文摘gydF4y2Ba

轴向不对称生物行为的抗肿瘤药物前体(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba6-44)-acetatodiamminedichloridohydroxidoplatinum (IV),gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,深入调查并与类似对称Pt (IV)复合物,即dihydroxidogydF4y2Ba1gydF4y2Ba和diacetatogydF4y2Ba3gydF4y2Ba,也有类似的结构。复合物是测试小组的人类肿瘤细胞系。复杂的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示异常高细胞毒性(类似于顺铂)对他们的类似物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。减少他们的潜力,减少动力学、亲油性和膜亲和性进行了比较。细胞吸收和DNA platination Pt (IV)复合物的深入调查敏感人类卵巢癌细胞系A2780和在相应的抗A2780cisR副线。的意想不到的活动gydF4y2Ba2gydF4y2Ba似乎与其特殊的细胞相关的积累,而不是不同的还原率或不同的功效在DNA platination和/或细胞凋亡诱导的效率。虽然细胞吸收的确切机制尚未完全破译,一系列的天真的实验表明一个依赖资源,carrier-mediated运输:有机阳离子转运蛋白(10月)是可能的蛋白质参与。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

今天,系统性免疫治疗,抗癌治疗是面向目标的,目的是实现精密医学(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。然而,经典化疗药物,尤其是能损伤dna,仍然发挥重要作用在更激进的实体肿瘤的治疗,特别是在联合治疗。这些药物中,顺铂(即。,(竞购gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(NHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba),(gydF4y2BaSPgydF4y2Ba图4 - 2)-diamminedichloridoplatinum (II)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和S1补充材料)及其同行非常活跃对许多实体肿瘤但遭受严重的缺点如溶解度和稳定性差,缺乏选择性,导致严重的副作用,以及可能的内在或获得药物抗性(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

近几十年来,Pt (IV)衍生品已经代表了一个有趣的领域的研究。他们有一个low-spin dgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba八面体几何和表现出更高的动力学惰性,不水解或配体取代工党(II)的父母。他们几乎达到完整的肿瘤细胞,激活2 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba还原消除释放相应的Pt (II)细胞毒性剂和两个轴向配体,从而作为高活性化合物。Tetraplatin(也叫ormaplatin, (gydF4y2BaOCgydF4y2Ba第6 - 22)-tetrachlorido (cyclohexane-1gydF4y2BaRgydF4y2Ba,2gydF4y2BaRgydF4y2Ba二胺)铂(IV)), iproplatin [(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba新思维)bis (hydroxido) dichloridodiisopropylamineplatinum (IV)], satraplatin [(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba6-43)bis (acetato) amminedichloridocyclohexylamineplatinum (IV)],和LA-12 [(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba6-43)bis (acetato) (1-adamantylamine) amminedichloridoplatinum (IV))发展到临床前研究和临床试验,尽管他们已批准临床使用(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。此外,合理设计biaction或多作用Pt (IV)高活性化合物基于插入生物活性配体的轴向位置(通常通过羧酸盐功能),作为辅助药物(理想情况下协同与顺铂),改善他们的目标和细胞积累,生成或刺激免疫反应或antimetastatic活动,并经常克服Pt药物抗性(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在cisplatin-based Pt (IV)高活性化合物,我们更喜欢条款gydF4y2Ba对称的gydF4y2Ba当两个轴向配体是相同的gydF4y2Ba不对称的gydF4y2Ba当两个轴向配体是不同的,而不是gydF4y2Ba不对称gydF4y2Ba或gydF4y2Ba非对称gydF4y2Ba这意味着所有对称元素已经丢失。在前者情况下,添加相同的轴向配体维护gydF4y2BaCgydF4y2Ba_{2 vgydF4y2Ba}对称;在后一种情况下,双重轴和包含顺铂的对称平面单元丢失但飞机穿过两个轴向配体和角平分线原广场平面Pt (II)一半仍然存在。现在点组降低gydF4y2BaCgydF4y2Ba_{2 vgydF4y2Ba}来gydF4y2BaCgydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}和仍在非手性分子。不对称的Pt (IV)高活性化合物(在一个轴向位置官能团)已报告表现出生物活性相当于或高于对称(双官能团)。剩下的轴向位置被哦占领gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba或氯gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba配体,通常是最初出现在Pt (IV)合成纤维。毫无疑问,这种成功的药物前体asplatin或platin-A [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

也许,最突出的例子,这种看法是迄今为止由monochalcoplatin(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)非常更积极比对称同系物chalcoplatin,尽管其更高的亲油性和交付两个活跃的查耳酮分子从后者的能力(查耳酮是一种抑制剂的p53鼠标两分钟2通路)。例如,在人类卵巢癌细胞系A2780 monochalcoplatin显示83和132倍的增加细胞毒性chalcoplatin与顺铂相比,分别。有趣的是,这突出相关活动是有效的(但未定义)transport-mediated细胞吸收,以及一个“即时”还原活化的过程。monochalcoplatin,此外两个赤道chlorido配体的存在似乎是必不可少的以来引人注目的吸收oxaliplatin-based Pt (IV)模拟似乎被剥夺任何传输机制(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

事实上,在研究的三个简单cisplatin-based Pt (IV)复合物(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba新思维)-diamminedichloridodihydroxidoplatinum (IV) (gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba6-44)-acetatodiamminedichloridohydroxidoplatinum (IV) (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba新思维)-diamminedichloridodiacetatoplatinum (IV) (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),所有轴承轴向配体失去生物活性,不对称的复杂gydF4y2Ba2gydF4y2Ba出乎意料地比对称的同行更活跃吗gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,因此,澄清的总体情况,特别是细胞吸收机制可能不同,是必需的。gydF4y2Ba

与合理的亲油性分子通常容易交叉后的脂质双分子层膜浓度梯度(暧被动扩散)。另外,膜转运蛋白和膜通道蛋白可以支持药物的吸收剥夺了前面所提到的物理化学性质(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。共存的两种类型的药物吸收机制强调在几个评论(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

