文摘

背景。的机械方面的参与长非编码rna在NETosis (lncRNAs),中性粒细胞胞外陷阱的过程(净)形成在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC),缺乏全面的说明。这些分子的参与的免疫微环境和合理的HNSCC预后仍然看到光明的一天。的合理运作NETosis-related lncRNAs用似是而非的预后影响HNSCC探测在这项工作。方法。lncRNAs的审查与NETosis意味着24与过程相关的基因的探索运用皮尔逊相关分析在HNSCC病人的RNA从癌症基因组图谱测序数据(TCGA)数据库。单变量的应用,至少绝对收缩和选择算子(套索)和多变量Cox回归分析了NETosis-related lncRNA签名的适用性受到调查用人生存和预后诺模图分析。结果。的NETosis-related lncRNA签名包括五lncRNAs促进患者被隔离为高风险和低风险组前记录预后较差。回归出土的风险评分是一个独立的预后因素。接受者操作特征(ROC)或接受者操作特征曲线分析记录一年时间ROC曲线下面积(AUC)值为0.711,是确定的这个签名的准确性。额外的调查记录了明显丰富immune-linked通路的低风险患者,而高危患者记录了免疫“冷”形象/免疫细胞的渗透。我们从NETosis-related lncRNA验证表达式lncRNA签名体外,这在一定程度上反映了我们的模型的可靠性。此外,我们还验证了lncRNA的函数。我们发现LINC00426有助于先天免疫cGAS-STING信号通路,这从一定程度上解释我们的预测模型在预测的角色“热”和“冷”肿瘤。结论。的似是而非的预后相关性NETosis-related lncRNA签名(5 lncRNAs)出现在针对HNSCC暗示的承诺。

1。介绍

HNSCCs来自口腔的粘膜上皮,咽、喉和占领全球癌症发病率的第六的位置(1]。最无所不在地涉及风险因素HNSCC包含致癌人类乳头状瘤病毒(HPV)感染、吸烟、过量饮酒(2]。HNSCC非常异构细胞起源的解剖位置,各种病因和致癌机制(3]。大多数病人接受晚期HNSCC诊断没有临床初癌的历史(1]。尽管扩大手术和非手术方法(包容性的放疗、化疗和免疫治疗),HNSCC的临床预后仍然是一个障碍,5年生存率低于50% (4,5]。因此,一些似是而非的预后标志物的探索,准确地预测HNSCC成为至关重要的结果帮助界定个性化的治疗方案。

中性粒细胞胞外陷阱(网)网络式涂上组蛋白的DNA结构,蛋白酶,颗粒和胞质蛋白(6)和中性粒细胞释放的陷阱微生物,以及其形成的过程被称为NETosis [7]。可能网参与非传染性的疾病,如自身免疫、凝血、急性损伤,和癌症,一直记录(6]。其参与原发性肿瘤增长、转移和并发症如静脉血栓在恶性肿瘤也被探索8]。已经证实,净挤压引起tumor-secreted CXCR1和CXCR2配体对恶性肿瘤的细胞毒性的保护作用自然杀伤(NK)细胞和T细胞(9]。细胞周期的增加来提高转移血液内网扩大循环肿瘤细胞的转移潜力也知道(10]。杨等人证明了网(NET-DNA)促进癌症转移的DNA组成部分通过跨膜蛋白CCDC25 [11]。然而,研究探索的角色NETosis HNSCC很少。李等人发现hypercoagulable状态驱动在口腔鳞状细胞癌通过系统性炎症刺激中性粒细胞'和发布网(12]。在最近的研究记录的审查NET-related预测非小细胞肺癌预后的基因签名(13)的作用和功能NETosis值得更多的研究。因此,它是有意义的辨别小说NETosis-linked生物标志物识别的分子机械方面NETosis HNSCC患者预后的预测。

lncRNAs rna长度超过200个核苷酸,不参与蛋白质编码但参与控制基因表达14]。在肺癌的介入lncRNAs监管网是已知的(13]。然而,探索NETosis-associated lncRNAs HNSCC尚未看到光明的一天使的预后价值NETosis-associated lncRNAs不清楚。

免疫治疗癌症的治疗发生了革命性变化在过去的二十年里,主要采用免疫检查点封锁(ICB)方法。截至2019年,银行独立委员会(pembrolizumab IgG4人源化抗体PD-1)被批准作为一线或后续治疗复发或转移性鳞状细胞癌的头部和颈部15]。肿瘤微环境是极其相关应对银行独立委员会。银行独立委员会有效性很差在“冷”肿瘤记录PD-L1水平较低的肿瘤细胞,巨噬细胞,免疫细胞(4]。转换这些肿瘤“冷”“热”的银行独立委员会在HNSCC治疗可以增强的响应(16]。虽然敏感的肿瘤免疫治疗(PD-1 + CTLA-4双检查点封锁)由NETosis抑制最近记录(9),这样的研究仍然是有限的。的探测NETosis和肿瘤免疫微环境之间的关系,进一步理解“冷”HNSCC才能促进“冷”HNSCC优化处理系统。

