文摘
背景。的存活率口腔鳞状细胞癌(OSCC)只有50%是由于高发病率的转移。长非编码rna (lncRNAs)扮演着重要的角色在OSCC起源和发展,虽然在OSCC的转移他们的潜在作用尚不清楚。方法。5转移性的转录组和5 nonmetastatic OSCC样本评估RNA序列。LEMD1-AS1在OSCC的生物功能和监管机制,探索体外和体内试验。结果。我们确定了487个差异表达差异表达lncRNAs mrna (DEmRNAs)和1507 (DElncRNAs)在OSCC颈部淋巴结转移(LN)相对于nonmetastatic样本。此外,LEMD1-AS1及其同源LEMD1上调转移OSCC相比nonmetastatic OSCC。功能,功能丧失,救援实验表明LEMD1-AS1调节LEMD1增加OSCC迁移和入侵在体外和体内。从力学上看,LEMD1-AS1稳定LEMD1和增加了信使rna和蛋白质水平,因此PI3K-AKT信号通路的激活促进OSCC转移。结论。我们建立转移OSCC的lncRNA-mRNA景观,这表明LEMD1-AS1增强其反义转录LEMD1 OSCC转移通过稳定。因此,LEMD1-AS1预测转移的潜在生物标志物,以及OSCC的治疗目标。
1。背景
口腔鳞状细胞癌(OSCC)是世界范围内最常见的诊断恶性肿瘤之一(1- - - - - -3),特点是高发病率的局部侵犯及颈部淋巴结转移(LN)。尽管最近的进步手术、放化疗、和其他靶向治疗,OSCC患者的总生存期仍只有50%,由于高转移率(4,5]。因此,有必要确定OSCC的潜在机制转移以开发出新的有效的治疗方法。
长非编码rna (lncRNAs)非编码记录超过200个核苷酸长度(6,7),分为反义intronic,双向,基因间的和重叠的类型。lncRNAs通过染色质修饰调节基因的表达,microrna的淬火,信使rna稳定的直接调制,转录,翻译,以及蛋白质稳定控制(8,9,参与肿瘤的起始和进展。的反义lncRNAs约占50 - 70%所有lncRNAs并能发挥其功能独联体——或者反式机制(10]。的独联体代理反义lncRNAs结合基因在他们附近,虽然反式-lncRNAs调节在相同甚至更遥远的基因在不同的染色体。此外,独联体反义lncRNAs pretranscriptional调节基因表达,转录,转录后的水平通过DNA-lncRNA lncRNA-RNA或protein-lncRNA交互。lncRNA-RNA交互发生和发展中尤其常见的癌症,包括感觉和反义序列的杂交成RNA工器调节转录后的结果。赵等人报道,MACC1-AS1促进胃癌细胞代谢可塑性通过稳定MACC1 mRNA (11]。此外,lncRNA PXN-AS1-L作为癌基因在非小细胞肺癌(NSCLC)通过增加PXN表达式(12]。元等人发现MUC5B-AS1促进肺腺癌转移的形成与MUC5B RNA-RNA双工。然而,所知甚少对反义lncRNAs在转移性OSCC的功能。
为此,我们进行了下一代测序分析人类OSCC组织为了地图差异表达rna和建立lncRNA-mRNA交互网络。因此,我们确定lncRNA LEMD1-AS1及其目标基因LEMD1,它充当一个致癌基因在多种癌症,在OSCC通过功能化验和分析它们的生物作用。我们的研究结果提供了新的见解OSCC转移预后预测并确定一种新型生物标志物和有针对性的治疗。
2。结果
2.1。概述的RNA序列数据
地理数据库中所有原始数据已上传(GSE145272,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145272)。共有487个差异表达mrna (DEmRNAs) 168(319调节和表达下调)和1507个差异表达lncRNAs (DElncRNAs)(971调节和536下调)中确定RNA-seq数据使用 和值< 0.05作为阈值(图1)。(附加图功能富集分析1520年)显示,487年DEmRNAs丰富生物过程(BP), 13细胞组件(CC)和21个分子功能(MF)条款,包括信息粘连、受体复杂,渠道复杂,通道活动,和受体的活动。KEGG通路分析(附加图1 b)表示243年浓缩通路,包括营信号通路,钙信号通路,cytokine-cytokine受体相互作用,细胞粘附分子(摄像头)。
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2.2。DElncRNA-DEmRNA交互网络