膜转运蛋白通常分为两个家庭:磷酸腺苷磁带(ABC)和溶质载体(SLC)。的SLC22总科分为三个亚科基于底物的性质:有机阳离子(10月),有机阴离子(OAT)和有机两性离子转运蛋白(OCTN)。特别是,OCT1 (SLC22A1) OCT2 (SLC22A2)和OCT3 (SLC22A3)被发现在金属药物的运输中发挥作用(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为原型的抗癌metallodrug顺铂,简单被动跨膜扩散最初提出作为唯一的吸收机制,尽管其低亲油性。然而,一些实验结果表明积极或运输导致顺铂催化吸收和显然是参与固有或获得性耐药gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。与顺铂涌入了转运蛋白(证据级别变量和正面或负面影响整体化疗效率):铜转运蛋白,特别是Ctr1 (SLC31A1),并在较小程度上,有机阳离子转运蛋白,10月gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。每个10月展览组织本地化;例如,OCT1同种型主要在肝脏,肾脏和OCT2主要是表示,而OCT3是广泛分布在许多组织。OCT2被认为是负责对顺铂诱导的肾毒性。此外,OCT1和OCT2似乎在几个结肠癌细胞和调节选择性细胞吸收,因此,铂在大肠癌癌的细胞毒性。最近,VRACs volume-regulated阴离子通道的作用,最出名的是他们的角色在细胞容积内稳态,假定在运输中顺铂及其Pt (II)副产品(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

尽管许多论文处理顺铂细胞积累的机理及其同系物(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba),很少有人了解Pt (IV)高活性化合物。定量构效关系研究,根据实验证据和细胞大部分Pt (IV)化合物的积累是严格依赖于他们的亲油性,这是一个重要的线索被动扩散(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。此外,它证明了质谱(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba新思维)-diamminedichloridodiacetatoplatinum (IV) (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)不是Ctr1的衬底(除非减少与抗坏血酸)通过其可能与模型交互运输蛋白质Mets7和Mnk1 [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。此外,顺铂深深地吸收减少A2780的细胞Ctr1铜转运体基因沉默。相比之下,吸收的亲脂性的Pt (IV) di-octanoato模拟的gydF4y2Ba3gydF4y2Ba在同一耐药细胞株几乎不变,然后明显独立于Ctr1表达式(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。几乎没有什么可用的报告在文献中描述的临床检测Pt (IV)高活性化合物通过10月:satraplatin 10月是一个温和的衬底A2780和HCT116(人类结肠腺癌)细胞(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba],而ormaplatin表现出高度的亲和力这些转运蛋白在人类胚胎肾(HEK)细胞,尽管低于铂本身(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

重要的是,Goschl等人建议积极的参与或促进细胞吸收的运输几Pt (IV)复合物,含有氯化物作为离开团体和甲基乙烯二元胺载体组在赤道平面上,基于Pt积累实验执行在低温条件下(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。不幸的是,很难产生深远的附着人体结肠腺癌SW480细胞ATP耗竭的工作不允许明确区分两种可能的机制:活跃的能量依赖性或促进然后实现能源独立的运输。gydF4y2Ba

在本文中,细胞毒性活动在人类肿瘤细胞系七个小组,包括有顺铂耐药性亚型,三个简单的cisplatin-based Pt (IV)模型gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)讨论了关于它的亲油性,膜亲和,还原电位和还原动力学。此外,在评估他们的吸收在正常和低温条件和选择性抑制剂的存在。最后,不同寻常的吸收gydF4y2Ba2gydF4y2Ba细胞系A2780和A2780cisR是暂时破译的基础上已知的顺铂转运蛋白基因的表达(Ctr1 10月)研究了rt - pcr。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。一般程序gydF4y2Ba

所有化学品(σAldrich-Merck或阿尔法Aesar-Thermo费舍尔科学,他们另有规定除外)被用作收到并没有进一步净化。配合物(gydF4y2BaSPgydF4y2Ba4 - 2)-diammine dichlorido铂(II)(顺铂)gydF4y2Ba55gydF4y2Ba),(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba新思维)-diamminedichloridodihydroxidoplatinum (IV) (gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba),(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba6-44)-acetatodiamminedichloridohydroxidoplatinum (IV) (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba),(gydF4y2BaOCgydF4y2Ba新思维)-diamminedichloridodiacetatoplatinum (IV) (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)准备和特征根据以前公布的程序。复合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba也获得在他们吗gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labeled形式使用相同的合成过程中,除了使用gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba标记为顺铂作为起始物料(见补充材料)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.2。与细胞溶质在溶液中稳定和减少gydF4y2Ba

配合物的稳定的解决方案gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(100gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)研究了老化72 h在37°C的化合物在黑暗中在同一细胞培养基用于A2780细胞系(即。,RPMI 1640中添加10%胎牛血清的边后卫)。色谱峰的面积的Pt复合物在HPLC-MS监控,使用70:30水HCOOH 15毫米和CH的混合物gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba哦,作为流动相(见部分gydF4y2Ba2。3gydF4y2Ba、设置gydF4y2Ba我gydF4y2Ba),为进一步详细信息)。应急服务国际公司质谱,记录使用锥和毛细管+ 30 V的电压(正离子模式)和2.70 kV,被用来确定物种的身份。gydF4y2Ba

研究减少gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labeled复合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba、新鲜细胞溶质从大约2×10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaA2780细胞使用FractionPrep工具包(美国BioVision苗必达,CA)和遵循制造商的指示。的减少意味着行为监控gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN] HSQC(异核单量子关联)核磁共振测量。特别是,复合物溶解(3毫克)在9:1 A2780细胞的胞质提取和D的混合物gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO(500年第四卷gydF4y2BaμgydF4y2BaL)。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN] HSQC光谱被记录在300 K力量皇冠三世NMR谱仪操作在500 MHz (gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH)与标准力量序列hsqcetgpsiz(0.2秒采集一次,8扫描,1.3年代放松延迟,和128 FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba分)(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.3。色谱索引gydF4y2Ba