这项工作旨在审查NETosis-related lncRNAs HNSCC来理解这一现象的分子和信号通路在肿瘤和预测患者的预后。此外,NETosis和肿瘤免疫微环境之间的关系的进一步探索提供了投机的基础在“冷”HNSCC疗法。

2。材料和方法

2.1。病人的细节

RNA序列数据和病人的特点HNSCC患者恶性和44正常样本(502)来自TCGA的数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)。临床病理的属性包括年龄、性别、吸烟情况、人乳头状瘤病毒状态,肿瘤分级、肿瘤阶段,存活时间,和生存状态。排除后正常样本( )和患者总生存期(OS)失踪,499例记录完整的生存和测序数据参加这项工作。图S1工作流应用的例证。

2.2。识别NETosis-Related lncRNAs

首先,24 NETosis-associated基因被确定通过搜索文献(表S1)[9,17- - - - - -25]。lncRNA和运用人类基因组蛋白质编码的基因注释浏览器GRCh38。p13 (http://asia.ensembl.org/index.html),那么随之而来(26]。lncRNAs之间的相关性和NETosis-associated基因的表达是探索运用皮尔逊相关系数。NETosis-related lncRNAs测定 和 。

2.3。建立和验证的NETosis-Related lncRNAs预后签名

这意味着随机分配(2:1)499例患者进入队列训练队列和验证。NETosis-related lncRNAs预后是第一得分采用单变量Cox回归分析病人的生存训练队列中的数据( )。套索Cox回归随之而来的预后NETosis-related lncRNAs尽可能减少过度拟合的机会。随后应用多元分析的指示候选人lncRNAs显著参与OS预后的预测。确定了五个相关NETosis-related lncRNAs预后模型按照最低Akaike信息标准(AIC)值。的风险分数HNSCC患者通过规范化lncRNA表达水平和相应的回归系数。这包括以下公式计算( )与分辨lncRNA表达水平一样EXPgene及其多变量Cox回归分析系数 。风险评分的中值来分类训练队列中高危患者(≥位数号码)和低(<位数号码)组。以下测试随后证实签名:群际操作系统被kaplan meier得分分析“生存”和“survminer”R包。“生存的预测精度是探索中华民国“R包使用时间接受者操作特征(ROC)曲线分析。这个签名的审查的效用作为一个独立的预后因素与其他临床属性继承多变量Cox回归分析。随后证实这个签名的验证队列方式使用上述公式来量化风险评分在个别病人。截止值用于训练队列应用验证组患者高风险和低风险的分类组。确证继承kaplan meier和时间ROC分析。

2.4。预测列线图

我们进一步描述列线图建立在“rms”R包与上述lncRNA签名和其他操作系统预测预后贡献者HNSCC患者(1年、3年和5年)。我们也计算探测精度的校准曲线。

2.5。功能富集分析

然对基因和基因组的京都百科全书(KEGG)路径分析与基因集富集分析(GSEA) (versionv4.1.0,http://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads)风险组采用我们NETosis-related lncRNA签名。

2.6。详尽的探索免疫细胞的概要文件和银行独立委员会治疗高危人群

肿瘤浸润免疫细胞HNSCC样本的测量是对雇佣CIBERSORT [27),CIBERSORT−ABS (27],QUANTISEQ [28],伊势亚[29日],MCPcounter [30.],史诗[31日),计时器(32)算法。NETosis风险组审查和免疫功能ssGSEA或single-sample GSEA采用“GSVA”包中,而文学取得了合理的基因免疫分子检查站。为了衡量签名的影响病人的预后post-ICB疗法,ssGSEA完成的基因集NETosis用人的“GSVA”包R在两组中,银行独立委员会疗法(anti-PD-L1 / PD-1)是管理33,34)个人NETosis分数。这些分数(中值)是利用将患者分组为高和低的分数。签名的相关性预测ICB治疗反应引起有关生存分析。

2.7。化疗反应与我们NETosis-Related lncRNA签名

化疗病人的反应是得分采用R包“pRRophetic”[35]。

2.8。细胞培养

这项工作带来的使用正常的人类永生的鼻咽上皮细胞系(NP69)和人类鼻咽癌细胞系(CNE1、HNE1 TW03,和SUNE1)。所有在rpmi - 1640细胞培养介质(GIBCO)补充7%胎牛血清(ExCell Bio) 5%的股份有限公司2在37°C。

