通过调节miR-27A-3P / TGF，长度非致RNA SOX2-OT加剧缺氧诱导的心肌细胞损伤βR1轴

摘要

背景．心肌梗死(MI)是一种严重的心血管疾病，由急性、持续性缺氧或缺血情况造成。此外，心肌梗死通常会导致心力衰竭，甚至猝死。大量研究表明，长链非编码rna (lncrna)经常参与心脏疾病的调控。SOX2-OT在MI中的具体作用及分子机制尚不清楚。研究目的．本研究旨在探讨SOX2-OT在MI中的作用。方法．采用生物信息学分析(DIANA工具和Targetscan)和广泛的实验(CCK-8、流式细胞术、RT-qPCR、荧光素酶报告、RIP、caspase-3活性、trans-well和western blot)来研究SOX2-OT的功能和机制。结果．我们发现，缺氧处理降低了细胞活力，但增加了细胞凋亡。此外，lncRNA SOX2-OT在缺氧hcm中表达上调。随后，我们证实了SOX2-OT通过直接结合miR-27a-3p负调控miR-27a-3p, miR-27a-3p也负调控SOX2-OT。此外，下调SOX2-OT可促进细胞增殖、迁移和侵袭，但抑制细胞凋亡。然而，这些作用被anti-miR-27a-5p所逆转。此外，我们验证了miR-27a-3p与TGFBR1和SOX2-OT的3'UTR结合对TGF的调控作用βR1水平通过HCMS中的miR-27a-3p合作。最终，通过TGFBR1过表达验证了救援分析验证了SOX2-OT沉默或miR-27a-3p过表达对心肌细胞损伤细胞过程的影响被TGFBR1过表达抵消。结论．长链非编码RNA SOX2-OT通过调控miR-27a-3p/TGF加重缺氧诱导的心肌细胞损伤βR1轴，可能为心衰治疗提供新的见解。

1.介绍

心肌梗死(Myocardial infarction, MI)是指由于冠状动脉闭塞和血流中断而导致严重持续性缺氧或缺血而引起的心肌坏死[1，2]．心梗对心肌造成了诸多损害，已成为世界范围内发病率和死亡率最高的疾病[3.，4]．据报道，过量劳动、饮食不规律、吸烟和饮酒等危险因素与心肌梗死的发生或进展密切相关[5，6]．虽然心肌梗死患者的总死亡率通过冠状动脉再灌注明显降低，但额外的再灌注损伤，如心肌细胞功能障碍和死亡，经常被报道[7，8]．因此，我们迫切需要对MI的分子机制进行深入的了解和探索。

长链非编码rna (lncrna)属于长度不少于200个核苷酸且不具有蛋白质编码能力的一类转录本[9，10]．被证明在各种疾病或肿瘤中参与了几种生物过程的调节，如细胞增殖，细胞凋亡，迁移和侵袭[11，12]．据报道，长链非编码RNA HOTAIR通过海绵吞噬microRNA-206并靶向STC2，加速头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞的增殖、迁移和侵袭[13]．此外，长链非编码RNA ZFAS1促进骨关节炎软骨细胞增殖、迁移和凋亡[14]．在MI大鼠模型中，lncRNA XIST沉默通过调节miR-449抑制心肌细胞凋亡[15]．最近，lncRNA SOX2重叠转录本(SOX2- ot)被提出促进一系列肿瘤的进展，如食管鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、胆管癌[16- - - - - -18]．尽管SOX2-OT被证实在缺血性心力衰竭中上调[19Sox2-OT的特定功能和调节器机制仍然难以捉摸。

microrna (mirna)是另一组非编码rna，长度约为22个核苷酸[20.]．mirna与靶基因的3 '非翻译区(3 ' -UTR)结合，调节其水平，从而调节细胞增殖、分化和凋亡[21]．miR-208、miR-494、miR-499和miR-1303在MI的早期诊断中发挥关键作用[22]．miR-130通过靶向PPAR-加重急性心肌梗死引起的心肌损伤γ［23]．近年来，miR-27a-3p下调通过增加丝裂原活化蛋白激酶4 (MAP2K4)抑制癫痫海马神经元细胞的炎症反应和凋亡[24]．此外，miR-27a-3p与hsa_circ_0026480和hsa_circ_0046159相互作用调节慢性血栓栓塞性肺动脉高压[25]．然而，miR-27a-3p在MI中的生物学作用尚不清楚。

综上所述，本课题旨在探讨SOX2-OT在心肌梗死中的作用及机制。我们发现SOX2-OT通过miR-27a-3p/TGF抑制细胞凋亡，促进心肌细胞增殖、迁移、侵袭，从而加重缺氧诱导的心肌细胞损伤βR1轴，可以为MI处理提供新颖和可能的策略。