保留时间,gydF4y2BatgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba,测量两列:(i)标准的CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba列(Phenomenex Phenosphere-NEXT 250×4.6毫米,5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)和(2)一个IAM.PC.DD。2column (Regis, 10 cm × 4.6 cm, 10 μgydF4y2Ba300包装孔隙大小),由共价结合cell-membrane-forming磷脂二氧化硅。(我),每个复杂的色谱进行(0.25毫米)在固定洗脱液成分(30%甲醇/水15毫米甲酸70%;流量0.5毫升·分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})使用水域HPLC-MS仪器(配备一个联盟2695年分离模块,2487双λ吸光度检测器,和3100质量检测器)。紫外可见检测器是设定在210海里。在(2)中,流动相由20毫米在pH值6.9和乙腈乙酸铵缓冲流动1毫升·分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。样品溶解在流动相在50 - 100的浓度范围gydF4y2BaμgydF4y2Bag·毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。瓦里安一个高效液相色谱ProStar仪器配备410 autosampler PDA 335 LC检测器,色谱数据系统版本号1.9.302.952使用。gydF4y2Ba

不同的gydF4y2BatgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba年代是用来计算日志gydF4y2BakgydF4y2Ba′,保留因子的对数gydF4y2BakgydF4y2Ba′= (gydF4y2BatgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba−gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)/gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba是列死时间(即。,gydF4y2BatgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba氯化钾或柠檬酸作为内部参考(i)和(ii),分别)[gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在我的情况下,日志gydF4y2Ba是由一个外推法计算值。日志gydF4y2Bak′gydF4y2Ba值确定至少三种不同比例的乙腈(gydF4y2BaϕgydF4y2Ba)在移动阶段(从10到50%,v / v),和截距值的线性对数之间的关系gydF4y2Bak′gydF4y2Ba和gydF4y2BaϕgydF4y2Ba值被假定为日志gydF4y2Ba(gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

极地表面积(PSA)的复合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba根据以前公布的程序(已计算gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.4。细胞培养gydF4y2Ba

化合物在调查中被测试了一组商业人类癌症细胞系:卵巢endometrioid腺癌A2780 (ICLC HTL98008),其有顺铂耐药性变异A2780cisR (ECACC 93112517),结肠癌HCT 116 (ECACC 91091005),乳腺浸润性导管癌MCF7 (ECACC 86012803),胚胎性癌NTERA-2克隆D1(也称为NT2 / D1, ICLC HTL97025),和肺腺癌A549 (ICLC HTL03001)。此外,细胞系来源于患者的胸腔积液治疗恶性胸膜间皮瘤(MPM)添加到面板上,也就是说,MM98(肉瘤样的表型)[gydF4y2Ba68年gydF4y2Ba]。商业细胞从欧洲购买的验证细胞培养(英国ECACC)或Interlab细胞系(ICLC、热那亚、意大利)集合,而MM98细胞系获得病理学国立医院单位的亚历山德里亚(意大利)。gydF4y2Ba

下面的媒体被用来种植细胞:RPMI 1640 (A2780、A2780cisR NT2 / D1和A549细胞),DMEM (MCF7细胞)、DMEM补充了不必要的氨基酸(MM98细胞),和本人的5 a (HCT 116个细胞)。所有媒体包含谷酰胺(2毫米)和添加青霉素(100 IU·毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})、链霉素(100 mg·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}),10%热灭活的边后卫。维持A2780cisR抵抗细胞,顺铂(1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)添加到中每两个段落。gydF4y2Ba

连续治疗(CT)进行了37°C调湿室有限公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。顺铂是溶解在0.9% w / v氯化钠溶液和盐酸带到pH = 3(最终股票浓度1毫米)。Pt (IV)复合物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba溶解在水里milliQ(最终股票浓度5毫米)和存储−20°C。股票集中确认与电感耦合等离子体质谱法(icp)测量。母亲的解决方案在完全培养基稀释到所需的浓度。gydF4y2Ba

评估的生长抑制作用的化合物在接受调查,测试(即细胞生存能力。使用、刃天青减少试验)。总之,2 - 5×10gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba细胞每口井(根据细胞系)被播种在黑色无菌组织culture-treated 96 -孔板。结束的时候治疗(72 h),可行性评估100年gydF4y2BaμgydF4y2Bag·毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}刃天青(记述化工、法国)在一个全新的媒介1 h 37°C,和减少产品的数量,resorufin,是通过测量荧光(励磁gydF4y2BaλgydF4y2Ba= 535海里,发射gydF4y2BaλgydF4y2Ba= 595海里)Tecan无限F200Pro板读者(Tecan、奥地利)[gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba]。在每个实验中,细胞与药物挑战候选人在不同浓度,最后数据计算从至少三个复制相同的实验一式三份。8井包含中没有细胞的荧光被用作空白。荧光数据归一化细胞生存能力参与细胞的100%。half-inhibiting浓度(ICgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba),定义为药物的浓度,降低细胞生存能力50%,得到的剂量反应乙状结肠使用起源Pro (version 8, Microcal软件公司,北安普顿,妈,美国)。gydF4y2Ba

2.5。细胞积累gydF4y2Ba

A2780和A2780cisR细胞被播种在10毫米培养皿和挑战复合物进行调查(10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)在完全培养基4 h。结束时的曝光,与PBS细胞被洗了三次,脱离培养皿用0.05%胰蛋白酶1 x + 2% EDTA (HyClone,热Fisher),和收获在一个完全新鲜的媒介。自动细胞计数装置(伯爵夫人®,生活技术)是用来测量所必需的每一个细胞的数量和平均直径来计算平均细胞体积(球)。gydF4y2Ba

分析Pt积累,细胞被转移到一个硼硅玻璃管和离心5分钟在室温下的1100 rpm。上层清液小心被愿望,而大约200人gydF4y2BaμgydF4y2BaL的上层清液被限制细胞损失。细胞颗粒被储存在−80°C到矿化。gydF4y2Ba