DElncRNAs之间潜在的相互作用和DEmRNAs预测使用LncTar通过R软件和相关软件。相互作用对筛选 和值< 0.05作为阈值。如附加图所示2,132年独联体监管对和165994反式规定对被识别。
2.3。rna特异表达的验证
验证RNA-seq数据,我们随机选择五德尔纳(LEMD1-AS1, LEMD1, TBILA、LINC01133 PURPL)排名前50的德尔纳qPCR 10个样本的识别。LEMD1-AS1、LEMD1 TBILA, LINC01133显著调节转移与nonmetastatic OSCC虽然PURPL前(图中表达下调2)。
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2.4。LEMD1-AS1和LEMD1过表达在人类OSCC组织和细胞系
因为LEMD1-AS1和LEMD1在转移性调节OSCC样本相对于nonmetastatic样本,我们假设LEMD1-AS1促进OSCC LEMD1转移通过上调其预测目标。来证实我们的假设,我们发现两者的表达水平的额外OSCC样本中存在。与生物信息学的结果一致,表达高水平的转移性肿瘤LEMD1-AS1和LEMD1呈显著正相关(图2 (f))。此外,转移OSCC细胞行听UM1 OSC19, CAL27显示明显高于LEMD1-AS1水平相比nonmetastatic UM2 OSC3细胞(附加图3)。综上所述,在OSCC prometastatic LEMD1-AS1和LEMD1交互。
2.5。通过LEMD1 LEMD1-AS1提升OSCC细胞的迁移
鱼试验表明,LEMD1-AS1主要是局部在OSCC细胞的细胞质,细胞核和最小信号观察(附加图4)。进一步分析LEMD1-AS1在OSCC细胞的生物学作用,我们在OSC19撞倒了它的表达和CAL27细胞使用智能消声器(附加图5),ectopically表示在UM2和OSC3细胞(附加图5 b)。细胞overexpressing LEMD1-AS1 LEMD1水平较高,而LEMD1-AS1击倒的差别与对这些LEMD1(附加图5 c - d)。LEMD1-AS1沉默和超表达对OSCC细胞的增殖有任何影响相比各自的控制(附加图6)。然而,LEMD1-AS1过度UM2和OSC3细胞显著增加其迁移能力在体外(图3),而在OSC19 LEMD1-AS1击倒了相反的效果,CAL27细胞。综上所述,LEMD1-AS1在OSCC prometastatic因素。确定LEMD1-AS1介导的影响在OSCC通过LEMD1我们撞倒了后者在细胞稳定overexpressing LEMD1-AS1(附加图7)。如图4的击倒LEMD1废除的影响LEMD1-AS1超表达在OSCC细胞的迁移和入侵的能力。因此,LEMD1-AS1 / LEMD1交互对OSCC进展和转移是至关重要的。
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2.6。LEMD1-AS1 LEMD1 mRNA的稳定性增加了形成一个防护RNA双工
目前所取得的成果表明,LEMD1-AS1监管LEMD1 mRNA表达水平。与此一致的是,LEMD1蛋白水平也增加OSC3细胞稳定overexpressing LEMD1-AS1和减少LEMD1-AS1-knockdown细胞(图5)。LEMD1-AS1是本地化的反义链LEMD1基因。此外,反义同源的稳定性意义mRNA lncRNAs增加形成一个RNA-RNA双工,也增强了信使rna表达水平。生物信息学和基因序列分析显示一个重叠(OL)地区LEMD1-AS1和LEMD1之间。核糖核酸酶保护分析进一步表明,残余的OL地区LEMD1-AS1与LEMD1高于non-OL地区,表明OL地区部分免受核糖核酸酶降解(图6(一))。这些结果表明,增加LEMD1-AS1 LEMD1 mRNA的稳定性。功能验证这个推测,我们对待控制或LEMD1-AS1-overexpressing OSC3细胞RNA聚合酶II抑制剂α鹅膏蕈碱块新的RNA合成,发现高水平的LEMD1-AS1 LEMD1 mRNA的稳定性而增加,在控制细胞(图6 (b))。因此,LEMD1-AS1稳定和提高在OSCC细胞LEMD1 mRNA的表达。