2.9。定量实时聚合酶链反应

总RNA NP69, CNE1、HNE1或TW03细胞收集用人RNA-Quick净化设备(ESscience)坚持必要的和规定的协议。互补脱氧核糖核酸合成采用RNA逆转录工具包(ESscience)按规定的指令。实时PCR扩增随之而来SYBR绿色(Vazyme)和第二套引物:AC079336.5 (5 - - - - - -CACAATCCCACGCTGTACCT-3 和5 - - - - - -CAGGTGTCCTCAGAAAGCGT-3 ),AL645933.2 (5 - - - - - -GCTTGCTGACTCTGTGGACT-3 和5 - - - - - -AGTTCAGGTCACCAGTCCCT-3 ),LINC00426 (5 - - - - - -TGCAGGCTTTGTAGACCCTC-3 和5 - - - - - -TTGCGGGTGATTTACTGGGG-3 ),LINC00623 (5 - - - - - -AGCTTCTCTGCAGGTCACAC-3 和5 - - - - - -TGGGCCACCCTTGAACATTT-3 ),和GADPH (5 - - - - - -CTGGGCTACACTGAGCACC-3 和5 - - - - - -AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 )。所有样本进行审查一式三份,每个目标基因被GADPH规范化。qPCR和分析使用LightCycler 480(罗氏)和软件工具。

2.10。集落形成实验

CNE1或SUNE1细胞被置于与500细胞/一式三份12-well板块(BIOFIL)和rpmi - 1640年培养基培养(GIBCO)补充7%胎牛血清(ExCell Bio) 10天。然后,盘子洗两次与PBS和固定75%酒精1小时。与PBS洗两次后,细胞与结晶紫染色2小时。然后,结晶紫是冲洗掉,殖民地的数量统计。

2.11。细胞增殖实验

MTT试验被用来评估细胞的相对能力。短暂,细胞被播种在1000细胞/ 96 -孔板和培养过夜rpmi - 1640中含有7%的边后卫在posttransfection 24小时,分别。加10μL MTT标记试剂和继续培养4 - 6 h。读了分光光度法的样品在570海里。数据分析使用GraphPad棱镜8(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。

2.12。伤口愈合实验

细胞被播种到6-well组织培养板在一个适当的50 - 60%的密度和rpmi - 1640年培养基培养(GIBCO)补充7%胎牛血清(ExCell Bio) 24小时前成为一个单层。一个线性的伤口被刮细胞单层20μL吸管小费。轻轻刮后,细胞被洗了两次冲洗介质,然后培养rpmi - 1640中没有胎牛血清。伤口在0,在显微镜下拍摄24、48和72小时。三个领域被随机拍照。

2.13。质粒,转染

LINC00426质粒和控制质粒是购自上海Genechem有限公司质粒瞬时转染了使用Lipofectamine 3000(英杰公司)根据制造商的指示。然后,为后续实验24小时后收集细胞的转染。

2.14。西方墨点法

全细胞提取物被直接裂解生成1×细胞裂解缓冲(细胞信号技术,# 9873)与1毫米phenylmethylsulphonyl氟化物(PMSF)立即使用前。和样品6×SDS样品缓冲添加在100°C加热10分钟,通过SDS - page来解决,然后转移到PVDF膜。膜被检查的主要抗体,紧随其后的是相应的HRP-conjugated anti-mouse或anti-rabbit (Proteintech)二级抗体。以下抗体被用于:α微管蛋白(1:1000年,Proteintech),注册会计师(1:1000年,Abcepta) TBK1(1: 1000年,Proteintech) phospho-TBK1(1: 1000年,春秋国旅),刺痛(1:1000年,Proteintech) phospho-STING(1: 1000年,春秋国旅),IRF3(1: 1000年,Proteintech)和phospho-IRF3(1: 1000年,春秋国旅)。

2.15。统计分析

Wilcox测试是用来探测相对大量的免疫分子和检查站免疫细胞浸润组织的恶性肿瘤的风险。lncRNA签名及其与临床病理的因素被卡方测试探测。正如上面阐明的,识别OS预后的独立因素引起多变量Cox回归分析。预后预测的准确性被ROC分析测量。R软件(版本4.1.0)和SPSS(23.0版)是为所有这些计算。

3所示。结果

3.1。两组病人特征

患者随机分配的HNSCC满足资格标准( )完成培训( )和验证( )组2:1的比例。临床特点和病理记录详细的表1。培训组包括246名男性(73.9%)和87年(26.4%)女性患者50.8%患者超过60岁,而验证组包括120名(72.3%)男性和女性患者46例(27.7%),51.8%的患者超过60岁。共有204名(61.3%)患者和110名(66.3%)患者有吸烟史的培训组和验证组,分别。大多数患者缺乏HPV评估两组。有23例(6.9%)确诊与积极的人乳头状瘤病毒状态和53名患者(15.9%)与消极的人乳头状瘤病毒状态确认训练队列。同样,有10位病人(6.0%)与积极的人乳头状瘤病毒状态确认和26名患者(15.7%)与消极的人乳头状瘤病毒状态确认验证队列。训练队列,病理评估显示,236名(70.9%)患者分为中度分化差等级(1 - 2年级)和84年(25.2%)患者分类以及分化等级(3 - 4年级)。此外,17例(5.1%)患者45例(13.5%)患者56例(16.8%)患者中,170(51.1%)我列为TNM阶段,II, III和IV HNSCC分别。对验证对象、病理评估显示,123名(74.1%)患者分为中度分化差等级(1 - 2年级),以及37例(22.3%)患者分类分化等级(3 - 4年级)。此外,8例(4.8%)患者,24例(14.5%)患者和22例(13.3%)患者和89例(53.6%)被列为我TNM阶段,II, III和IV HNSCC分别。 Overall, no significant differences were detected in age, gender, smoking history, HPV status, tumor grade, and tumor stage between training and validation cohorts.