铂含量的确定是由icp(热Optek X系列2)。矿化是由w / w HNO增加70%gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba每个样本(除霜之后),其次是孵化1 h 60°C的超声波浴。在icp测定之前,HNOgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba稀释的最终浓度为1%。仪器的设置进行了优化生产铂金敏感性最高,最丰富的Pt和同位素(作为内部标准)量化gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba195年和115年,分别。gydF4y2Ba

Pt发现细胞的数量和归一化细胞数量(细胞积累Pt)表示为ng每10 PtgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞。平均细胞体积,计算出每个样本的实际平均细胞直径测量(约12gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),被用来获得10的体积gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba最后,细胞和细胞内Pt浓度。100年,在治疗时间为零gydF4y2BaμgydF4y2BaL的介质被从每个样本来验证细胞外Pt浓度。细胞内之间的比例和实际浓度细胞外被定义为积累比,基于“增大化现实”技术(gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba]。Pt内容的控制实验,描述在整个过程中,任何可能的Pt污染在统计学上并不显著的细胞Pt累计治疗期间,即使在A2780cisR的情况。gydF4y2Ba

实验与抑制剂进行了37°C如下:(i)南gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba+ 2-deoxy-D-glucose (2 dg):预培养30分钟在PBS南25毫米gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba和25毫米2 dg,紧随其后的是一个10gydF4y2BaμgydF4y2BaM CT与Pt化合物在厄尔的平衡盐溶液(ebs) 1 h;(2)甲氰咪胍(CMT): coincubation 1.5毫米CMT和10gydF4y2BaμgydF4y2Ba在ebs M Pt化合物1 h;(3)1-methyl-4-phenylpyridin-1-ium (MPP)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与2.0毫米MPP): coincubationgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和10gydF4y2BaμgydF4y2Ba在ebs M Pt化合物1 h;(iv)细胞松弛素D (CTD):预培养在ebs 10 30分钟gydF4y2BaμgydF4y2BaM仪,其次是10gydF4y2BaμgydF4y2BaM在ebs CT与Pt化合物1 h;(v) O-benzylserine (BS): coincubation 1.0毫米BS和10gydF4y2BaμgydF4y2Ba在ebs M Pt化合物4 h;(vi)乌本苷(OUA):预培养1 h与1毫米OUA ebs,其次是10gydF4y2BaμgydF4y2BaM CT与Pt化合物在ebs 4 h;(七)四乙铵氯化物(茶):预培养1 h和2.0毫米茶10紧随其后gydF4y2BaμgydF4y2BaM在ebs Pt化合物4 h。低温实验,A2780细胞preincubated 2 h在4°C,其次是CT与每个Pt化合物(10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)4 h。在所有情况下,CT,描述的细胞被操纵在前面的段落。gydF4y2Ba

2.6。DNA PlatinationgydF4y2Ba

细胞被播种在175厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba烧瓶和治疗24 h复合物在调查中(10gydF4y2BaμgydF4y2BaM)如前所述。从这个示例中,大约5×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞被取出的细胞积累分析(参见上一节),而约20×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞DNA platination分析。gydF4y2Ba

platination DNA分析,细胞被转移到一个塑料管和离心5分钟在室温下的1100 rpm。上层清液小心被愿望,和细胞颗粒被储存在−20°C到总基因组DNA提取的一个商业设备(PerfectPure培养的哺乳动物细胞,5 Prime-Eppendorf),遵循制造商的指示。总之,在细胞溶菌作用,DNA纯化了治疗与核糖核酸酶和蛋白酶K,然后提取硅基离心列。gydF4y2Ba

洗后,DNA在300年被筛选了gydF4y2BaμgydF4y2BaL(洗脱缓冲。一个数量的8gydF4y2BaμgydF4y2BaL样品或洗脱缓冲(作为空白)稀释在TE缓冲(10毫米Tris-HCl、1毫米EDTA和pH值8.0)到80年gydF4y2BaμgydF4y2BaL,对应的路径长度0.5厘米将微型板块一半区域井(UVStar®,他一一Bio-One)。吸光度在260 nm (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}相对于核酸)和280 nm (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}相对于蛋白质),一式三份从井中被记录。gydF4y2Ba

为每一个好了,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}和gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}被减去背景校正,然后样品的纯度是验证通过的gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}来gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{280年gydF4y2Ba}比率。后减去均值gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}从空白的井,DNA浓度计算的修正gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_{260年gydF4y2Ba}使用校准曲线获得与小牛胸腺DNA。在这种情况下,1单元260海里的吸光度对应于100年gydF4y2BaμgydF4y2Ba克每毫升DNA。其余的DNA洗脱缓冲被转移到一个硼硅玻璃管,和其精确的体积是由重量计算的DNA总量,然后储存在−20°C到矿化。gydF4y2Ba

Pt绑定到DNA(实验的数量gydF4y2Ba )gydF4y2Ba表示为pg Pt /gydF4y2BaμgydF4y2Bag的DNA实验发现。考虑到女性二倍体细胞核含有6.55一百万人gydF4y2BaμgydF4y2Bag的DNA, DNA-bound Pt的总量乘以每百万细胞实验gydF4y2Ba6.55 (gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。因此,细胞内的百分比Pt绑定到DNA (gydF4y2Ba )gydF4y2Ba被定义为platination和细胞之间的比率积累,纠正了相关因素的细胞DNA含量:gydF4y2Ba