2。材料和方法

2．1．细胞和细胞治疗

人心肌细胞原代细胞(HCM)从Cellprogen (Torrance，美国)获得，并在人心肌细胞原代细胞培养基(Cellprogen)中培养，置于37℃、5% CO的潮湿培养箱中₂．hcm在1% O的培养箱中培养₂, 5%的公司₂， 94%₂不同时间(12、24、48 h)诱导缺氧。

2．2．细胞转染

在细胞转染中，使用miR-27a-3p mimic (miR-27a-3p)和inhibitor (anti-miR-27a-3p)在阴性对照(miR-NC)中过表达和敲低miR-27a-3p。采用靶向SOX2-OT的短发夹RNA (sh-SOX2-OT)和对照(NC)抑制SOX2-OT水平。将SOX2-OT或TGFBR1全长基因亚克隆到pcDNA3.1载体中，以空pcDNA3.1作为对照，过表达SOX2-OT或TGFBR1。所有这些载体都是使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美国)按照制造商的协议转染到细胞中购买的。

２．３．实时反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

在制造商的说明下，使用Trizol试剂(Thermo Fisher，美国)从HCMs中提取总RNA。然后用SuperScript®III第一链合成系统(Thermo Fisher) RNA进行逆转录。Real-time PCR采用quantitative SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germantown, USA)，采用QuantStudio 3 Real-time PCR System (Thermo Fisher)。引物将根据需要提供。GAPDH作为lncRNA和mRNA的内控。U6作为miRNA的内部控制。相对RNA水平用2^−ΔΔCt方法。

２.４.荧光素酶报告实验

大约5 × 10⁴使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）用miR-27a-3p模拟，抗miR-32-3p模拟，抗miR-37a-3p或miR-nc和野生型或突变体SOx2-OT（或TGFBR1）PGLO质粒的野生型或突变体SOx2-OT（或3'UTR）。所有质粒均来自Genepharma（中国上海）。通过在转染48小时后，通过双荧光素酶报告管理系统（Promega，USA）检测荧光素酶活性。

2.5。RNA免疫沉淀（RIP）测定

采用大鼠RNA免疫沉淀(RIP)试剂盒(Millipore, Billerica, USA)进行RIP测定。将含有Ago2或IgG(阴性对照)抗体的磁珠加入HCM细胞裂解液中，裂解液在RIP缓冲液中保存。RT-qPCR检测SOX2-OT和miR-27a-3p的相对水平。输入作为控制。

2.6。细胞生存能力

Cell Counting Kit-8（CCK-8; Keygen，南京，中国）用于测试细胞活力。简而言之，5×10^3.96孔板每孔接种不同时间(0、12、24、48)缺氧诱导的hcm。hcm与10μL CCK8解决方案。用450 nm波长在酶标仪(168-1000型680,Bio-Rad)上测定吸光度。

2.7。流式细胞术凋亡测定

Annexin V-FITC/staining kit (ThermoFisher)双染色分析细胞凋亡。根据厂家说明书，在细胞悬液中加入Annexin V-FITC和PI进行染色，使用CellQuest 3.0.1软件中的FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences, USA)分析hcm。双色法检测细胞凋亡率。

2.8。Caspase-3活动分析

采用caspase-3检测试剂盒(比色法)(Abcam, Cambridge, USA)检测caspase-3活性，符合制造商的方案。简单地说，转染后的HCMs在裂解液中裂解，培养48小时后加入96孔板。随后，将caspase-3催化底物DEVD-pNA、2×反应缓冲液、DTT与HCMs在37℃下共培养2 h。最后，用酶标仪在405 nm处测量OD值。

2.9。免疫印迹

用RIPA裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology, USA)从心脏组织和细胞中提取总蛋白。通过SDS-PAGE分离蛋白，然后转移到PVDF膜(Millipore, MA)上。随后，使用tris缓冲盐水0.01%吐温20 (Santa Cruz Biotechnology)与5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1小时。然后，将抗tgfbr1 (ab31013, Abcam)和抗gapdh (ab181602, Abcam)的一抗在4°C的膜上培养过夜。二抗培养1小时后，在制造商的指导下，使用Clarity™Western ECL Blotting substrate (Bio-Rad)对印迹进行可视化，并使用ImageJ软件对蛋白水平进行量化。GAPDH作为一种内部控制。

2.10。Trans-Well化验

在24孔反式井室中操作的反式井测定（8 μM;康宁，上海，中国）。使用（或没有）1mg / mL matrigel的上腔室用于检测细胞侵袭（或迁移）。将培养基中的10,000,000 HCM接种到上腔室中，同时将补充有10％FBS的培养基加入底部腔室中。24小时后，将迁移或侵入的HCM固定在75％甲醇中并用0.1％晶体紫色染色。在光学显微镜下计算每个字段中的迁移和侵入的单元的数量。