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2.7。LEMD1-AS1激活PI3K-AKT通路
生物信息学分析和文献综述的基础上,我们分析了水平PI3K-AKT pathway-related蛋白质在LEMD1-AS1-overexpressing OSCC细胞。如附加图所示8,p-PI3K p-AKT OSC3细胞的显著调节稳定overexpressing LEMD1-AS1相比控制细胞。因此,LEMD1-AS1可能激活PI3K-AKT通路通过增加LEMD1信使rna和蛋白质含量。
2.8。LEMD1-AS1促进宫颈LN和OSCC的肝转移在活的有机体内
确认LEMD1-AS1的生物功能在活的有机体内,我们建立了宫颈LN和B / C小鼠肝转移模型。LEMD1-AS1-overexpressing (OSC3-OE)或正常控制(OSC3-NC) OSCC细胞被注入到老鼠FOM,虽然37.5%的OSC3-OE小鼠颈LN转移,OSC3-NC集团并没有显示任何转移(附加图9)。矛盾的在体外结果,原位肿瘤的体积明显大OSC3-OE与OSC3-NC组,这意味着更大的OSC3-OE细胞的增殖能力在活的有机体内(图7)。
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3所示。讨论
最近的研究相关的异常表达水平与OSCC lncRNAs起源和发展。然而,鲜为人知的函数在OSCC lncRNAs特异表达区域LN转移(13,14),这是最普遍的OSCC患者的死亡原因。确定lncRNAs及其目标基因的作用在OSCC颈LN转移,我们确定了之间的差异表达mrna和lncRNAs主要OSCC样品有无地区LN转移,由于表达模式的主要组织是类似于转移性组织根据单细胞测序结果2017年头颈部鳞状细胞癌(15]。德尔纳浓缩在组件和KEGG通路与肿瘤进展相关,迁移和入侵,如细胞粘附[16,17),通道和受体的活动(18- - - - - -20.),营信号通路(21),PI3K-AKT信号通路(22,23),cytokine-cytokine受体相互作用,和摄像头24]。DElncRNA-DEmRNA网络随后构造,LEMD1-AS1及其反义mRNA LEMD1在OSCC确认为一对相关。LEMD1 [25)属于cancer-testis抗原(CTA)家庭和位于染色体1 q32.1。LEMD1-AS1和LEMD1都是调节在OSCC LN转移nonmetastatic样品相比,表明LEMD1及其反向链LEMD1-AS1可能增强OSCC细胞的迁移和入侵的能力。
尽管LEMD1-AS1增益/损失函数对OSCC细胞生长没有影响,在LEMD1-AS1-overexpressing OSC3细胞导致较大的肿瘤相比,控制细胞。这可能是由于这一事实增加这些细胞的侵袭性导致撞击的原位肿瘤下颌骨和FOM肌肉,导致更大的肿瘤体积。在原位OSCC模型,OSC3-OE细胞导致更高的LN和血性的转移率,这也进一步验证了转移LEMD1-AS1的潜力。与此一致的是,LEMD1-AS1显著提升OSCC迁移和入侵在体外。此外,LEMD1沉默中和LEMD1-AS1 pro-metastatic效果,表明LEMD1-AS1直接目标LEMD1 OSCC细胞侵袭性增加。
超过63%的所有成绩单在人类细胞拥有反义转录,这在任何扰动可以改变意义mrna的表达(26- - - - - -28]。越来越多的研究显示,自然反义lncRNA能稳定其对应的信使rna,以增加其表达水平(29日- - - - - -31日]。RNA-asRNA相互作用形成RNA-RNA混合的结果,部分身体绑定(32,33)或激活多核糖体(27]。生物信息学分析显示,LEMD1-AS1 LEMD1组成了一个“tail-to-tail”削模式和地区183个基点OL。此外,LEMD1-AS1本地化在细胞质中,表明双LEMD1之间形成的可能性及其反义lncRNA。此外,OL地区LEMD1信使rna核糖核酸酶消化,保护它耗尽non-OL的大部分地区。最后,过度LEMD1-AS1增加LEMD1 mRNA的稳定甚至在RNA聚合酶II抑制剂的存在α鹅膏蕈碱。因此,LEMD1-AS1可以稳定LEMD1信使rna,并保护其免受核糖核酸酶通过RNA-RNA交互。