2.7。半胱天冬酶3活动gydF4y2Ba

A2780细胞(20×10gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)在96年被播种,TC板治疗的前一天,执行10gydF4y2BaμgydF4y2BaM Pt化合物的浓度。24小时后,一些照片由一个反向对比阶段显微镜拍摄(徕卡DMIL领导)。细胞被洗ebs和细胞溶解在冰上25gydF4y2BaμgydF4y2Ba消息灵通的M裂解缓冲(10毫米,2毫米EDTA, 2毫米德勤,0.1%的家伙,和pH值7.4)。半胱天冬酶抑制剂Ac-DEVD-CHO 3/7 (gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO)添加到控制井的浓度为0.01 g·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。然后,200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL caspase-3荧光底物,Ac-DEVD-AFC (gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin, 0.01 g·LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在裂解缓冲),添加到所有井,混合和200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL(每个样本都被转移到一个黑色的微量滴定板。活动后1 h,通过荧光激发gydF4y2BaλgydF4y2Ba= 390海里,发射gydF4y2BaλgydF4y2Ba= 520海里,规范化的空白(gydF4y2Ba71年gydF4y2Ba]。最后计算折叠活动对控制井和规范化对剩余生存能力。gydF4y2Ba

2.8。RNA隔离和rt - pcrgydF4y2Ba

用硫氰酸胍盐法提取总RNA (gydF4y2Ba72年gydF4y2Ba]。从等量的RNA,互补脱氧核糖核酸合成使用RevertAid -逆转录反应合成第一链cDNA工具包(Fermentas-Thermo科学,伯灵顿,加拿大),使用随机五个一作为引物,根据制造商的指示。一笔20 ng cDNA被用来执行rt - pcr扩增的信使rna。Ctr1的引物5′-CTGCTGCGTAAGTCACAAGTCAG-3′(向前),5′-TATGACCACCTGGATGATGTGC-3′(反向);OCT1: 5′-ACTCCGCTCTGGTCGAAATC-3′(向前),5′-CGACATCGCCGCAAAACAT-3′(反向);OCT2: 5′-ACTCTGCCCTGGTTGAATTC-3′(向前),5′-GCAACGGTCTCTCTTCTTAG-3′(反向);OCT3: 5′-CAGAGATCACTGTTACAGAT-3′(向前),5′-GATAGCTCCTTCTTTCTGTC-3′(反向)。18 s rRNA被用作参考基因。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。抗增殖活性和理化参数gydF4y2Ba

基于其结构,中间的人之间gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba2gydF4y2Ba预计将无效作为抗增殖剂,它的副产品。然而,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,包括在常规进行可行性测试在我们的实验室中,令人惊讶的是表现出非凡的力量(10 - 100倍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)对人类癌症细胞系(表的面板gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。普通集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(2.91gydF4y2BaμgydF4y2BaM)大致类似于顺铂(2.72gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)在野外细胞板。此外,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba部分能够绕过药物抗性有顺铂耐药性A2780cisR细胞系,射频的阻力因素(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)= 6gydF4y2Bavs。gydF4y2Ba射频(顺铂)= 13(射频集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2BaA2780cisR /集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2BaA2780)。gydF4y2Ba

的集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba的数据gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在所有的细胞系代表异常如果我们原因的被动扩散,由亲油性调制。事实上,亲油性的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba预计将之间的中间的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,仅仅通过比较三种配合物的化学结构。gydF4y2Ba

亲油性的化合物通常将辛醇和水所描述的分离系数,日志gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba这可以被定义为化合物的浓度之比之间的有机(gydF4y2BangydF4y2Ba辛醇)和水相。然而,其他更快的方法,如产物,经常被用来评估亲油性的shake-flask方法。在这种情况下,保留将分区之间的亲脂性的CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba链的固定相,水洗脱液gydF4y2Ba73年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba74年gydF4y2Ba]。因此,保留时间(gydF4y2BatgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba)的复合物是由CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba列使用70/30 (% v / v)水/甲醇混合作为洗脱液,和数据被表示为日志gydF4y2BakgydF4y2Ba′(gydF4y2BakgydF4y2Ba′= (gydF4y2BatgydF4y2Ba_RgydF4y2Ba−gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)/gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BatgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba列的列死时间)。测量日志的趋势gydF4y2Bak”gydF4y2Ba是gydF4y2Ba3gydF4y2Ba>gydF4y2Ba2gydF4y2Ba>顺铂>gydF4y2Ba1gydF4y2Ba如预期,基于复合物的结构,比hydroxido acetato配体更亲脂性的(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

人工膜固定化(IAM)色谱法是一种互补的技术评估药物与细胞膜的相互作用。在这种技术中,静止的硅相共价键的磷脂,给材料,比更简单更类似于细胞膜脂族链产物的列。日志gydF4y2Ba值(即。、日志gydF4y2Bak′gydF4y2Ba值推断完全水流动相)显示在同一趋势三个Pt (IV)复合物(日志gydF4y2Ba0.96 1.06 0.64 =−−−−0.83顺铂,gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(表分别)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

极地表面积(PSA),定义为所有表面极性原子,包括附加氢,可以用作亲油性的极性分量的描述符。一般来说,化合物与PSA≥140 AgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba应该表现出较差的细胞渗透(≤10%),而化合物与PSA≤60吗gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba显示高吸收(≥90%)gydF4y2Ba75年gydF4y2Ba]。PSA值计算得到的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba化合物(116、112和110gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba分别)证实,尽管规模不同,以前观察到的趋势(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。因此,中间细胞积累,然后中间platination DNA,然后从这些比较中间抗增殖能力是可预测的。gydF4y2Ba

高活性化合物,Pt (IV)复合物必须被激活gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,他们的还原电位可以提供信息还原过程的可行性,尤其是在outer-sphere机制(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba76年gydF4y2Ba]。然而,这可能不足以保证gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba减少,化学还原的动力学特征起着重要的作用,尤其是对于一个内在领域机制(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。有趣的是,潜在的峰值(gydF4y2BaEgydF4y2Ba_pgydF4y2Ba)的趋势是相反的动力学(gydF4y2BakgydF4y2Ba,请参阅gydF4y2BatgydF4y2Ba_½gydF4y2Ba值在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。实际上,这些Pt (IV)衍生品容易电化学还原的顺序gydF4y2Ba1gydF4y2Ba2gydF4y2Ba3gydF4y2Ba但易受化学还原monoascorbate(抗坏血酸的形式主要是出席生理pH值)的顺序gydF4y2Ba1gydF4y2Ba>gydF4y2Ba2gydF4y2Ba>gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。哦,配体的存在,而呈现电化学电位更负(少有利于减少outer-sphere),代表了一种有效的桥梁内在领域电子转移。整个场景是同意Wexselblatt和吉布森观察到类似的复合物(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba77年gydF4y2Ba]。虽然对gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba两个参数的趋势(gydF4y2BaEgydF4y2Ba_pgydF4y2Ba和gydF4y2BakgydF4y2Ba)是相反的,复杂的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba展示一个中间值在两个尺度。gydF4y2Ba

