阴离子的生物聚合物Pt (II)阳离子抗增殖复合物

文摘

Phenanthriplatin, (SP4 - 3)-diamminechlorido(菲啶)硝酸铂(II),一个有效的抗肿瘤阳离子Pt (II)复杂,加载在带负电荷的硫酸葡聚糖(DS)作为药物输送模型向量通过静电相互作用。免费的复杂和相应的共轭DS人类肿瘤细胞系测试在两个标准,即116年卵巢癌A2780和结肠癌HCT,几个恶性胸膜间皮瘤细胞系(即上皮BR95、混合/两相的MG06,肉瘤样的MM98,和肉瘤样的有顺铂耐药性MM98R)。的在体外结果表明,共轭释放活性代谢物phenanthriplatin两相的时尚。在这些实验条件,共轭是活性略低于自由phenanthriplatin;但都表现出抗增殖能力高于参考metallodrug顺铂和能够克服顺铂药物抗性获得MM98R细胞。

1。介绍

顺铂及其副产品(卡铂和铂)在癌症化疗占领一个杰出的地位。不幸的是,他们的非特异性针对穷人和交付引起严重的副作用。由于这些原因,最佳的细胞毒性Pt (II)代理是至关重要的扩大他们的治疗指数。

附件的药物高分子载体显著改变产生的轭合物的物理化学性质,血浆半衰期延长,而且,最值得注意的是,利用增强的渗透率和保留(EPR)的效果。这种效果,描述在1980年代由Maeda和同事,依赖于事实,新形成的肿瘤血管组织往往是不完全的。血管内皮细胞在肿瘤增殖迅速,更多的来袭和开放连接比正常血管。此外,缺乏功能淋巴网络阻止有效去除多余的液体从固体肿瘤组织。这两个效应的组合使肿瘤hyperpermeable循环大分子,可渗出液和积聚在肿瘤组织的长期保留(1]。能够利用physiopathologic癌症之间的差异和正常细胞/组织的基础是这样一个策略(药物目标和交付,DTD)。

Pt-based领域的抗肿瘤药物,纳米尺度的运营商在过去的几十年里出现了重要途径减少顺铂的副作用及其同系物,保持完整的癌症死亡的能力。特别是,两N——(2-hydroxypropyl)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物包含cisplatin-like“Pt (NH轭合物₃)₂“或者一个oxaliplatin-like Pt(环己烷-1 r,2 r二胺)”单元(AP5280 AP5346或ProLindac™, resp)进入临床开发(2]。在这种背景下,一些纳米粒子(NPs)携带Pt (II)配合物是值得提及的,因为这些药物候选人目前正在临床试验(Aroplatin™在第二阶段,Lipoplatin™II期和III期,Lipoxal™,和LiPlaCis®在第一阶段)(3]。

过早分离细胞毒性的有效载荷在血液中必须避免的药物应被释放肿瘤细胞的微环境(例如,pH值或氧化还原电位)。在大多数情况下,向量是共价结合的药物通过精心设计的间隔,而且共价相互作用(即。,hydrogen bonding or hydrophobic or ionic interactions) have been employed [4]。这两种方法提供优缺点:共价链接器需要一个准确的设计可分裂的手臂但释放通常是更多的可调;相反,共价相互作用立即操作,但药物可以提前和随机发布了在等离子体离子交换过程。的大小和表面电荷NPs扮演重要的角色在决定流通中的半衰期和biodistribution5,6]。离子配合发表在文学的几个例子。例如,阿霉素,甲氨蝶呤、紫杉醇、5 -氟尿嘧啶、喜树碱已经加载到胶束通过离子和疏水相互作用[7)或树枝状分子通过共价的圈套(5]。

寻求指控Pt (II)离子与适当的互动互补携带药物测试,一个人必须意识到,在铂(II) amminechlorido衍生品、卸货顺铂,原则上,最活跃的抗肿瘤剂,根据SAR规则,定义为清除和Hoeschele [8- - - - - -10]。