表1
病人的临床特点培训组和验证组。
3.2。数据收集和识别NETosis-Related lncRNAs

首先,我们包括RNA-seq的数据和528 TCGA HNSCC患者的临床资料;然后,44正常样本和1样本缺乏生存数据被排除在外(最后的耐心 )。然后,24 NETosis-linked基因划定HNSCC病人如前所述。564之间的相关性NETosis-related lncRNAs 24 NETosis-linked基因被皮尔逊相关分析,评估和NETosis-related lncRNAs被确认的标准 值小于0.001 ( ),和皮尔森相关系数的绝对值超过0.4 ( )。

3.3。建立一个预后NETosis-Related lncRNA HNSCC患者签名

总共499 HNSCC患者被随机分配到训练集和验证集。最初的单变量Cox回归分析了HNSCC患者预后lncRNAs基于训练集,重叠的预后lncRNAs和NETosis-related lncRNAs被确定的候选人lncRNAs NETosis-related lncRNA签名,导致113 lncRNAs。换句话说,这些113 lncRNAs不仅与NETosis也显著相关HNSCC病人的预后。随后套索Cox回归减少多重共线性出土12 lncRNAs(数字1(一)和1 (b))。随后的多变量Cox回归分析最终强调五NETosis-related lncRNAs HNSCC病人(图最佳预后因素1 (c))。lncRNA签名(AC079336.5 LINC00623、AC087752.4 AL645933.2,和LINC00426)揭幕雇佣至少AIC分数(表2)。风险评分的计算基于签名按以下公式: 。然后,每个病人的训练集得到了风险评分根据公式。评分的患者在训练集是高风险( )和低风险( )组与风险评分中位数的值。风险组之间没有明显的差异出现在年龄、性别、吸烟状态和肿瘤的阶段,而HPV阳性和3 - 4年级更常见的低风险组( 和 ,)(表3)。生存的结果、风险状态和表达谱lncRNAs每个病人的记录数据2(一个),2 (c),2 (e)分别与高危患者记录的生存概率和较低的低风险的患者。此外,操作系统缩短了高危患者就是明证kaplan meier方法(图2 (g), )。签名记录关于1操作系统重要的预测作用,2年操作系统,和3年OS的AUC ROC分析为0.711,0.710,和0.672,分别(图2(我))。

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图1
建设的头颈部鳞状细胞癌的预后模型(HNSCC)患者。(一)12 NETosis-related lncRNAs选择最绝对的收缩和选择算子(套索)回归模型根据最低标准。(b)的系数NETosis-related lncRNAs被套索回归计算。(c)森林地块之间的多变量Cox回归分析的结果显示5 NETosis-related lncRNAs HNSCC总生存期(OS)。
表2
签名被确定基于最低Akaike信息准则(AIC)。
表3
签名和临床病理表现之间的联系。
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图2
的预后性能NETosis-related lncRNA队列训练和验证群签名。(一)风险得分的分布训练队列。(b)的风险分数的分布验证队列。(c)散点图显示是否样品还活着的训练队列。(d)散点图显示是否还活着的样品验证队列。5 (e)表达式的热图NETosis-related lncRNAs训练队列。5 (f)表达式的热图NETosis-related lncRNAs验证队列。(g) kaplan meier对患者的总体生存曲线在高和低风险组训练队列。(h) kaplan meier对患者的总体生存曲线在高和低风险组验证队列。(我)时间ROC曲线下面积(AUC)时间的接受者操作特征(ROC)曲线验证了预后风险评分的准确性训练队列。 (j) AUC of time-dependent ROC curves verified the prognostic accuracy of the risk score in the validation cohort.
3.4。确证lncRNA签名的验证队列

验证的准确性NETosis-related lncRNA签名,验证群体带来的风险评分的计算用于训练队列。在相同的行,随之而来的验证组患者,高风险的分类( )和低风险( )组(表3)采用上述的截止值。如表所示3没有明显的差异,两组记录年龄、性别、吸烟状态和肿瘤分级,而HPV阳性和舞台我更常见的低风险患者( 和 ,分别)。生存的结果、风险状态和lncRNA概要图2 (b),2 (d),2 (f),分别。类似的低风险病人组升高生存的示范与后者示范的高危患者减少操作系统就是明证kaplan meier方法(图2 (h), )。签名记录显著预测作用1操作系统,中国开放的操作系统,和3年OS AUC为0.631,0.652,和0.673,分别(图2 (j))。

