细胞计数的超高频集团( 跟踪)——的重大偏差 跟踪和预期之间的细胞/轨道长度类别,相对于对照组( 跟踪),只有 偏差( )(图2)。

跟踪的比较平直度控制(没有显示出差异 跟踪),轨道直线度中值为0.40 ( ),和argatroban集团( 跟踪)平均值为0.38 ( )。这也适用于LMWH组( 跟踪)平均值为0.40 ( )。平直度的超高频集团( 跟踪),然而,不同显著的控制( )平均值为0.32 ( )。

不包括一个难以置信的极端值后,生活中氧化DHR细胞成像的荧光反应没有什么区别的平均最高温度控制( , )。每个小组展示以下达峰时间值:argatroban集团( , ),LMWH组( , ),和超高频集团( , )(图3)。

后扣除五难以置信的测量等₅₀值超过400分钟,超过11等₅₀每组值可以被评估。均值等。₅₀值如下:控制( , ),argatroban组( , ),LMWH组( , ),和超高频集团( , )(图4)。

fMLP-stimulated粒细胞的流式细胞仪分析,控制( )显示位数罗丹明123 (ROS)生产的荧光强度115 ( ),argatroban组( )89的中值( ),LMWH组( )175的中值( ),和超高频集团( )66的中值( )。在积极控制(PMA-stimulated),中位数4254 ( )获得了在对照组( ),3390年,中位数( ),3889 ( ),和4555年( )得到argatroban组( ),LMWH组( ),和超高频集团( ),分别。因此,所有的中位数ROS生产所导致的荧光强度,很难辨别(图中被发现4)。

30分钟后预培养时间与药物、细胞argatroban集团( )显示值的98.6% ( 粒细胞%)至关重要的。LMWH组( )中值的98.7% ( %),重要的细胞可能会发现,这是类似于超高频集团( )中值的98.8% ( %)。因此,相对于控制( )中值的98.8% ( ),可以观察到无显著差异。

4所示。讨论

本研究调查的影响临床使用抗凝血剂超高频,LMWH伊诺肝素,和直接thrombin-inhibitor argatroban在孤立的粒细胞粒细胞迁移而言,时间依赖的活性氧产量和净形成和活力。

中性粒细胞得到从两性健康志愿者事先动员,然后被孵化在超高频的同时,LMWH,和argatroban洗了两步后,以排除任何外部影响基线粒细胞功能,如感染或体液和荷尔蒙因素。因此,测量体液因素如凝血因子、趋化因子、细胞因子没有执行。所有三个已知抗凝血剂减少炎症介质由血细胞和其他组织(例如,il - 6、引发肿瘤坏死因子ακB (NF或核因素κ- b)更长的潜伏期时间之后,从三个小时到4周(18,24,25]。

自1971年以来,能在临床常规使用。激活抗凝血酶并对其anticoagulatory影响通过促进抗凝血酶之间的相互作用(在),凝血酶,以及与凝血因子X [26]。LMWH直接抑制凝血因子X,创建一个剂量依赖性抗凝效果。它也被用于临床常规的二十年里,和它的使用已被证明安全的医疗和手术病人(27,28]。Argatroban直接凝血酶抑制剂用于管理抗凝在打击二世(13];在宴请和血液透析抗凝的可行性已经证明(29日,30.]。

三个剂量的抗凝血剂在调查中被选出的临床常规匹配。根据制造商,一个激活凝血酶原时间(aPTT、基线27-36秒)长时间的1.5到3倍需要抗凝治疗与argatroban [31日]。等离子体水平的0.8μ克/毫升argatroban导致aPTT 62 - 65秒(32]。LMWH伊诺肝素的用量是根据制造商的抗凝治疗的处方信息。后皮下应用1毫克/公斤体重每天两次,等离子体水平的anti-Xa-activity 1.1国际单位/毫升可以测量的稳定状态(33]。1.5到2.5倍的aPTT延长需要抗凝治疗与超高频(34]。超高频的浓度选择基于相同的参数对于伊诺肝素,在适当的伦理considerations-an添加1国际单位/毫升anti-Xa-activity避免管理一个超高频注入健康志愿者几个小时为了实现稳定的aPTT值。此外,调整基于anti-Xa超高频剂量检测已被证明比aPTT-based更可靠检测的实现速度方差(少的抗凝治疗35]。

迁移试验,中性粒细胞激活是由使用化学引诱物fMLP。刺激与fMLP在几项研究已经被证明是一个切实可行的办法引起净形成(36]。它使细胞的观察事件在我们的活细胞成像,这是一个先决条件的精确评估迁移。我们决定不激活PMA的活细胞成像,因为代理的已知实质性影响粒细胞功能(37]。在我们流仪测定,粒细胞激活ROS生产是通过使用fMLP,外加PMA作为一个积极的控制(38]。我们实验室的未发表的数据显示一个近似50%等₅₀减少PMA浓度超过10纳米。

迁移进行了分析使用胶原蛋白我矩阵模拟生理细胞外环境。我们的胶原蛋白我试验装置使活细胞成像和并行测试迁移,ROS生产,NETosis [20.,21]。此外,流式细胞仪分析的方法被用于呼吸爆发测量(22,23]。