轭合物组成的沉降(PMMA)核壳NPs轴承阳离子(-)或阴离子(-)武器作为[竞购的向量₃(NH₃)]⁻和[竞购(NH₃)₃]⁺分别为我们(11,12]。在前者情况下,在活的有机体内抗肿瘤效应的共轭高于顺铂抑制B16转椅小鼠肿瘤的生长,尽管自由阴离子药物显示出温和抗增殖活动本身,如预期。

最近,Lippard等人证明了单功能铂(II)配合物的一般公式独联体——[Pt (Am) Cl (NH₃)₂]⁺(我=吡啶,1喹啉,2菲啶,3)(图1)显示显著的抗肿瘤特性。他们的细胞反应是不同于经典cisplatin-like中性药物,因为它们与DNA结合在鸟嘌呤的N7位置monodentate时尚残留同时插入DNA螺旋。由此产生的加合物能够抑制转录,而DNA的低失真明显逃避修复。特别是phenanthriplatin, (SP4 - 3)-diamminechlorido(菲啶)硝酸铂(II),3,表现出更强的活动比批准药物顺铂和铂(13)在一些肿瘤细胞系(13- - - - - -18]。

葡聚糖多糖有一个线性的支柱α(6)有关D-glucopyranosyl残留。葡聚糖作为抗癌药物载体的使用一直以来探索的70年代,在很多情况下,这些配合显示高细胞吸收和良好的活动,结合低毒性(19,20.]。在带电多糖,硫酸葡聚糖,DS,自然产生了几个细菌或化学与氯磺酸右旋糖酐的反应,是很出名的抗病毒和抗凝属性。然而,使用的担忧DS已报告,因为它可能会导致过敏反应的反应和肠胃疾病(21]。

500 kDaDS被选为一个概念证明这样的带负电荷的大分子适合DTD阳离子Pt复合物1- - - - - -3,因为它已被报道DS(特别是在高)的循环时间延长相应的配合。此外,DS轭合物的抗癌药物阿霉素(阿霉素)降低其从22 (P-gp),在耐多药细胞过表达,3,有一个大的杂环配体,可以P-gp射流驱动的基质,与顺铂(22]。

离子之间的相互作用1- - - - - -3和DS(图1)在这里讨论,其中的目标定义附加的更好的实验条件和阳离子药物的释放和阴离子聚合物,分别。的在体外抗增殖活动最有前途的共轭,即三维,一直在评估人类肿瘤细胞系。任何EPR效应(相关的可能的DTD策略)将只能通过进一步明显可观在活的有机体内实验。

2。材料和方法

2.1。一般考虑

所有的化学物质(从Sigma-Aldrich和阿尔法Aesar-Johnson Matthey有限公司另有指示除外),包括硫酸葡聚糖(DS钠盐,明串珠菌属仕达屋优先计划。;平均> 500000),使用前未经纯化。化合物1- - - - - -3准备按照发布程序(13)和他们的纯度是评估常用的分析技术(HPLC-MS元素分析,多核的核磁共振,等等)。用连字符连接的动态光散射(DLS)以一个固定的角度(173°)潜在的实验进行了一式三份水解决方案在298 K,通过使用一个Zetasizer NanoZS(英国莫尔文)操作在一个粒子大小范围从0.6 nm 6μm和装备由氦氖激光器(λ= 633海里)。