3.5。独立运作HNSCC lncRNA签名的预后

多变量Cox回归的确定我们lncRNA签名作为HNSCC预后的独立因素(训练队列: , , ;验证队列: , , ,)(图3(一个)和3 (b))。ROC曲线分析探索其特异性和灵敏度记录签名的AUC的力量训练和验证组0.711和0.631,分别超过剩余的因素探索(数据3 (c)和3 (d))。因此,我们NETosis-related lncRNA签名函数可以作为一个独立HNSCC患者的预后预测的工具。

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图3
独立的预后价值NETosis-related lncRNA队列训练和验证群签名。(一)多变量Cox回归分析的结果对操作系统的训练队列。(b)多变量Cox回归分析的结果对操作系统的验证队列。(c)时间ROC曲线下面积(AUC)接受者操作特征(ROC)曲线相比,预测精度的风险评分等临床病理的训练队列。(d) AUC ROC曲线相比,预测精度的风险评分等临床病理的验证队列。
3.6。预测计算图表:开发和确证

为生存提供一个有用的预测模型的概率HNSCC病人,列线图包括临床特征和风险评分了。作为多变量Cox回归分析表明临床特征包括阶段,年龄,和风险评分作为独立因素,诺模图是采用构造阶段,年龄,和签名(图4(一))。操作系统的预测(1年、3年和5年)意味着一个预后列线图的建设包括所有的独立因素分辨全面、直观地描绘一个风险评估系统。操作系统采用的衡量nonogram通过校准曲线见图4 (b)。引人注目的协议被操作系统预测nonogram和真实值在不同随访期。的稳定性和准确性我们列线图包括lncRNA签名与临床特征可以预测个体病人的结果,因此临床医生和病人带来好处。

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图4
建立和验证预测患者的总生存期的诺模图。(一)列线图的情节是建立基于风险评分,年龄和阶段在整个队列。(b)校准曲线的诺模图。
3.7。GSEA为重要途径得分

探索潜在的信号通路或功能NETosis-related lncRNAs HNSCC,我们应用基因集富集分析(GSEA)两组。正如上面阐明的,这就意味着必须得分两组采用GSEA KEGG通路记录变化的分析。基因在粘着斑的upregulation出现,ECM受体相互作用,在高危病人组和肌动蛋白细胞骨架调节(图5(一个))。低风险数据集记录的炫耀性upregulation抗癌免疫途径包括B细胞受体,T细胞受体和Fcε国际扶轮信号、自然杀伤细胞介导细胞毒性和原发性免疫缺陷和趋化因子信号通路(图5 (b))。结果的KEGG NETosis-related lncRNAs建议高危组患者更可能表现出肿瘤转移和预后差,虽然抗癌免疫途径的upregulation低风险病人设置显示免疫状态不利于肿瘤生长和更好的预后。

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图5
基因集富集分析(GSEA)的两组根据NETosis-related lncRNA预后签名。(a) GSEA结果显示显著的浓缩葡萄糖和蛋白质代谢途径的高危头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者。(b) GSEA结果显示显著富集低风险HNSCC免疫调节通路与癌症的病人。
3.8。免疫治疗的结果由国际学院在整个风险NETosis状态和组

调查之间的关系NETosis-related lncRNAs和免疫状态,各种算法概述一节中提到的材料用来探测和途径的免疫细胞在两种风险组,显示显著差异的比例不同的肿瘤浸润免疫细胞之间的低风险和高风险组(图6(一))。此外,CIBERSORT促进免疫细胞浸润的源头。如数据所示6 (b)和6 (c),高危组记录了明显减少天真的B细胞,浆细胞、CD8 + T细胞,滤泡辅助T细胞,调节性T细胞,γ和δT细胞,和休息和激活肥大细胞与低风险病人组;然而,休息NK细胞的比例和M0巨噬细胞明显高于在高危组。

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图6
免疫细胞浸润景观在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。(一)热图免疫细胞渗透景观根据CIBERSORT CIBERSORT−ABS、QUANTISEQ,伊势亚,MCPcounter,史诗,定时器算法在高和低风险组。只有项目将显示显著差异; 值< 0.05控制。(b) Barplot肿瘤浸润细胞的比例根据CIBERSORT算法。(c)小提琴情节显示不同组织之间的不同比例的肿瘤浸润细胞基于CIBERSORT算法。

然后,免疫功能在两组之间的差异进行了比较。明显不同的两组人示范ssGSEA等T细胞功能检查点(抑制),细胞溶解的活动,HLA,炎症状态,T细胞coinhibition, T细胞聚集有关,表明低风险组的记录升高(图T细胞功能7(一))。基于上述考虑,低风险组可以分配合理的“热肿瘤”示范高免疫检查点(抑制)的增强免疫细胞浸润和免疫反应。我们的预后签名是低风险组的增强效果的示范学院疗法。免疫分子检查站概要文件被两组得分。我们发现,低风险组记录PDL1升高(CD274) CTLA4, IDO1, LAG3记录和高危病人组(图7 (b))。