cta是调节雄性生殖细胞和各种癌症组织中,但不是在正常组织(34]。这种蛋白质集群促进上皮间充质转变(EMT) [35)和转移(36)、入侵和致癌作用。不出意料,cta是诊断癌症生物标志物和治疗目标的吸引力。LEMD1也促进了各种癌症像结直肠癌的发生和发展25,37,38)和前列腺癌(39]。Sasahira et al。40)确定LEMD1小说在OSCC致癌基因,并支持其诊断和治疗的潜力。LEMD1也是目标基因的微rna - 135间变性大细胞淋巴瘤(41]。我们阐明监管LEMD1-AS1之间的交互和LEMD1首次为cta的机制提供新的见解癌症。
PI3K-AKT通路是癌症的关键起始和进展,并经常中断在实体肿瘤(22,42]。PI3K-AKT通路中的突变或改变已确定在OSCC [24,43- - - - - -45]。符合先前的研究在胃癌(46),我们发现OSC3 PI3K-AKT通路被激活的细胞稳定overexpressing LEMD1-AS1。因此,我们推测,LEMD1-AS1上调LEMD1激活PI3K-AKT通路,促进OSCC的迁移和入侵。
区域LN转移的最常见原因是穷人OSCC患者存活率。我们确认487 DEmRNAs和1507 DElncRNAs转移与nonmetastatic OSCC样本和特征LEMD1-AS1 / LEMD1交互OSCC的发起人首次转移。从力学上看,LEMD1-AS1激活PI3K-AKT通路的稳定和移植LEMD1。然而,生存分析相关LEMD1-AS1表达式是不可能由于随访时间短。此外,具体的监管LEMD1-AS1之间的轴,LEMD1, PI3K-AKT通路在OSCC发展还有待阐明。此外,目标基因LEMD1-AS1可能不是只LEMD1;应该进一步研究目标基因之间的关系。我们的研究结果必须验证与再后续更大的群组研究中。
4所示。结论
LEMD1-AS1大幅增加转移性OSCC组织和细胞系和提升OSCC迁移和入侵在体外和在活的有机体内通过稳定其反义转录LEMD1,这是一个潜在的PI3K-AKT信号通路的激活。因此,LEMD1-AS1是一种新型诊断生物标记和免疫治疗转移性OSCC的目标。
5。方法
5.1。人类组织样本
肿瘤组织收集从OSCC患者在中南大学湘雅医院接受手术。接受放疗或化疗的患者手术前被排除在外。招募患者的基线数据存在于表中1。原发肿瘤组织样本都证实了两名有经验的病理学家和RNA提取存储在-80°C。包括病人的临床特点也被记录下来。知情同意是获得所有的科目。本研究长沙市湘雅医院伦理委员会批准(201907790)。
5.2。下一代核糖核酸测序和生物信息学分析
总RNA分离出5颈LN患者颈转移和5例LN转移使用试剂盒试剂(美国CA英杰公司)根据制造商的指示。RNA被量子位评估的质量,Nanodrop,安捷伦2100生物分析仪。总RNA RNA序列库准备使用TruSeq滞留图书馆准备装备根据制造商的规格。核糖体rna被删除,剩下的记录被净化,支离破碎。使用随机引物合成第一链cDNA执行,紧随其后的是两样东西互补dna合成和修复结束。3结束的互补和结扎adenlylated为PCR Illumina公司Truseq适配器。2500年被Illumina公司Hiseq测序互补脱氧核糖核酸数据库。bioinformatical分析都是由R和LncTar软件。值调整为多个测试采用错误发现的方法,和 和值< 0.05被设置为截止条件。
5.3。OSCC细胞株和动物
OSCC细胞系包括听UM1 UM2、OSC3 OSC19,和CAL27培养high-glucose DMEM(美国CA Gibco)补充10%胎牛血清(Gibco、钙、美国),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(美国CA Gibco) 37%,包含5%的湿润孵化器有限公司2。BALB / c-nude小鼠(5-week-old)获得中南大学的实验动物中心。所有动物实验机构批准的中南大学动物保健委员会(No.2019sydw0116)。
5.4。存在分析
总RNA分离使用试剂盒试剂(表达载体、钙、美国)如上所述,和反向转录cDNA HiScript三世RT SuperMix (Vazyme,南京,中国)。实时PCR进行QuaintStudio 7 Flex系统(热费希尔、钙、美国)使用SYBR一体化qPCR混合(GeneCopoeia,广州,中国),并使用2相对基因表达进行了计算- - - - - -ΔΔCT方法规范化GAPDH或18 srna。引物序列表中列出2。