2.2。合成的Pt -DS轭合物

复合物的轭合物1- - - - - -3由混合0.6毫升的水母液的DS(10毫克毫升⁻¹)与不同数量的水溶液的Pt复合物(从约。3 - 30毫升,取决于所需的Pt / S比值)。这个过程被选为限制轭合物的聚合。15分钟后搅拌,混合透析对水(膜截止= 14 kDa) 24小时,而外部解决方案是刚更新好几次了。工党加载到DS确定溶解2毫克的轭合物0.8毫升的70% w / w硝酸,用近2 h 60°C,和稀释1.0% w / v HNO₃确定硫和铂内容通过电感耦合plasma-optical发射光谱学(ICP-OES)。斯派克创世纪ICP-OES光谱仪(德国斯派克分析仪器,Kleve)配备了横流式的使用喷雾器。为了量化Pt和S浓度,299.797和180.731纳米线被选中。L 1000毫克的标准股票的解决方案⁻¹被稀释1.0% w / v硝酸准备校准标准这两个元素。

2.3。Pt释放三维

phenanthriplatin——的稳定性DS轭合物(3- - - - - -DS)和相应的Pt释放被溶解在验证25°C 0.5 x, x 1,或2 x磷酸缓冲盐,PBS (1 x PBS = Na₂HPO₄8.1毫米;KH₂阿宝₄1.76毫米;氯化钠,137毫米;氯化钾2.7毫米),透析袋(膜截止= 14 kDa)。工党在外部缓冲溶液是通过紫外可见光谱监测(为3= 251海里,ε= 34433±87米⁻¹厘米⁻¹)。记录与紫外可见光谱JASCO V550分光光度计。

2.4。细胞培养和生长抑制(IC₅₀)

顺铂、自由3,和三维测试在卵巢癌细胞株A2780和结肠癌细胞系HCT 116(英国欧洲收集细胞培养)。此外,上述药物候选人进行测试也在三个主要的恶性胸膜间皮瘤癌症细胞系,来自胸腔积液患者的组织学证实间皮瘤(即。、BR95上皮MM98肉瘤样的,并在有顺铂耐药性MG06混合/ biphasic-phenotype)和细胞系MM98R [23- - - - - -25]。以下媒体被用来文化细胞:RPMI 1640 (A2780细胞),本人5 (HCT 116个细胞),火腿的F10 (GIBCO英杰公司生命科学,圣朱利亚诺·米兰,意大利,BR95和MG06),和杜尔贝科修改鹰的介质(MM98和MM98R)。在所有情况下,媒体被补充谷酰胺(2毫米),青霉素100 IU毫升⁻¹链霉素(100 mg L⁻¹),10%胎牛血清的边后卫。母亲顺铂和复杂的解决方案3通过溶解的化合物在w / v 0.9%氯化钠水溶液带pH值3盐酸浓度(最终股票1毫米)。透析的解决方案三维作为一个股票的解决方案。三个解决方案是在完全培养基稀释所需浓度范围和细胞被挑战37°C公司5%₂调湿室下的化合物研究(72 h,连续治疗)。一个标准的测试(即细胞生存能力。,the resazurin reduction assay) was used to assess the growth inhibition of the compounds [26]。协议的细节已报告在其他地方(27]。

2.5。细胞积累

根据已经发表的细胞积累实验过程(28]。简而言之,A2780细胞治疗10μ化合物的浓度/配方在调查10毫米培养皿或175厘米²烧瓶。4 h后,细胞被洗PBS,脱离培养皿用0.05%胰蛋白酶1 x + 2% EDTA (HyClone,热Fisher),并转移到玻璃管。离心和谨慎的上层清液给细胞颗粒被储存在−20°C到矿化。解冻后,细胞治疗HNO为70%₃(1 h在超声波浴60°C)和酸浓度稀释到最后1%。Pt内容是衡量电感耦合等离子体质谱法(icp,热Optek X系列2)。Pt的浓度在细胞治疗规范化后的细胞数量和细胞体积,为了获得胞内Pt浓度。内部之间的比例和细胞外(培养基)Pt浓度累积率定义,基于“增大化现实”技术(29日]。

3所示。结果与讨论

3.1。合成的Pt -DS配合、Pt加载和Pt -DS大小

复合物1- - - - - -3根据文献合成过程。简而言之,在顺铂与硝酸银反应在DMF,由此产生的独联体——[竞购(NH₃)₂没有₃)中间反应与相应的杂环配体给最终产品。的身份和纯度复合物是由元素分析、检查HPLC-MS,和多核的核磁共振在协议与以前公布的数据13]。