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图7
Barplot表明低风险组和高危人群表现出不同的免疫状态。(一)Single-sample基因集富集分析(ssGSEA)免疫功能之间高低头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)高危人群。(b)免疫检查点之间的表达水平高低HNSCC风险组( , ,和 )。

进一步探索NETosis分数患者免疫治疗的预后价值,首先,我们确认患者的高危人群HNSCC NETosis更高的分数通过使用“GSVA”包,显示激活的NETosis高危组和低风险组(图8(一个))。然后,我们执行ssGSEA利用NETosis基因面板与免疫治疗两组管理采用“GSVA”包在材料和方法来计算单个样本的NETosis得分。样本分类后的高和低分数采用中位数得分值,患者记录更好的生存姿态NETosis分数降低时(数据8 (b)和8 (c))。这表明低风险组根据我们NETosis-related lncRNA签名NETosis得分较低和更好的生存在收到银行独立委员会疗法。这些记录也确证的结果的可能影响我们NETosis-related lncRNA签名预测拟合银行独立委员会将在这些患者。

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图8
NETosis分数患者免疫治疗的预后价值。(一)ssGSEA是用来计算的水平NETosis高风险和低风险之间的组。(b) kaplan meier曲线患者的总体生存的大卫·a·布劳恩et al。透明细胞肾细胞癌组。(c)患者的总体生存的kaplan meier曲线(Sanjeev Mariathasan et al .移行细胞癌组。

总而言之,免疫细胞之间的连接状态和NETosis得分与这种lncRNA签名出现高危人群可能记录的差别减少免疫细胞浸润和活动对这些免疫分子检查站降低生存post-ICB治疗而不是低风险人群。NETosis-related lncRNAs-NETosis-antitumor免疫可能是一个信号级联,这可能为未来铺平道路小说HNSCC患者的治疗方法针对恶性肿瘤。

3.9。得分的化疗反应NETosis-Related lncRNA签名

进一步调查的价值我们lncRNA签名的病人接受不同的化疗方案,“pRRophetic”的方法来预测化疗反应高危人群。减少估计集成电路50被记录的低风险患者和高危的这些化疗药物:AKT抑制剂八世、依托泊苷、物抑制剂八世,二甲双胍,甲氨蝶呤,雷帕霉素,紫草素,vorinostat和elesclomol(数据吗9(一个)- - - - - -9(我))( )。实验结果表明,在高危人群有贫穷的结果与低风险病人当收到以上化疗方案。

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图9
评估风险模型的化学敏感性。模型表明,低风险的分数降低一半抑制向心性(IC50)等化学疗法(a) AKT抑制剂,(b)依托泊苷(c)物抑制剂V (d)二甲双胍,(e)甲氨蝶呤,雷帕霉素(f) (g)紫草素,vorinostat (h),(我)elesclomol。
3.10。体外lncRNA表达式从我们NETosis-Related lncRNA签名

有五个lncRNAs预后模型,其中四个是保护性因素,一个是一个风险因素。高危组记录表达升高的危险因素减少表达式的保护性因素。这也导致肿瘤细胞系是否文档类似的表达式为高危人群。我们比较不灭的鼻咽上皮细胞系(NP69)和人类鼻咽癌细胞系CNE1、HNE1和TW03)。正如我们上面所描述的那样,保护性因素包括AC079336.5 AC087752.4, AL645933.2,和LINC00426, LINC00623是一个风险因素。qPCR显示降低表达LINC00426 CNE1、HNE1,比NP69 TW03和降低表达AC079336.5和AL645933.2 CNE1和TW03 NP69相比,虽然LINC00623的表达水平不一致在控制细胞和肿瘤细胞系(数字10 ()- - - - - -10 (d))。以上结果在一定程度上反映了我们的模型的可靠性。

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图10
lncRNA表达式从我们NETosis-related lncRNA签名。(一)mRNA的表达在不同的细胞系LINC00426。(b)的mRNA表达LINC00623在不同的细胞系。(c)的mRNA表达AC079336.5在不同的细胞系。(d)的mRNA表达AL645933.2在不同的细胞系。
3.11。验证lncRNA在体外增殖和迁移的影响

进一步调查LINC00426的角色,我们测试了LINC00426的影响在人类鼻咽癌细胞株的增殖和迁移overexpressing的瞬时转染质粒。信使rna的表达被qPCR评估。然后,我们调查是否抑制细胞增殖和迁移在LINC00426超表达的鼻咽癌细胞系细胞(CNE1和SUNE1)。然而,细胞增殖化验表明,过度LINC00426并不影响细胞的生存能力比消极组(图S2A和图S2C)。后也没有改变集落形成能力过度LINC00426 CNE1和SUNE1细胞(图开通和图S2D)。此外,伤口愈合试验还表明,过度的LINC00426并不影响迁移CNE1和SUNE1细胞(图的能力S2E和图S2F)。