5.5。荧光原位杂交
RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)执行使用一条鱼工具包(Ribobio、广州、中国)根据制造商的指示。短暂,适当治疗细胞被固定为4%甲醛10分钟,permeabilized PBS 0.5% Triton x - 100,并通过在37°C prehybridization随后封锁了30分钟。细胞在一夜之间被孵化50 nM鱼探针(Ribobio有限公司)于100年μl杂交缓冲在37°C。杂交的幻灯片和一个梯度洗清洗缓冲( Tween-20为0.1%, , )分别为5分钟42°C,和风干。对比染色后4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),幻灯片是在荧光显微镜成像。
5.6。转染
日博™智能得到消声器瞄准LEMD1-AS1 RiboBio(广州)和包括三个核和三个针对不同的反义寡核苷酸序列。设计并合成人类LEMD1的siRNAs RiboBio(中国)。细胞转染各自siRNAs使用Lipofectamine3000试剂(表达载体、钙、美国)。此外,OSCC细胞转导与LEMD1-AS1表达慢病毒(GENECHEM、上海、中国)与特定的莫伊(感染复数)。核序列表中列出3。
5.7。CCK-8化验
使用2 -细胞生长监测(2-methoxy-4-nitrophenyl) 3 - 5 (4-nitrophenyl) - (2, 4-disulfothenyl) 2 h-tetrazolium试剂(CCK-8 Meilunbio,大连,中国)分析根据制造商的指示。暂态稳定转染子被播种在96孔板的密度3000细胞/ 5复制/样品。CCK-8试剂添加到每个后1、2和3天的文化,和吸光度的测量在450海里。
5.8。伤口愈合实验
适当治疗细胞被播种直到confluency six-well盘子和成长。单层是挠跨板使用无菌10μl吸管,脱落细胞被洗。受伤的地区拍摄在0 12和24小时后抓,抓区域被ImageJ计算软件。
5.9。Transwell化验
细胞收获36 ~ 48小时内瞬态或稳定转染后被播种到上部腔体transwell插入(康宁(3422、354480),纽约,美国)的密度 细胞/在200μ无血清培养系统l high-glucose DMEM。下室挤满了400μl DMEM补充20%的边后卫。24小时后文化、迁移的细胞和4%多聚甲醛固定30分钟,30分钟与结晶紫染色,计算在内。
5.10。西方墨点法
蛋白质是由溶解提取细胞里帕缓冲区(美国纽约Abcam)补充蛋白酶抑制剂和磷酸盐抑制剂,通过sds - page和转移到PVDF膜分离。阻塞在5%的脱脂牛奶1小时后,一夜之间,凝胶被孵化的主要抗体(美国马Abcam春秋国旅,妈,美国),其次是HRP-conjugated免疫球蛋白二级抗体。乐队是可视化使用ECL基质(SAB,医学博士,美国)。微管蛋白作为加载控制。
5.11。核糖核酸酶保护试验
RNA双LEMD1-AS1之间形成LEMD1评估与核糖核酸酶A + T鸡尾酒(表达载体、钙、美国),只能消化单链和双RNA。短暂,样本孵化酶的鸡尾酒在37°C 30分钟,剩下的双链RNA提取使用RNeasy工具包(Tianmo,北京)和分析中存在。
5.12。稳定和α鹅膏蕈碱治疗
OSC3细胞稳定表达LEMD1-AS1或空向量被播种到6-well盘子和处理50μM RNA合成的拦截器α鹅膏蕈碱。细胞收获0、6、12、18、24小时后处理和分析中存在。18 s RNA作为内部控制,因为它是稳定的α鹅膏蕈碱治疗。
5.13。动物实验
一个原位口腔肿瘤模型小鼠注射控制或LEMD1-AS1-overexpressing成立 OSC3细胞( 每组)在100年μl DMEM进嘴的地板(FOM)通过颏下的FOM肌肉之间的空间(约5毫米)。老鼠牺牲在植入后30天或当他们的体重减少到16 g (g)或更少。舌头和颈LNs收集和固定在10%多聚甲醛立即因为他染色。原位肿瘤的体积计算 。所有组织染色结果由两个专家病理学家检查。
5.14。统计分析
所有数据使用SPSS 22.0分析统计软件包(SPSS Inc .)、芝加哥,美国)和可视化Graphpad棱镜7。结果被表示为 三个实验。两个或多个组使用双尾学生的比较 - - - - - -分别测试和单向方差分析。皮尔森相关系数是用来分析LEMD1-AS1和LEMD1表达水平之间的相关性。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。