Pt -DS轭合物的复合物1- - - - - -3是由每一个复杂的解决方案添加到水溶液中500 kDa的商业DS。重要的是,工党浓度不应超过1毫米在最终的解决方案中,为了防止快速和大规模的聚合。搅拌15分钟后,解决方案是透析对水24小时。由此产生的最终解决方案可以被用作或冻干获得干粉末。各种各样的Pt -DS样本合成和根据他们的不同特点Pt /硫酸(评为Pt / S)比电感耦合plasma-optical发射光谱学(ICP-OES)(图2)。

之间的相互作用DS与1和2很相似,只有少量(max。10%)的Pt复杂注定承运人即使Pt添加在1:1克分子比硫酸组中DS。相反,理论和实验之间的线性关系Pt / S比值是观察到的笨重复杂3Pt加载,达到50%。这是在与离子相互作用的发生,由于电荷密度的顺序1>2>3。这些特性似乎指出额外部队参与共轭的形成。同意报告阿霉素- - - - - -DS轭合物(30.),除了静电相互作用,π- - - - - -π药物和之间的叠加DS,加上一些额外的氢键,也可能发生进一步的评论(见下文)。特别是,π- - - - - -π堆积在的情况下可以更明显3关于其他复合物,证明其较高的加载。

自3加载显示高于其他人,此外,它是最这个类的细胞毒性剂的阳离子复合物(13),下面的研究重点3只有。

在这种情况下,包含Pt / S的共轭终摩尔比%,以后三维,显示出优良的水溶性,在(0.76毫克3每毫克的本地DS)。

为了验证上述共轭的大小,新鲜透析液和样品,分析了冻干法和水再溶解后,获得了动态光散射(DLS)。冻干样本显示一套多通道尺寸分布与主要有平均直径约1280海里。因此,样品的冻干青睐的形成更大的聚集,因此,这个过程被丢弃。

相反,新鲜透析方案表现出粒子的平均直径约120海里(DS就在这样的实验条件显示平均直径约250海里)。共轭的事实三维有尺寸小一点的比DS可以归结于非凡的之间的相互作用3和DS,这导致共轭更紧凑的安排。

新透析方案包含这样的共轭,以后命名三维用于生物测试。显著地,NPs直径从50到150 nm理想地适合利用EPR效应(31日]。

DLS测量,执行期间14天之后在水中合成(总释放的时间间隔3从三维;见下文),表明纳米粒子大小保持在作证的稳定性好3- - - - - -DS。用连字符连接潜在的测量表明,两者兼而有之DS和3- - - - - -DS展览负值(−−40范围50 mV)由于剩下的自由硫酸组,从而解释了悬架由于颗粒间的斥力的稳定力量。

3.2。Pt释放三维

稳定pseudobiological调查共轭条件是一个重要的特性。因此,的行为三维研究了25°C作为时间的函数在磷酸缓冲盐(PBS)在不同离子的优势,从不同的母亲PBS稀释获得解决方案(图3)。免费的浓度3在其发布解决方案之后,紫外可见光谱法:直接与介质的离子强度有关。

PBS浓度,对应的曲线达到一种高原后10 - 15 h与残余荷载不同,每一个对应于约为50%,40%,和30%的药物释放。然后,释放3从三维顺利继续,几乎是在两周内完成。

观察到的行为是类似报道阿霉素- - - - - -DS共轭,带负电荷之间的静电相互作用DS和带正电的阿霉素强烈salt-dependent。在实际情况下,介质的离子强度增加,阳离子(Na⁺和K⁺)和阴离子(和),在PBS缓冲,争夺与负静电相互作用(DS和积极3分别)指控物种。额外的力量比离子相互作用应该负责其余的缓慢释放3,观察到的在较长时间范围内。有可能的是,这些交互组成π- - - - - -π叠加aromatic-structured相邻分子之间3在短的距离,迫使他们最初的积累DS转动的静电相互作用。此外,氢键相互作用,包括h组的硫酸氨配体和组织,可能也是一个重要的角色,在时尚与氨配体和磷酸基之间发现cisplatin-DNA加合物(32]。