因此,为了揭示的可能影响生物活性的还原过程gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba减少,其稳定性研究在胞液中直接提取的细胞进行调查(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba79年gydF4y2Ba]。事实上,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labeled复合物,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban -gydF4y2Ba,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 3gydF4y2Ba在黑暗中,直接挑战与细胞溶质从A2780提取细胞,减少和他们的监视gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN核磁共振光谱学(参见图S2-S9,补充材料)。实际上,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN核磁共振光谱学提供信息对金属的氧化态和供体原子协调配体的性质,分析比允许更快和更敏感gydF4y2Ba^{195年gydF4y2Ba}Pt NMR。信号的合成gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-labeledgydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban -gydF4y2Ba,gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 3gydF4y2Ba配合物表现出30和−−40 ppm(之间的化学变化gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba80年gydF4y2Ba]。大约2 h后,(gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN] HSQC光谱,Pt (IV)的原始信号复杂几乎消失了(gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 1gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_3gydF4y2BaδgydF4y2Ba= -33.8 ppm和gydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2BaδgydF4y2Ba= 5.6 ppm;gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_3gydF4y2BaδgydF4y2Ba=−35.6 ppmgydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2BaδgydF4y2Ba= 6.0 ppm;gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 3gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_3gydF4y2BaδgydF4y2Ba= -39.6 ppm和gydF4y2Ba^1gydF4y2BaHgydF4y2BaδgydF4y2Ba= 6.4 ppm)。相反,新gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba峰在gydF4y2BaδgydF4y2Ba= -66.7 ppm,gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH峰在gydF4y2BaδgydF4y2Ba= 4.0 ppm (gydF4y2Ba^1gydF4y2BaJgydF4y2Ba_{Pt-NgydF4y2Ba}= 331赫兹和gydF4y2Ba^2gydF4y2BaJgydF4y2Ba_{Pt-HgydF4y2Ba}= 63 Hz)可以分配给顺铂。此外,其他较弱的信号出现在Pt (II)配合物的化学位移范围,对应于一个gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNgydF4y2Ba反式gydF4y2BaCl和一个gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNgydF4y2Ba反式gydF4y2Ba氧气。这些信号表明aquated Pt (II)物种的形成(见补充材料)gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

有效的减少时间以来gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(2 h)是可以忽略不计的时间表IC的评价gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba(72小时),不同的细胞毒性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba无法解释的不同速度对减少gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,差异经常调用其他cisplatin-based Pt (IV)配合(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在这个阶段,所有的实验数据似乎指向一个额外的比被动扩散吸收其他复杂的机制gydF4y2Ba2gydF4y2Ba只有。出于这个原因,一些实验是为了突出异常细胞毒性细胞吸收的可能作用。gydF4y2Ba

3.2。吸收实验A2780细胞gydF4y2Ba

在面板中使用的肿瘤细胞生存能力测试,人类卵巢endometrioid腺癌细胞系A2780被选为进一步机械的调查,因为它经常被用来测试几个铂配合物的细胞毒性。此外,A2780行非常敏感gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,它有顺铂耐药性亚系(A2780cisR)是商用。最后,10月(虽然在不同程度上)表达(某种程度上)这样一个细胞系在许多卵巢肿瘤(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。有趣的是,据报道Ctr1表达显著降低A2780cisR细胞相比,野生型敏感同行(gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

细胞顺铂和积累gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba后被评估使用icp技术4 h CT在37°C和表达为累积率(AR,细胞内和细胞外的Pt浓度)之间的比例(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba灰色酒吧)。gydF4y2Ba

复杂的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表现出一个意想不到的(完全基于亲油性)更高的基于“增大化现实”技术在4 h比gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,甚至高于顺铂,这表明被动扩散并不显著不同吸收的判别。有趣的是,顺铂还展示了一个基于“增大化现实”技术高于预测只是被动扩散的基础上,由于其较低的亲油性,但这可能是由于额外的贡献Ctr1传输机制(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba82年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

相同的实验是重复长期治疗(24小时)到达检测水平所需的DNA platination比较的目的,获得一个类似的趋势(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba,gydF4y2Ba83年gydF4y2Ba]。DNA platination由gydF4y2Ba2gydF4y2Ba再次复合物中最高gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba类似于顺铂,并联最高吸收和解释抗增殖活动;因此建议一旦内化和减少在胞质,所有cisplatin-based Pt (IV)复合物的反应是相同的代谢物的顺铂(gydF4y2Ba84年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba85年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3.3。诱导细胞凋亡gydF4y2Ba

顺铂的细胞毒性效应的形成主要相关intrastrand interstrand DNA交叉连接由[Pt (NH主动亲电子代理gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba]gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},这扭曲的结构,抑制DNA复制和转录,最终引发细胞凋亡。半胱氨酰的天冬氨酸特异性蛋白酶(半胱天冬酶)级联激活细胞凋亡诱导期间(gydF4y2Ba86年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba87年gydF4y2Ba]。因此,活动还存在3/7的调查后24 h CT A2780细胞10gydF4y2BaμgydF4y2Ba顺铂或浓度gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。半胱天冬酶的增加3/7活动遵循了同样的趋势,Pt积累和DNA platination(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),这表明gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba采用类似的能损伤dna的机制及其代谢物顺铂,最终使细胞凋亡。gydF4y2Ba