3.12。LINC00426有助于刺信号通路

lncRNA我们建立的预测模型不仅能够预测患者的预后也识别“热”和“冷”肿瘤。因此,我们试图探索体外lncRNA调节免疫的可能性。我们假设LINC00426调节免疫细胞浸润;我们在CNE1和SUNE1细胞过表达LINC00426(数字(11日)和11 (c)),发现cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路的表达。LINC00426过表达的数据表现出显著增强p-STING p-TBK1, p-IRF3蛋白质含量CNE1和SUNE1细胞(数字11 (b)和11 (d))。刺的激活信号通路是进一步促进细胞因子的分泌,如CXCL10 CCL5, ISG15, ISG56,从而招募B细胞,T细胞,促进免疫细胞的渗透。这些数据在一定程度上解释我们的预测模型在预测的作用“热”和“冷”肿瘤。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
(d)
图11
刺的变化信号pathway-related蛋白质在不同细胞系转染有或没有LINC00426超表达质粒。(一)mRNA的表达LINC00426 CNE1细胞。注册会计师(b)免疫印迹,TBK1,刺痛,IRF3 CNE1细胞。(c)的mRNA表达LINC00426 SUNE1细胞。注册会计师(d)免疫印迹,TBK1,刺痛,IRF3 SUNE1细胞。

4所示。讨论

据我们所知,我们的研究是第一个探测器NETosis-related lncRNA签名来预测HSNCC预后和组一组病人分为高风险和低风险组。明显增加抗癌免疫途径被记录在低风险组功能富集分析。同时,密切联系为我们lncRNA签名与免疫细胞浸润和NETosis HNSCC概要文件。阐述,免疫“冷”形象出现在高危人群,包括免疫细胞浸润和活动减少、检查点和抑制免疫分子表达,而免疫“热”形象出现在低风险组。我们签名的公认的潜力也证实在两组患者接受银行独立委员会证明ssGSEA预测银行独立委员会的相关性的病人。响应的有效预测选择化疗药物的签名也记录在HNSCC病人。

的参与lncRNAs NETosis已被证实在几项研究。例如,李等人报道,一个upregulation IL-12A由于lncRNA X-inactive特定记录通过绑定miR-21刺激NETosis和加速原发性移植物功能障碍后肺移植(36]。高、张记录,减少lncRNA MINCR抑制NETosis和参与LPS-evoked急性损伤和炎症反应37]。然而,很少有研究阐明lncRNAs与NETosis瘤形成,此外HNSCC。有很多研究专注于找出NETosis-associated基因;我们采用皮尔逊相关分析这些基因和lncRNAs识别NETosis-related lncRNAs,最初导致113 NETosis-associated lncRNAs,认为与单变量Cox回归HNSCC患者的生存。进一步分析了缩小五NETosis-related lncRNAs: AC079336.5, LINC00623, AC087752.4 AL645933.2, LINC00426。这5个lncRNAs的预后签名,LINC00426参与肿瘤形成记录。例如,mir - 455 - 5 - p的规定由LINC00426提高肺腺癌进展了(38),而LINC00426在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中表达下调,与不良预后相关(39]。另一项研究证明,LINC00426对阿霉素抗性,骗取mir - 4319在骨肉瘤40]。我们的研究结果表明,LINC00426 HNSCC细胞系中调节刺信号通路,这表明,先天免疫激活(41]。我们的数据在一定程度上解释我们的预测模型在预测的作用“热”和“冷”肿瘤,这说明我们的模型是可靠的。对剩下的四个NET-related lncRNAs (AC079336.5, LINC00623 AC087752.4, AL645933.2),研究他们的参与癌症尚未记录。我们不能验证的功能内的其他四个lncRNAs严重限制的时间和金钱。

NETosis参与肿瘤发生和治疗方法正在被记录在几个报告。NETosis导致净释放,细胞死亡的定义包括活性氧特别是在造血细胞起源(8]。刺激了几个信号级联然后NETosis生产肿瘤包括恶性肿瘤本身与白细胞和血小板等血液细胞,建立炎症微环境促进肿瘤进展(42]。如前所述,这个过程的参与和NETosis-related lncRNAs HNSCC免疫微环境的认股权证的审查。这工作记录减少至关重要的免疫途径参与抗肿瘤作用就像自然杀伤细胞的细胞毒性,B细胞/ T细胞受体信号和高架NETosis高危人群的相关分析。这是暗示的似是而非的抗肿瘤免疫和NETosis HNSCC之间的联系。张等人证明了招募中性粒细胞触发NETosis IL17排除细胞毒性CD8 T细胞在胰腺导管腺癌。有趣的是,净抑制受体动物模型中的记录与精氨酸deiminase 4基因(酶PAD4,极其参与调停NETosis从中性粒细胞)删除有更好的应对银行独立委员会在这些小鼠系统新兴与那些PAD4表达和演示网在肿瘤微环境43]。另一项研究发现了免疫细胞毒性的抑制免疫细胞目标网通过细胞接触损伤和抑制NETosis通过药物抑制PAD4增强肿瘤敏感性PD-1 + CTLA-4双重检查点封锁在一个同源的乳腺癌的老鼠模型(9]。这些结果揭示了一个强大的协会NETosis与抗肿瘤免疫力,这与我们的结果是相一致的。