2.11。统计分析

所有数据以平均值±SD显示。采用SPSS (Chicago, IL, USA)和GraphPad Prism 5软件(San Diego, CA)进行统计分析。实验进行了三次。两组或两组以上的方差的显著性通过学生的方差来评估t以及和方差分析。被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．缺氧诱导HCM细胞SOX2-OT上调

之前的研究已经在缺血性心力衰竭组织中发现了包括SOX2-OT在内的几种上调的lncrna。此外，数据来自GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov.)显示缺血性心肌病或心肌梗死患者外周血中SOX2-OT也较健康外周血上调(图1(a))。为进一步探讨SOX2-OT的作用，将HCMs进行不同时间的缺氧处理，构建心肌损伤细胞模型。如图所示1(b)和1(c)缺氧24或48小时后，HCMs的活力下降，但HCMs的凋亡率升高。根据RT-qPCR的结果，与对照组相比，这些lncrna中SOX-OT表达的上调最为显著(图)1(d))。综上所述，缺氧诱导HCM细胞SOX2-OT表达上调。

３．２．HCM细胞中SOX2-OT与miR-27a-3p直接相互作用

在机制上，SOX2-OT被广泛报道作为ceRNA调控下游靶基因水平。因此，我们预计SOX2-OT在HCMs中也以这种方式发挥作用。戴安娜工具(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools)来预测miR-27a-3p在SOX2-OT上的结合位点(图2(一个)）.RT-qPCR结果验证了miR-27a-3p在HCMs中分别被miR-27a-3p模拟物过表达和被anti-miR-27a-3p敲除(图)2（b））.利用SOX2-OT的4个突变进行荧光素酶报告基因检测，发现miR-27a-3p模拟物降低了pgl -SOX2-OT- wt的荧光素酶活性，而anti-miR-27a-3p提高了pgl -SOX2-OT- mut的荧光素酶活性，而pgl -SOX2-OT- mut没有发现这种变化(图)2（c））.同样，过表达miR-27a-3p可降低SOX2-OT水平，抑制miR-27a-3p可提高SOX2-OT水平(图)2（d））.以下，通过将PCDNA3.1 / SOX2-OT（或抗SOX2-OT）转化为HCM（图，通过将PCDNA3.1 / SOX2-OT（或抗SOX2-OT）增加（或减少）的水平（图2（e））.RT-qPCR检测结果显示，SOX2-OT过表达下调了miR-27a-3p的表达，SOX2-OT缺失则上调了miR-27a-3p的表达(图)2（f））.最后，RIP实验显示，SOX2-OT和miR-27a-3p在anti-Ago2组中均有富集，而在anti-IgG组中没有富集(图)2（f））.综上所述，SOX2-OT在HCM细胞中直接与miR-27a-3p相互作用。

３．３．SOX2-OT协同miR-27a-3p调控HCM细胞的细胞过程

为了探究SOX2-OT和miR-27a-3p在HCMs细胞过程中的具体作用，我们进行了广泛的实验。首先，抑制SOX2-OT提高了细胞活力，抑制miR-27a-3p抵消了SOX2-OT沉默的促进作用(图)3.(a))。相反，miR-27a-3p的耗尽抵消了SOX2-OT衰减对细胞凋亡和caspase-3活性的抑制作用(图)3.(b)和3.(d))。最后，通过Sh-Sox2-OT和抗miR-27a-3p的Cotransfecte（图，Sh-Sox2-Ot介导的迁移和侵袭细胞的升高逆转（图3.(e) -3.(h))。综上所述，SOX2-OT协同miR-27a-3p调控HCM细胞的细胞过程。

3．4．SOX2-OT监管TGFβHCM中R1与miR-27a-3p合作

据报道，TGFBR1可调节心血管疾病。生物信息学分析(Targetscan;http://www.targetscan.org）用于预测MiR-27A-3P和TGFBR1 3'UTR之间的结合序列（图4（a））.然后，荧光素酶报告基因检测显示，miR-27a-3p mimic降低了pgl - tgfbr1 -3 ' utr - wt的荧光素酶活性，而miR-27a-3p缺失增强了pgl - tgfbr1 -3 ' utr - wt的荧光素酶活性(图)4 (b)）.RT-qPCR检测显示，转染miR-27a-3p模拟物后，TGFBR1 mRNA水平下调，转染anti-miR-27a-3p后，TGFBR1 mRNA水平上调(图)4 (c)）.随后，我们参与验证TGFBR1是否受SOX2-OT/miR-27a-3p轴调控。荧光素酶报告基因检测显示，SOX2-OT抑制抑制了野生型pgl - tgfbr1 -3 ' utr荧光素酶活性，而sh-SOX2-OT与anti-miR-27a-3p共转染可抑制荧光素酶活性的改变(图)4 (d)）.同样，SOX2-OT的抑制使TGFBR1的mRNA和蛋白水平降低，miR-27a-3p的抑制使TGFBR1的mRNA和蛋白水平恢复(图)4 (e)- - - - - -4 (g)）.一起携带SOX2-OT调节TGFβ在HCM中通过协同miR-27a-3p来调节R1水平。