类似的场景,与多个交互部队的存在,确实是观察DOX-DS(30.]。

3.3。抗增殖活性和细胞积累

复杂的3和它的共轭三维(新鲜透析)测试两个细胞系来源于共同的人类肿瘤(即卵巢癌A2780和结肠癌HCT 116癌)和对人类恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞系(即类上皮BR95,混合MG06,肉瘤样的MM98,和肉瘤样的有顺铂耐药性MM98R)。MPM是一种很难治疗的肿瘤:当前标准的一线化疗食品和药物管理局(FDA)批准的由顺铂结合antifolate培美曲塞(33]。新药和量身定制的治疗非常必要的改善MPM病人的结果。研究化合物的结果被发表在表1。正如所料,上最好的结果观察cisplatin-sensitive A2780细胞。好的能力绕过顺铂耐药性MM98R细胞系(RF)的3是由共轭维护吗3- - - - - -DS。一般来说,都比参考顺铂更活跃,但免费的3稍微活跃吗3- - - - - -DS。观察到的差异的自由和共轭形式3有关在第一时间的不完整的版本吗3从3- - - - - -DS共轭时间间隔内的可行性测试。此外,细胞Pt积累的两种形式3必须考虑(表吗1)。事实上,一个关键的参数在理解药物的作用机制是评价其细胞内的积累,这是最后的平衡细胞流入和流出34]。这个参数表示为累积率(AR),胞内Pt浓度之间的比例和细胞外(培养基)Pt浓度在给定的时间(35]。的基于“增大化现实”技术的值3,三维,与顺铂作为参考测量metallodrug A2780细胞(表4 h后连续治疗1)。

的三维共轭显示细胞内积累Pt略低于自由3比顺铂,虽然都是更有效地内化。作为一个经验法则,带正电的NPs显示更高的吸收比负电荷通过内吞作用通路(36- - - - - -38),不幸的是,三维共轭整体负面的的潜力。相比之下,阳离子聚合物阴离子(竞购₃(NH₃)]⁻复杂的表现出非凡的细胞吸收,通过高效的内吞作用的共轭由于其残余正电荷(11]。

4所示。结论

在这部作品中,活性阳离子Pt (II)配合物[Pt (Am) Cl (NH)₃)₂]⁺(我=吡啶,1喹啉,2菲啶,3)被允许与阴离子高分子载体反应,即硫酸葡聚糖DS,形成配合主要通过静电相互作用。

复杂的3系列的显示加载效率越高,和它的共轭三维释放大量活性物种的一部分3在第一个10 - 15 h取决于介质的离子强度。但是,一小部分3仍然紧密地绑定到DS指出不同的交互部队,可能π- - - - - -π叠加aromatic-structured相邻分子之间3重叠的静电吸引。

免费的3和共轭三维显示在所有肿瘤细胞系IC₅₀(即值低。,higher antiproliferative activity) than those of the reference metallodrug cisplatin and, importantly, were able to bypass acquired cisplatin resistance on MM98R cells.

轻微的降低在体外抗增殖活性的共轭三维对自由3由于不完整的版本吗3从三维时间间隔内的可行性测试和较低的细胞积累三维。

进一步在活的有机体内测试将是必要的为了欣赏任何EPR效果三维。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究支持的银行的di San Paolo双翼飞机研究项目”。”作者感谢校际联盟的研究在金属的化学生物系统(CIRCMSB、巴里)和成本CM1105行动”功能金属配合物与生物分子结合,“提供机会刺激讨论年会期间和短期任务。

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