所有三种抗凝剂在调查中显著降低中性粒细胞迁移与对照组相比。虽然argatroban已经开始抑制中性粒细胞迁移首先观察期内,LMWH的时间发挥作用。最大的影响是在超高频测量组在第一次180分钟的实验。此外,超高频preincubated粒细胞显示显著降低相对迁移细胞的曲目数量比控制。此外,轨道直线度显著降低,导致低效率的迁移在超高频组。肝素和LMWH已知粒细胞减少迁移各临床设置。在其他的研究中,研究人员发现减少创伤性脑损伤后粒细胞浸润时使用相同的给药方案对超高频和LMWH [39,40]。我们的观察与这些研究的发现,尽管我们的研究使用一个不同的矩阵。这些抑制效应归因于刺激与超高频和LMWH的抗凝能力无关,如抑制凝血酶、Mac-1,交互与heparin-binding蛋白质,NFκ- b、生长因子和细胞因子(39,40]。argatroban管理后,低渗透的粒细胞老鼠遭受创伤性脑损伤的脑组织被观察到;另一项研究显示,粒细胞减少渗透到老鼠的肝组织患有脂肪肝(18,19]。这两个研究假设,这种效果是由于凝血酶抑制,从而导致增加等离子体水平在大脑和肝脏组织和粒细胞作为强有力的催化剂。政府后argatroban与脓毒症大鼠,福克斯等人观察改善肠道微循环与降低白细胞粘附和提高毛细血管灌注(41]。这些影响也归因于microthrombi凝血酶抑制和随后的减少,以及减少内皮激活白细胞粘附较低。凝血酶也有直接促炎的影响由于其受体(protease-activated受体(PAR)),导致增加水平的一种蛋白激酶,NFκ- b, caspase-3 [42]。在最近的一项研究由Bulani et al .,显著改善糖尿病心肌病可能被检测到43]。管理argatroban粒细胞减少迁移在第一个120分钟的两个实验。令人惊讶的是,在目前的工作中,中性粒细胞与孵化argatroban显示更大的迁移距离120分钟后控制相比,虽然移民在这个时间段是基线值两组相比显著降低。

在我们的研究中,活性氧产量无显著差异之间的群体调查可以发现,无论是有关荧光强度或其时间序列。这个结果符合的一项研究的发现徐et al。研究者不能观察减少ROS生产后每天皮下1.5毫克管理局伊诺肝素在大鼠肝纤维化模型和脾切除术44]。许等人推测,伊诺肝素对凝血酶有抑制作用和血小板。相比之下,李和同事显示减少ROS在支气管上皮细胞系的细胞培养生产16 HBE孵化后超高频的50到450国际单位/毫升(45]。李等人的研究假设,能在细胞内信号通路的抑制效应无关这个观察抗凝效果负责。因此,达到减少ROS生产使用的剂量远远超出了等离子体水平在我们的研究中使用的超高频和远远超出临床常规。

关于应用剂量的三个物质调查在我们的实验中,没有明显的净能找到组织形成差异。相反结果的绝对数量,但不是时间序列,是由其他研究小组研究超高频和LMWH。福克斯等人观察到显著降低后网管理水平高剂量能在100年μ克/毫升,相当于大约10国际单位/毫升(15]。减少净形成曼等人观察到的相同剂量的1国际单位/毫升伊诺肝素(17]。这种相反效应后者研究中观察到的可能是由于不同的处理方案对中性粒细胞是如何获得和孤立。在曼等人的研究中,粒细胞孵化30分钟在4°C伊诺肝素,这可能由于体温过低有抑制作用。我们所知,没有文献argatroban和净形成的交互是目前可用的。

最后,在我们的实验环境中,没有一个接受调查的三个物质影响了研究的可行性。虽然能被能够诱导细胞凋亡在粒细胞剂量依赖性的方式通过CD61b通路,等离子体水平高于20 - 50要求国际单位/毫升(产生巨大影响14,16,45]。正如前面提到的,这个剂量远远超出理性的抗凝机制。

还需要进一步的研究来阐明不同的或附加的影响由于中性粒细胞接触人造表面或剪切力作用引起的体外系统。

5。结论

总之,我们与collagen-I-matrix体外研究提供证据表明,中性粒细胞迁移活动序列初始化之前,细胞开始改变他们的形状和产生ROS净形成紧随其后。我们的数据表明,在治疗剂量抗凝血剂,特别是能,有抑制作用粒细胞迁移的能力,以及在多大程度上有效地迁移和迁移的能力。因此,抗凝血剂可能有免疫调节作用。它可以假设实际上患者中性粒细胞迁移能力也比较低。此外,它可以推测,实际上患者的中性粒细胞可以坚持人工表面由于其迁移能力减弱,导致凝血状态与体外设备可能影响治疗。其他粒细胞功能没有影响,现有的文献表明,高剂量的抗凝血剂需要这些功能的抑制。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

部分这项工作提出了作为一个抽象的2018 EuroELSO国会。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

作者的贡献

AB和基于“增大化现实”技术的研究设计,负责统计分析,起草手稿。可、镁、DB和SMP实验执行,修订后的手稿。KL、WP和TS负责统计分析。所有作者阅读和批准最终的手稿。安德烈Bredthauer和曼纽尔Kopfmueller同样本文和分享第一作者。

确认

我们要感谢实验室人员的麻醉学雷根斯堡大学医学中心的优秀的技术援助在整个研究项目。我们还要感谢重拜她为尚未出版的PMA和粒细胞函数数据和志愿捐献者。没有他们的参与和灵活性,这项研究是不可能的。这项研究由部门内部的麻醉学的雷根斯堡大学医学中心。

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