3.5。MiR-27A-3P通过调制TGF来抑制心力衰竭开发βR1在HCM细胞中

通过救援实验证实miR-27a-3p/TGFβR1轴在HCM细胞中。一开始，TGFBR1过表达抑制了细胞活力，逆转了miR-27a-3p模拟物对细胞活力的促进作用(图)5(a))。相反，TGFBR1过表达会延缓miR-27a-3p模拟物对细胞凋亡的抑制作用(图)5(b)和5(c))。MiR-27A-3P模仿诱导的迁移和侵袭细胞的增强被异位TFGBR1抑制，其同样减少了与模拟/ PCDNA3.1组相比迁移和侵袭细胞的数量（图5(d) -5(g))。综上所述，miR-27a-3p通过调节TGF抑制心力衰竭的发展βR1在HCM细胞中。

3.6。SOX2-OT通过TGF促进HCM细胞损伤βR1

为了探讨SOX2-OT与TGFBR1的关系，我们使用不同载体转染的HCM细胞进行以下实验。根据图6(a)， TGFBR1过表达抵消了SOX2-OT抑制对细胞活力的动机性影响。相反，sh- sox2 - ot介导的细胞凋亡率下降被TGFBR1过表达所中和(图)6(b)和6(c))。此外，TGFBR1过表达也消除了SOX2-OT抑制对细胞迁移和侵袭的抑制(图)6(d) -6(g))。所有实验结果均表明SOX2-OT通过调节TGF促进心力衰竭βR1在HCM细胞中。

4.讨论

近年来，MI在中国的发生呈上升趋势[26]．每年至少有50万人被诊断为心肌梗死，大约有200万人患有心肌梗死[27]．MI的典型症状为低血压、休克、心律失常和心力衰竭[28]．心肌梗死的预后与梗死面积大小及并发症密切相关[29]．因此，有必要研究更多的分子作为预后标志物。

尽管lncrna缺乏编码蛋白质的能力，但大量的研究报告称，lncrna被认为可以通过修改核酸或蛋白质、海绵microrna、激活或灭活信号分子来调控各种疾病的发展[30.]．更重要的是，新兴报告提出了一种竞争性内源性RNA（Cerna）模式，即LNCRNA可以与miRNA竞争地结合以释放mRNA [31，32]．例如，lncRNA Malat1通过海绵化miR-181c-5p来促进小檗碱介导的HMGB1抑制，从而促进脑卒中后炎症[33]．在糖尿病肾病中，长链非编码RNA GAS5被证实通过海绵吞噬miR-221和调节SIRT1水平来限制细胞增殖和纤维化[34]．最近，包括SOX2-OT在内的一些lncrna被报道在MI中上调[19，35]．与此一致，在我们的研究中，缺氧诱导的HCMs中SOX2-OT水平高于对照组。随后，我们证实了SOX2-OT与miR-27a-3p结合，SOX2-OT负调控HCMs中miR-27a-3p水平，反之亦然。在功能上，转染anti-miR-27a-3p可逆转SOX2-OT下调对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。

转化生长因子受体1 (TGFBR1)是TGF的关键分子β/smad信号通路[36，已被广泛报道可调节疾病中的细胞过程[37]．例如，miR-22通过靶向TGFBR1调控C2C12成肌细胞的增殖和分化[38]．MicroRNA-98阻碍了胶原蛋白的生成和TGF-β1通过调节TGFBR1诱导心脏成纤维细胞的分化[39]．在我们的研究中，TGFBR1被miR-27a-3p直接靶向。TGFBR1的mRNA和蛋白水平受SOX2-OT/miR-27a-3p轴的调控。既往研究认为TGFBR1通过抑制NF-κB通路，加重缺氧诱导的心肌细胞损伤[40]．同样，在我们的探索中，TGFBR1促进了HCMs的增殖、迁移、侵袭和阻止细胞凋亡，从而加重MI。此外，救援实验表明，TGFBR1的扩增抵消了miR-27a-3p模拟物或sh-SOX2-OT对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。

综上所述，我们证实了SOX2-OT通过调控miR-27a-3p/TGF加剧了缺氧诱导的心肌细胞损伤β第一次发现R1轴，提示可能是心肌梗死的诊断或治疗靶点。但这只是对SOX2-OT在MI中的初步研究，其他机制有待进一步探索。

数据可用性

支持本研究发现的数据可由通讯作者在合理的要求下提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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