3.4。试图阐明吸收机制gydF4y2Ba

已经报告的介绍,与合理的亲油性分子通常容易跨越脂质双分子层膜通过简单暧被动扩散。另外,膜转运蛋白和膜通道蛋白可以支持药物的内化剥夺的理化性质前面所提到的,允许高效的细胞吸收(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。共存的两个药物吸收机制强调在几个评论(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。背后的原因异常细胞的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba仍然是一个令人费解的问题。然而,到目前为止的结果指向一个活跃的参与/促进运输补充/替代被动扩散。阐明这一观点,分析细胞积累在低温或一组抑制剂的存在任何可能的吸收机制是尝试。gydF4y2Ba

Carrier-mediated运输,是否积极促进,通过减少温度的强烈影响。因此,细胞的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与顺铂gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba4 h后分析了CT在低温条件下(4°C)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),相比之下,在37°C。正如所料,基于“增大化现实”技术对所有化合物,但在更大程度上减少顺铂,尤其是gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。事实上,AR 37°C之间的比率和AR 4°C是3.2和3.6gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba但对顺铂,特别是增加巨大的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,这表明主动/促进运输大大有助于整体后两种配合物的吸收。gydF4y2Ba

依赖资源运输由减少抑制ATP的水平可以通过预处理与2-deoxyglucose (2 dg)和南gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba。限制的毒性预处理可能会影响细胞的生存能力进行调查,一组进行了初步实验发现抑制剂的最佳浓度和预处理的时间保存细胞粘附的能力,即使在低水平的ATP水平(数据未显示)。的南gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba/ 2 dg预处理采用统计(见材料与方法)降低了细胞的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),没有明显的影响gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

因为细胞的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba是依赖资源,内吞作用(即。,engulfment of the plasma membrane to trap extracellular substances in the vesicles) was first considered, although2gydF4y2Ba是一个低gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba分子。由于内吞作用是由于肌动蛋白微丝骨架的ATP-dependent聚合,它可以抑制细胞松弛素D (CTD) [gydF4y2Ba88年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba89年gydF4y2Ba]。这抑制剂没有造成任何Pt积累减少gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。也是同样的情况gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(数据没有显示)。类似的消极反应以前发现的大monochalcoplatin分子(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)利用渥曼青霉素抑制剂的内吞作用和微胞饮现象gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。这些数据表明,异常高的细胞积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba基于carrier-mediated运输。gydF4y2Ba

根据其方向(或对电化学梯度),carrier-mediated运输可以被动或主动,与后者运输依赖ATP或离子梯度。著名的载体:既是谷氨酰胺转运体ASCT2 (SLC1A5),这对Na交流细胞外谷氨酸盐gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,可以抑制O-benzylserine (BS) [gydF4y2Ba90年gydF4y2Ba]。另外,乌本苷(OUA)降低了NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba梯度通过抑制NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶。这两种抑制剂对细胞没有造成重大影响的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),因此不包括Na的直接参与gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba梯度。gydF4y2Ba

剩下几个候选人这样的运输,10月似乎可能从文学的基础上的数据(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba91年gydF4y2Ba]。10月调解有机阳离子的电致和sodium-independent易位跨膜在任何方向,电化学梯度的驱动力和inside-negative膜电位(gydF4y2Ba92年gydF4y2Ba]。因此,他们的活动没有直接依赖ATP但代谢抑制发生时可以明显减少(gydF4y2Ba93年gydF4y2Ba]。10月承认亲水性基质如四乙铵(茶),原型小有机阳离子,在更大程度上,笨重的分子,如神经毒素1-methyl-4-phenylpyridin-1-ium (MPPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba受体拮抗剂西咪替丁(CMT) [gydF4y2Ba94年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba95年gydF4y2Ba]。事实上,茶产生了明显下降(尽管统计上不显著)的吸收gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,而边际产量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在更大程度上CMT抑制细胞的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。这些数据显示,10月是可能的载体蛋白的吸收gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。相比之下,基于“增大化现实”技术的价值观gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba没有显著受到这种10月抑制剂的存在(见图S10,补充材料,吸收的比较gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba在最有效的抑制剂,CMT)。gydF4y2Ba

到目前为止,很少有10月基质结构活性关系可用;这些基质通常包含一个疏水作用域结合得站点(gydF4y2Ba96年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba97年gydF4y2Ba]。的一些例子关于Pt (IV)高活性化合物,可以观察到10月调解包含有机复合物的吸收部分作为一个赤道nonleaving组(即。,cyclohexane-1,2-diamine in ormaplatin and the cyclohexylamine in satraplatin) in combination with a hydrolyzable site (the chlorido equatorial leaving ligands of both complexes) able to generate a transient positive charge by aquation. Because of the high positive charge of Pt(IV), the final products of hydrolysis are inevitably the mono- and eventually the dihydroxido species. Indeed, Kastner et al. aged seven diacetato Pt(IV) complexes at 37°C for 24 h in phosphate buffer at different pH values. On this timescale of the experiment, most of the satraplatin and oxaliplatin-based complexes studied were hydrolyzed, with the formation of mono and di-hydroxido species. On the contrary, the cisplatin and carboplatin derivatives remained almost unchanged [98年gydF4y2Ba]。有趣的是,越来越多gydF4y2BaσgydF4y2Ba捐赠者的能力赤道nonleaving N-ligands (NH)gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba< NHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaR < NHRgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba氯化物改善这种水解(gydF4y2Ba98年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

解决方案的行为gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba研究了老化72 h的化合物在黑暗中相同的细胞培养基用于A2780细胞系(即。,RPMI 1640中添加10%胎牛血清),监测高效液相色谱峰面积。在这种情况下,gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(> 95%的原始高效液相色谱峰)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(> 85%的原始高效液相色谱峰)仍然几乎完好无损(参见图S11,补充材料),而gydF4y2Ba2gydF4y2Ba进行了部分水解(大约40%,参见图S12,补充材料)。gydF4y2Ba