为了证明迄今未知方面的免疫细胞浸润和NETosis HNSCC,前者是审查使用前面列出的算法。明显减少细胞毒性细胞包括天真的B细胞的渗透和CD8 + T细胞出现在高危患者和低风险的病人。减少高危人群也示范的免疫分子表达检查站因此标记为免疫“冷”肿瘤有可能限制银行独立委员会的反应治疗记录了我们lncRNA签名。为了证实了这种可能性,进行功能富集分析,表明抗癌免疫途径在低风险的显著调节HNSCC组。此外,调查的人群与我们NETosis-associated lncRNA签名出土一个增广生存post-ICB低风险患者的治疗。这些观察是指示性的假定的影响我们NETosis-related lncRNA签名ICB响应预测在未来进一步指导治疗的病人。

NETosis出现在高危人群的增加受到“GSVA”包的分数。这让我们假设一个增强应对银行独立委员会通过刺激免疫细胞治疗在这组渗透通过煞有介事地抑制这种NETosis高危人群。NETosis在抗肿瘤免疫的作用被不断发掘工作。抑制NETosis与抗肿瘤免疫密切相关。我们的研究提供了理论基础,高风险HNSCC患者可能受益于银行独立委员会的组合NETosis抑制剂,抑制细胞NETosis和增加免疫细胞浸润增强应对ICB疗法。这个收益支持正在进行的试验探索并发NETosis抑制剂的功效与其他治疗策略。中性粒细胞/净系统的适用性和CXCR1/2引发通路接受作为治疗目标中心舞台给他们至关重要。并发管理学院和一些CXCR1和2抑制剂已被临床测试。例如,一个阶段我研究正在调查结合sx - 682 (CXCR1/2抑制剂)和nivolumab (anti-PD1)转移性胰腺导管腺癌(NCT04477343)。pembrolizumab并发管理(anti-PD1) navarixin (CXCR1/2抑制剂)在高级/转移性实体瘤接受第二阶段的研究(NCT03473925)[42]。我们的研究可能有助于提供线索来识别高危患者可能受益更多银行独立委员会和NETosis抑制剂的结合。

这项工作包含了一些限制。更多的体内或体外基本实验的证实的潜在分子机械方面NETosis-related lncRNAs预后。此外,迫切需要临床试验来确认是否抑制NETosis可以改善人类HNSCC患者免疫治疗的疗效。

总之,我们确定的适用性NETosis-based lncRNA签名HNSCC病人的预后。进一步变异的免疫细胞和免疫分子检查站表达式之间的高风险和低风险组也记录。我们的研究表明NETosis抑制可能成为战略增强HNSCC患者的免疫治疗的疗效。

缩写

另类投资会议: Akaike信息标准
AUC: 接受者操作特征曲线下面积时间
CYT: 溶细胞的活动
GSEA: 基因集富集分析
HNSCC: 头颈部鳞状细胞癌
人乳头状瘤病毒: 人类乳头状瘤病毒
银行独立委员会: 免疫检查点封锁
KEGG: 京都基因和基因组的百科全书
套索: 至少绝对收缩和选择算子
lncRNAs: 长非编码rna
网: 中性粒细胞胞外陷阱
NK: 自然杀伤细胞
操作系统: 总生存期
中华民国: 接受者操作特性
TCGA: 癌症基因组图谱。

数据可用性

RNA序列数据和病人的特点HNSCC患者来自TCGA的数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)。lncRNA和蛋白质编码基因注释在运用人类基因组浏览器GRCh38随之而来。p13 (http://asia.ensembl.org/index.html)。基因集富集分析(GSEA)是由GSEA软件(versionv4.1.0,http://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads)。

同意不是必需的。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益或个人关系可能出现影响工作报告。

作者的贡献

XH、ZL和XZ负责概念和设计。SL, YX负责数据采集。XH SL, ZL, XZ和RD负责数据分析和解释。SL、YX ZL, XZ和RD负责材料的支持。XH、ZL和XZ负责监督学习。YX负责体外实验。XH和SL写了初稿。最后一个版本是确保所有作者核准。小华,他Yinglu小和山刘贡献了同样的工作。

补充材料

补充1。表S1: 24 NETosis-associated基因被确定的文学。

补充2。图S1:我们研究的流程图。图S2: LINC00426在鼻咽癌细胞株的影响。(A)细胞增殖化验表明,LINC00426超表达并不影响CNE1细胞的可行性。(B)平板集落形成试验表明,LINC00426超表达并不影响在CNE1细胞集落形成能力。(C)细胞增殖化验表明,LINC00426超表达并不影响SUNE1细胞的可行性。(D)平板集落形成试验表明,LINC00426超表达并不影响在SUNE1细胞集落形成能力。伤口愈合试验表明,LINC00426超表达并不影响迁移的能力在CNE1 (E)和SUNE1 (F)细胞。