伦理批准
本研究长沙市湘雅医院伦理委员会批准(201907790号)和中南大学动物保健机构委员会(2019号sydw0116)。
同意
知情同意是获得所有的科目。所有方法按照指导原则和有关规定进行(对人类和动物)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
再涂和李Canhua姜浩概念化。李再涂分配方法。再涂李分配给软件。李宁和吴Jianjun做了验证。洁王做了正式的分析和调查。吴Jianjun分配给资源。再涂,Jianjun吴邦国委员长和江Canhua策划数据。再涂李和杰王原创作品草稿准备。王杰和Canhua姜浩writing-review和编辑。吴Jianjun可视化。 Jie Wang and Canhua Jiang worked on supervision. Canhua Jiang is responsible for the project administration. Canhua Jiang and Zaiye Li acquired funding. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.
确认
本研究在湖南省自然科学基金的支持下,中国(批准号2020 jj4881),和基础研究基金中央大学的中南大学(2019 zzts795)。
补充材料
额外的图1:DEmRNAs功能富集分析。(A)的酒吧阴谋去分析。CC MF紫色,橙色,黄色为基点。(B)得分排名前十的浓缩KEGG通路。额外的图2:DElncRNA-DEmRNA交互网络独联体- - -反式方法。圆圈表示mrna和矩形指示lncRNAs。红色节点意味着upregulation转移OSCC样本,而绿色。差别节点代表对这些(一)独联体方法。(B)反式方法。附加图3:在OSCC LEMD1-AS1细胞系的表达。五OSCC细胞线路检查。转移性OSCC细胞行听UM1、OSC19 CAL27显示明显高于LEMD-AS1水平相比nonmetastatic UM2和OSC3细胞。红色的与OSC3表示统计差异,蓝色表示,听UM1。额外的图4:LEMD1-AS1的亚细胞位置。鱼试验表明LEMD1-AS1主要位于细胞质中,而一些在细胞核中。红色显示LEMD1-AS1,蓝色显示核; 。额外的图5:表达LEMD1AS1 LEMD1转染子。(A) LEMD1-AS1击倒OSC19效率和CAL27聪明的消音器。(B) LEMD1-AS1超表达效率UM2 OSC3慢病毒。(C) LEMD1 mRNA表达水平是减少LEMD1-AS1-knockdown OSCC细胞。(D) LEMD1 mRNA表达水平升高在LEMD1-AS1-overexpressing OSCC细胞。附加图6:CCK8分析暗示LEMD1-AS1没能影响细胞生长在OSCC细胞。(A)击倒的LEMD1-AS1 OSC19 CAL27细胞并不影响细胞生长。(B)过度的LEMD1-AS1 UM2 OSC3细胞并没有改变的能力增长。SS: LEMD1-AS1智能消声器;NC:正常控制; OE: LEMD1-AS1-overexpressing. Additional Figure 7: apply 3 sequences of siRNA to inhibit LEMD1 expression. Among these, si3# had the highest transfection efficiency. Additional Figure 8: Western Blotting showed that the level of PI3K-AKT pathway-related proteins was increased in LEMD1-AS1-overexpressing OSC3 cells compared to the control cells. Additional Figure 9: the metastasis ratio of two groups (LEMD1-AS1-overexpressing and normal control (NC)).(补充材料)