MS谱与新的高效液相色谱峰gydF4y2Ba2gydF4y2Ba对应的质子化了的竞购(NH)gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(哦)(哦gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)(阿gydF4y2Ba_2gydF4y2BaCMe))gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba离子,说明成功的水合作用赤道氯的不对称的复杂(见图S12,补充材料)。类似的行为,即使在小程度上观察到的复杂gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。该水解生成(尽管部分和暂时性的)阳离子复杂,可能是10月的一个合适的衬底。鉴于RPMI 1640年完成介质的各种成分(氨基酸、蛋白质、无机盐、维生素等),很难提出的促进剂的水解gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(gydF4y2Ba99年gydF4y2Ba]。此外,的边后卫包含酯酶(gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba102年gydF4y2Ba),尤其是羧酸酯酶,可能能够促进羧基的水解,即。,轴向acetato配体/ s Pt (IV)中心gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。这将涉及到正式替换CHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba首席运营官gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba集团有何gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba组,从而把gydF4y2Ba3gydF4y2Ba成gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba成gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。高效液相色谱法简介(配合物的保留时间gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba及其水解物种是不同的)结合质谱没有显示在实验条件下这种行为的证据使用。跟踪物种可能由峰值对应的背景介质。gydF4y2Ba

为了澄清这是否传输机制发挥作用的部分规避阻力所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)的基于“增大化现实”技术的价值gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba顺铂作为参考和评估野生型A2780和其有顺铂耐药性亚系A2780cisR(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。4 h CT与顺铂后,A2780cisR细胞积累低得多的比A2780 Pt,如预期。这种阻力是追溯到Ctr1的低表达,在文献中报道(gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba实验,总结在图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba证实了这一观点。所示相同的行为gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。相反,在这两种细胞系,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示出类似的基于“增大化现实”技术的水平。更有效的被动扩散(通常的原因亲脂性的Pt (IV)高活性化合物,失去生物活性轴向配体,绕过化学抵抗由于减少细胞吸收gydF4y2Ba103年gydF4y2Ba不能调用)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba因为其价值观的日志gydF4y2BakgydF4y2Ba′和日志gydF4y2Ba不是很不同于顺铂,gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

因此,几乎没有改变的原因的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在A2780cisR细胞对野生型可能是同行gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一些运营商的能量依赖性细胞吸收的好处。出于这个原因,OCT1表达,OCT2, OCT3 mRNA在有顺铂耐药性A2780cisR评估和野生型A2780细胞,以及Ctr1,尽管Ctr1以前丢弃的Pt (IV)前体药物载体(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。如图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,OCT1 Ctr1 A2780cisR比A2780和OCT2低,而OCT3显著更高。这个场景不是很不同于发现A2780的表达细胞抵抗了Au-based metal-drug金诺芬(gydF4y2Ba104年gydF4y2Ba]。这种行为表明OCT3在运输的作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在A2780cisR。克服药物抗性只是部分,6的RF值gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而顺铂13。其他机制的多因子的药物抗性现象可以发挥作用,除了不同的吸收效率(gydF4y2Ba105年gydF4y2Ba]。只有高度亲脂性的Pt (IV)高活性化合物,它有一个巨大的细胞摄取高于顺铂,几乎能够完全克服阻力(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

不对称的意外高细胞毒性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(与顺铂)就其对称的同系物gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,拥有类似的结构,减少倾向,亲油性,在人类肿瘤细胞系调查,是由于其特殊的细胞积累。事实上,增加细胞内的积累gydF4y2Ba2gydF4y2Ba相似之处增加DNA platination和诱导细胞凋亡增加。gydF4y2Ba

复杂的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示一个依赖资源吸收机制,额外的/替代所有Pt (IV)的被动扩散典型高活性化合物。虽然细胞吸收的确切机制无法破译的抑制实验,仅10月是可能的运输蛋白(图gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。特别是OCT3似乎最有可能的候选人之间的转运蛋白被认为是在A2780cisR只有一个调节。有趣的是,MCF7细胞,缺乏任何OCT3表达式(gydF4y2Ba106年gydF4y2Ba),显示相同的低灵敏度gydF4y2Ba2gydF4y2Ba如顺铂(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

更好的理解这样的吸收可以实现只采用特定细胞系工程的任何可能的基因的过表达或under-expression载体蛋白。gydF4y2Ba

的确,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并不代表工党的领先候选人(IV)抗癌高活性化合物,数十名亲脂性的和多功能类似物表现出更高的细胞毒性活动(在纳米范围内)gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。然而,其特定的行为提供了一个意想不到的主动运输的例子在Pt (IV)复合物的家庭,一个可能的机制,任何未来的设计中应该考虑的有前途的代理。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

所有数据支持结果都包含在这篇文章,补充材料。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

朱塞佩•Ermondi教授,教授会Caron Maura Vallaro博士(CASSMedChem、都灵大学、意大利)感激地承认我色谱测量和计算的极地表面区域。作者感谢埃琳娜博士Perin icp实验。最后,我们感谢校际联盟的研究金属的化学生物系统(CIRCMSB、巴里、意大利)提供刺激年度会议期间讨论的机会。图gydF4y2Ba10gydF4y2Ba从Servier医学艺术(包含修改后的图片gydF4y2Bahttps://smart.servier.comgydF4y2Ba3.0)由Creative Commons许可归因Unported许可证。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

图S1:素描的复合物在调查之中。数字S2-S3:(gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN] HSQC谱gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 1gydF4y2Ba前后2 h减少细胞胞质。数字S4-S6:(gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN] HSQC谱gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban -gydF4y2Ba前后2 h减少细胞胞质。数字S7-S9:(gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH,gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN] HSQC谱gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban - 3gydF4y2Ba前后2 h减少细胞胞质。图S10:积累比A2780细胞治疗1 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba在没有或西咪替丁的存在。图S11: rp -色谱图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba在完成RPMI 1640 0和72 h后的解决方案。图S12: rp -色谱图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在RPMI 1640 0和72 h后的解决方案,和质谱gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和[gydF4y2Ba2gydF4y2Bacl + HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba